Děkujeme za návštěvu webu nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat nejnovější verzi prohlížeče (nebo vypnout režim kompatibility v prohlížeči Internet Explorer). Abychom zajistili trvalou podporu, tento web nebude obsahovat styly ani JavaScript.
Melamin je známý kontaminant potravin, který se může vyskytovat v určitých kategoriích potravin jak náhodně, tak úmyslně. Cílem této studie bylo ověřit detekci a kvantifikaci melaminu v kojenecké výživě a sušeném mléce. Bylo analyzováno celkem 40 komerčně dostupných vzorků potravin, včetně kojenecké výživy a sušeného mléka, z různých oblastí Íránu. Přibližný obsah melaminu ve vzorcích byl stanoven pomocí systému vysokoúčinné kapalinové chromatografie s ultrafialovým zářením (HPLC-UV). Pro detekci melaminu v rozmezí 0,1–1,2 μg mL−1 byla sestrojena kalibrační křivka (R2 = 0,9925). Melamin byl testován v kojenecké výživě a sušeném mléce a výsledky ukázaly, že hladiny melaminu ve vzorcích kojenecké výživy a sušeného mléka byly 0,001–0,095 mg kg−1 a 0,001–0,004 mg kg−1. Tyto hodnoty jsou v souladu s legislativou EU a Codex Alimentarius. Je důležité poznamenat, že konzumace těchto mléčných výrobků se sníženým obsahem melaminu nepředstavuje významné riziko pro zdraví spotřebitelů. To potvrzují i ​​výsledky posouzení rizik.
Melamin je organická sloučenina s molekulárním vzorcem C3H6N6, odvozená od kyanamidu. Má velmi nízkou rozpustnost ve vodě a obsahuje přibližně 66 % dusíku. Melamin je široce používaná průmyslová sloučenina s širokým spektrem legitimního využití při výrobě plastů, hnojiv a zařízení na zpracování potravin (včetně obalů na potraviny a kuchyňského nádobí)1,2. Melamin se také používá jako nosič léčiv pro léčbu nemocí. Vysoký podíl dusíku v melaminu může vést ke zneužití této sloučeniny a k tomu, že se složkám potravin dodají vlastnosti proteinových molekul3,4. Přidávání melaminu do potravinářských výrobků, včetně mléčných výrobků, proto zvyšuje obsah dusíku. Proto se mylně usuzovalo, že obsah bílkovin v mléce je vyšší, než ve skutečnosti byl.
S každým přidaným gramem melaminu se obsah bílkovin v potravinách zvýší o 0,4 %. Melamin je však vysoce rozpustný ve vodě a může způsobit vážnější poškození. Přidání 1,3 gramu melaminu do tekutých produktů, jako je mléko, může zvýšit obsah bílkovin v mléce o 30 %5,6. Přestože se melamin přidává do živočišných a dokonce i lidských potravin za účelem zvýšení obsahu bílkovin7, Komise pro Codex Alimentarius (CAC) a národní orgány melamin neschválily jako potravinářskou přídatnou látku a zařadily jej mezi nebezpečné látky při požití, vdechnutí nebo vstřebání kůží. V roce 2012 Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny Světové zdravotnické organizace (WHO) zařadila melamin mezi karcinogeny třídy 2B, protože může být škodlivý pro lidské zdraví8. Dlouhodobá expozice melaminu může způsobit rakovinu nebo poškození ledvin2. Melamin v potravinách může komplexovat s kyselinou kyanurovou za vzniku ve vodě nerozpustných žlutých krystalů, které mohou způsobit poškození tkáně ledvin a močového měchýře, stejně jako rakovinu močových cest a úbytek hmotnosti9,10. Může způsobit akutní otravu jídlem a ve vysokých koncentracích i smrt, zejména u kojenců a malých dětí.11 Světová zdravotnická organizace (WHO) také stanovila tolerovatelný denní příjem (TDI) melaminu pro člověka na 0,2 mg/kg tělesné hmotnosti denně na základě pokynů CAC.12 Americký Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (US FDA) stanovil maximální limit reziduí melaminu na 1 mg/kg v kojenecké výživě a 2,5 mg/kg v ostatních potravinách.2,7 V září 2008 bylo oznámeno, že několik domácích výrobců kojenecké výživy přidalo melamin do sušeného mléka, aby zvýšilo obsah bílkovin ve svých výrobcích, což vedlo k otravě sušeným mlékem a spustilo celostátní incident otravy melaminem, který onemocněl více než 294 000 dětí a hospitalizoval více než 50 000.13
Kojení není vždy možné kvůli různým faktorům, jako jsou obtíže městského života, nemoci matky nebo dítěte, což vede k používání kojenecké výživy k výživě kojenců. V důsledku toho byly založeny továrny na výrobu kojenecké výživy, která se svým složením co nejvíce blíží mateřskému mléku14. Kojenecká výživa prodávaná na trhu se obvykle vyrábí z kravského mléka a obvykle se vyrábí ze speciální směsi tuků, bílkovin, sacharidů, vitamínů, minerálů a dalších sloučenin. Aby se směs blížila mateřskému mléku, obsah bílkovin a tuku se liší a v závislosti na druhu mléka je obohacena o sloučeniny, jako jsou vitamíny a minerály, například železo15. Vzhledem k tomu, že kojenci jsou citlivou skupinou a existuje riziko otravy, je bezpečnost konzumace sušeného mléka pro zdraví zásadní. Po případu otravy melaminem u čínských kojenců věnovaly země po celém světě této problematice velkou pozornost a citlivost této oblasti se také zvýšila. Proto je obzvláště důležité posílit kontrolu výroby kojenecké výživy s cílem chránit zdraví kojenců. Existují různé metody pro detekci melaminu v potravinách, včetně vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), elektroforézy, senzorické metody, spektrofotometrie a enzymově vázaného imunosorbentního testu antigen-protilátka16. V roce 2007 americký Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) vyvinul a publikoval metodu HPLC pro stanovení melaminu a kyseliny kyanurové v potravinách, která je nejúčinnější metodou pro stanovení obsahu melaminu17.
Koncentrace melaminu v kojenecké výživě měřené pomocí nové techniky infračervené spektroskopie se pohybovaly v rozmezí od 0,33 do 0,96 miligramů na kilogram (mg kg-1).18 Studie provedená na Srí Lance zjistila, že hladiny melaminu v sušeném plnotučném mléce se pohybovaly v rozmezí od 0,39 do 0,84 mg kg-1. Kromě toho dovážené vzorky kojenecké výživy obsahovaly nejvyšší hladiny melaminu, a to 0,96 a 0,94 mg/kg. Tyto hladiny jsou pod regulačním limitem (1 mg/kg), ale pro bezpečnost spotřebitelů je zapotřebí monitorovací program.19
Několik studií zkoumalo hladiny melaminu v íránských kojeneckých výživách. Přibližně 65 % vzorků obsahovalo melamin, s průměrem 0,73 mg/kg a maximem 3,63 mg/kg. Jiná studie uvádí, že hladina melaminu v kojenecké výživě se pohybovala od 0,35 do 3,40 μg/kg s průměrem 1,38 μg/kg. Celkově byla přítomnost a hladina melaminu v íránských kojeneckých výživách hodnocena v různých studiích, přičemž některé vzorky obsahující melamin překračovaly maximální limit stanovený regulačními orgány (2,5 mg/kg/krmivo).
Vzhledem k obrovské přímé i nepřímé spotřebě sušeného mléka v potravinářském průmyslu a zvláštnímu významu kojenecké výživy pro výživu dětí si tato studie kladla za cíl ověřit metodu detekce melaminu v sušeném mléce a kojenecké výživě. Prvním cílem této studie bylo vyvinout rychlou, jednoduchou a přesnou kvantitativní metodu pro detekci falšování melaminem v kojenecké výživě a sušeném mléce pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) a ultrafialové (UV) detekce. Za druhé, cílem této studie bylo stanovit obsah melaminu v kojenecké výživě a sušeném mléce prodávaném na íránském trhu.
Přístroje používané pro analýzu melaminu se liší v závislosti na místě výroby potravin. Pro měření reziduí melaminu v mléce a kojenecké výživě byla použita citlivá a spolehlivá metoda HPLC-UV analýzy. Mléčné výrobky obsahují různé bílkoviny a tuky, které mohou interferovat s měřením melaminu. Proto, jak poznamenali Sun a kol.22, je před instrumentální analýzou nezbytná vhodná a účinná strategie čištění. V této studii jsme použili jednorázové filtry do injekčních stříkaček. V této studii jsme k oddělení melaminu v kojenecké výživě a sušeném mléce použili kolonu C18. Obrázek 1 ukazuje chromatogram pro detekci melaminu. Výtěžnost vzorků obsahujících 0,1–1,2 mg/kg melaminu se navíc pohybovala v rozmezí od 95 % do 109 %, regresní rovnice byla y = 1,2487x − 0,005 (r = 0,9925) a hodnoty relativní směrodatné odchylky (RSD) se pohybovaly v rozmezí od 0,8 do 2 %. Dostupné údaje naznačují, že metoda je ve studovaném koncentračním rozmezí spolehlivá (tabulka 1). Instrumentální limit detekce (LOD) a limit kvantifikace (LOQ) melaminu byly 1 μg mL−1 a 3 μg mL−1. UV spektrum melaminu navíc vykazovalo absorpční pás při 242 nm. Detekční metoda je citlivá, spolehlivá a přesná. Tuto metodu lze použít pro rutinní stanovení hladiny melaminu.
Podobné výsledky publikovalo několik autorů. Pro analýzu melaminu v mléčných výrobcích byla vyvinuta metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie s fotodiodovým polem (HPLC). Dolní meze kvantifikace byly 340 μg kg−1 pro sušené mléko a 280 μg kg−1 pro kojeneckou výživu při 240 nm. Filazzi a kol. (2012) uvedli, že melamin nebyl v kojenecké výživě pomocí HPLC detekován. Nicméně 8 % vzorků sušeného mléka obsahovalo melamin v množství 0,505–0,86 mg/kg. Tittlemiet a kol.23 provedli podobnou studii a stanovili obsah melaminu v kojenecké výživě (číslo vzorku: 72) pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií/MS (HPLC-MS/MS) na přibližně 0,0431–0,346 mg kg−1. Ve studii provedené Venkatasamy a kol. (2010) byl k odhadu melaminu v kojenecké výživě a mléce použit přístup zelené chemie (bez acetonitrilu) a vysokoúčinná kapalinová chromatografie s reverzní fází (RP-HPLC). Rozsah koncentrací vzorku byl od 1,0 do 80 g/ml a odezva byla lineární (r > 0,999). Metoda vykázala výtěžnost 97,2–101,2 v koncentračním rozsahu 5–40 g/ml a reprodukovatelnost byla menší než 1,0 % relativní směrodatná odchylka. Dále byly pozorované hodnoty LOD a LOQ 0,1 g ml−1 a 0,2 g ml−124. Lutter a kol. (2011) stanovili kontaminaci melaminem v kravském mléce a kojenecké výživě na bázi mléka pomocí HPLC-UV. Koncentrace melaminu se pohybovaly od < 0,2 do 2,52 mg kg−1. Lineární dynamický rozsah metody HPLC-UV byl 0,05 až 2,5 mg kg−1 pro kravské mléko, 0,13 až 6,25 mg kg−1 pro kojeneckou výživu s hmotnostním podílem bílkovin <15 % a 0,25 až 12,5 mg kg−1 pro kojeneckou výživu s hmotnostním podílem bílkovin 15 %. Výsledky LOD (a LOQ) byly 0,03 mg kg−1 (0,09 mg kg−1) pro kravské mléko, 0,06 mg kg−1 (0,18 mg kg−1) pro kojeneckou výživu <15 % bílkovin a 0,12 mg kg−1 (0,36 mg kg−1) pro kojeneckou výživu s 15 % bílkovin, s poměrem signálu k šumu 3 a 1025 pro LOD a LOQ. Diebes a kol. (2012) zkoumali hladiny melaminu ve vzorcích kojenecké výživy a sušeného mléka pomocí HPLC/DMD. V kojenecké výživě byly nejnižší a nejvyšší hladiny 9,49 mg kg−1 a 258 mg kg−1. Mez detekce (LOD) byla 0,05 mg kg−1.
Javaid a kol. uvedli, že zbytky melaminu v kojenecké výživě se nacházely v rozmezí 0,002–2 mg kg−1 pomocí infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací (FT-MIR) (LOD = 1 mg kg−1; LOQ = 3,5 mg kg−1). Rezai a kol.27 navrhli metodu HPLC-DDA (λ = 220 nm) pro odhad melaminu a dosáhli LOQ 0,08 μg mL−1 pro sušené mléko, což bylo méně než úroveň získaná v této studii. Sun a kol. vyvinuli metodu RP-HPLC-DAD pro detekci melaminu v tekutém mléce extrakcí na pevné fázi (SPE). Získali LOD a LOQ 18 a 60 μg kg−128, což je citlivější než současná studie. Montesano a kol. potvrdili účinnost metody HPLC-DMD pro stanovení obsahu melaminu v proteinových doplňcích s limitem kvantifikace 0,05–3 mg/kg, která byla méně citlivá než metoda použitá v této studii29.
Analytické laboratoře nepochybně hrají důležitou roli v ochraně životního prostředí monitorováním znečišťujících látek v různých vzorcích. Použití velkého množství činidel a rozpouštědel během analýzy však může vést ke vzniku nebezpečných reziduí. Proto byla v roce 2000 vyvinuta zelená analytická chemie (GAC), která má snížit nebo eliminovat nepříznivé účinky analytických postupů na obsluhu a životní prostředí26. K identifikaci melaminu se používají tradiční metody detekce melaminu, včetně chromatografie, elektroforézy, kapilární elektroforézy a enzymově vázaného imunosorbentního testu (ELISA). Mezi četnými detekčními metodami však elektrochemické senzory přitahují velkou pozornost díky své vynikající citlivosti, selektivitě, rychlé době analýzy a uživatelsky přívětivým vlastnostem30,31. Zelená nanotechnologie využívá biologické dráhy k syntéze nanomateriálů, což může snížit tvorbu nebezpečného odpadu a spotřebu energie, a tím podpořit zavádění udržitelných postupů. Nanokompozity, například vyrobené z ekologicky šetrných materiálů, lze použít v biosenzorech k detekci látek, jako je melamin32,33,34.
Studie ukazuje, že mikroextrakce na pevné fázi (SPME) se efektivně využívá díky své vyšší energetické účinnosti a udržitelnosti ve srovnání s tradičními extrakčními metodami. Díky své šetrnosti k životnímu prostředí a energetické účinnosti je SPME vynikající alternativou k tradičním extrakčním metodám v analytické chemii a poskytuje udržitelnější a efektivnější metodu přípravy vzorků35.
V roce 2013 Wu a kol. vyvinuli vysoce citlivý a selektivní biosenzor s povrchovou plazmonovou rezonancí (mini-SPR), který využívá vazbu mezi melaminem a protilátkami proti melaminu k rychlé detekci melaminu v kojenecké výživě pomocí imunotestu. Biosenzor SPR v kombinaci s imunotestem (s použitím melaminem konjugovaného bovinního sérového albuminu) je snadno použitelná a nízkonákladová technologie s detekčním limitem pouze 0,02 μg mL-136.
Nasiri a Abbasian použili přenosný senzor s vysokým potenciálem v kombinaci s kompozity oxid grafenu a chitosanu (GOCS) k detekci melaminu v komerčních vzorcích37. Tato metoda vykazovala ultra vysokou selektivitu, přesnost a odezvu. Senzor GOCS prokázal pozoruhodnou citlivost (239,1 μM−1), lineární rozsah 0,01 až 200 μM, afinitní konstantu 1,73 × 104 a LOD až 10 nM. Studie provedená Chandrasekharem a kol. v roce 2024 navíc přijala ekologický a nákladově efektivní přístup. Použili extrakt z papájových slupek jako redukční činidlo k syntéze nanočástic oxidu zinečnatého (ZnO-NP) ekologickou metodou. Následně byla vyvinuta unikátní technika mikro-Ramanovy spektroskopie pro stanovení melaminu v kojenecké výživě. ZnO-NP získané ze zemědělského odpadu prokázaly potenciál jako cenný diagnostický nástroj a spolehlivá, nízkonákladová technologie pro monitorování a detekci melaminu38.
Alizadeh a kol. (2024) použili vysoce citlivou fluorescenční platformu s organokovovou strukturou (MOF) pro stanovení melaminu v sušeném mléce. Lineární rozsah a dolní detekční limit senzoru, stanovené pomocí 3σ/S, byly 40 až 396,45 nM (ekvivalent 25 μg kg−1 až 0,25 mg kg−1) a 40 nM (ekvivalent 25 μg kg−1). Tento rozsah je výrazně pod maximálními limity reziduí (MRL) stanovenými pro identifikaci melaminu v kojenecké výživě (1 mg kg−1) a dalších vzorcích potravin/krmiv (2,5 mg kg−1). Fluorescenční senzor (terbium (Tb)@NH2-MIL-253(Al)MOF) prokázal vyšší přesnost a preciznější měřicí schopnost než HPLC39 při detekci melaminu v sušeném mléce. Biosenzory a nanokompozity v zelené chemii nejen zlepšují detekční schopnosti, ale také minimalizují environmentální rizika v souladu s principy udržitelného rozvoje.
Principy zelené chemie byly aplikovány na různé metody stanovení melaminu. Jedním z přístupů je vývoj metody zelené disperzní mikroextrakce v pevné fázi s využitím přírodního polárního polymeru β-cyklodextrinu zesítěného kyselinou citronovou pro efektivní extrakci melaminu 40 ze vzorků, jako je kojenecká výživa a horká voda. Jiná metoda využívá Mannichovu reakci pro stanovení melaminu ve vzorcích mléka. Tato metoda je levná, šetrná k životnímu prostředí a vysoce přesná s lineárním rozsahem 0,1–2,5 ppm a nízkým detekčním limitem 41. Dále byla vyvinuta cenově efektivní a ekologická metoda pro kvantitativní stanovení melaminu v tekutém mléce a kojenecké výživě s využitím infračervené transmisní spektroskopie s Fourierovou transformací s vysokou přesností a detekčními limity 1 ppm a 3,5 ppm 42. Tyto metody demonstrují aplikaci principů zelené chemie na vývoj účinných a udržitelných metod pro stanovení melaminu.
Několik studií navrhlo inovativní metody pro detekci melaminu, jako je použití extrakce na pevné fázi a vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC)43, stejně jako rychlá vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC), která nevyžaduje složitou předúpravu ani iontově-párová činidla, čímž se snižuje množství chemického odpadu44. Tyto metody nejen poskytují přesné výsledky pro stanovení melaminu v mléčných výrobcích, ale také splňují principy zelené chemie, minimalizují používání nebezpečných chemikálií a snižují celkový dopad analytického procesu na životní prostředí.
Čtyřicet vzorků různých značek bylo testováno v triplikátu a výsledky jsou uvedeny v tabulce 2. Hladiny melaminu ve vzorcích kojenecké výživy a sušeného mléka se pohybovaly v rozmezí od 0,001 do 0,004 mg/kg, respektive od 0,001 do 0,095 mg/kg. Mezi třemi věkovými skupinami kojenecké výživy nebyly pozorovány žádné významné změny. Melamin byl navíc detekován v 80 % sušeného mléka, ale 65 % kojeneckých výživ bylo melaminem kontaminováno.
Obsah melaminu v průmyslovém sušeném mléce byl vyšší než v kojenecké výživě a rozdíl byl statisticky významný (p<0,05) (obrázek 2).
Získané výsledky byly pod limity stanovenými FDA (pod 1 a 2,5 mg/kg). Výsledky jsou navíc v souladu s limity stanovenými CAC (2010) a EU45,46, tj. maximální povolený limit je 1 mg kg-1 pro kojeneckou výživu a 2,5 mg kg-1 pro mléčné výrobky.
Podle studie Ghanatiho a kol. z roku 202347 se obsah melaminu v různých druzích baleného mléka v Íránu pohyboval od 50,7 do 790 μg kg−1. Jejich výsledky byly pod povoleným limitem FDA. Naše výsledky jsou nižší než výsledky Shodera a kol.48 a Rimy a kol.49. Shoder a kol. (2010) zjistili, že hladiny melaminu v sušeném mléce (n=49) stanovené metodou ELISA se pohybovaly od 0,5 do 5,5 mg/kg. Rima a kol. analyzovali zbytky melaminu v sušeném mléce pomocí fluorescenční spektrofotometrie a zjistili, že obsah melaminu v sušeném mléce byl 0,72–5,76 mg/kg. V roce 2011 byla v Kanadě provedena studie za účelem monitorování hladin melaminu v kojenecké výživě (n=94) pomocí kapalinové chromatografie (LC/MS). Bylo zjištěno, že koncentrace melaminu jsou pod přijatelným limitem (předběžný standard: 0,5 mg kg−1). Je nepravděpodobné, že by zjištěné podvodné hladiny melaminu byly taktikou použitou ke zvýšení obsahu bílkovin. Nelze to však vysvětlit použitím hnojiv, přemístěním obsahu nádob nebo podobnými faktory. Kromě toho nebyl zveřejněn zdroj melaminu v sušeném mléce dováženém do Kanady50.
Hassani a kol. měřili v roce 2013 obsah melaminu v sušeném a tekutém mléce na íránském trhu a zjistili podobné výsledky. Výsledky ukázaly, že s výjimkou jedné značky sušeného a tekutého mléka byly všechny ostatní vzorky kontaminovány melaminem, s hladinami v rozmezí od 1,50 do 30,32 μg g−1 v sušeném mléce a od 0,11 do 1,48 μg ml−1 v mléce. Je pozoruhodné, že kyselina kyanurová nebyla v žádném ze vzorků zjištěna, což snižuje pravděpodobnost otravy melaminem u spotřebitelů.51 Předchozí studie hodnotily koncentraci melaminu v čokoládových výrobcích obsahujících sušené mléko. Přibližně 94 % dovezených vzorků a 77 % íránských vzorků obsahovalo melamin. Hladiny melaminu v dovezených vzorcích se pohybovaly v rozmezí od 0,032 do 2,692 mg/kg, zatímco v íránských vzorcích se pohybovaly v rozmezí od 0,013 do 2,600 mg/kg. Celkově byl melamin detekován v 85 % vzorků, ale pouze jedna konkrétní značka měla hladiny nad povoleným limitem.44 Tittlemier a kol. uváděli hladiny melaminu v sušeném mléce v rozmezí od 0,00528 do 0,0122 mg/kg.
Tabulka 3 shrnuje výsledky hodnocení rizik pro tři věkové skupiny. Riziko bylo ve všech věkových skupinách menší než 1. Melamin v kojenecké výživě tedy nepředstavuje žádné nekarcinogenní zdravotní riziko.
Nižší úrovně kontaminace mléčných výrobků mohou být způsobeny neúmyslnou kontaminací během přípravy, zatímco vyšší úrovně mohou být způsobeny úmyslným přidáním látek. Celkové riziko pro lidské zdraví plynoucí z konzumace mléčných výrobků s nízkým obsahem melaminu je navíc považováno za nízké. Lze konstatovat, že konzumace výrobků obsahujících tak nízké hladiny melaminu nepředstavuje žádné riziko pro zdraví spotřebitelů52.
Vzhledem k důležitosti řízení bezpečnosti potravin v mlékárenském průmyslu, zejména z hlediska ochrany veřejného zdraví, je nanejvýš důležité vyvinout a validovat metodu pro hodnocení a porovnávání hladin a reziduí melaminu v sušeném mléce a kojenecké výživě. Pro stanovení melaminu v kojenecké výživě a sušeném mléce byla vyvinuta jednoduchá a přesná HPLC-UV spektrofotometrická metoda. Metoda byla validována, aby byla zajištěna její spolehlivost a přesnost. Detekční a kvantifikační limity metody se ukázaly jako dostatečně citlivé pro měření hladin melaminu v kojenecké výživě a sušeném mléce. Podle našich údajů byl melamin detekován ve většině íránských vzorků. Všechny detekované hladiny melaminu byly pod maximálními povolenými limity stanovenými CAC, což naznačuje, že konzumace těchto druhů mléčných výrobků nepředstavuje riziko pro lidské zdraví.
Všechna použitá chemická činidla byla analytické kvality: melamin (2,4,6-triamino-1,3,5-triazin) čistoty 99 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); acetonitril v čistotě HPLC (Merck, Darmstadt, Německo); ultračistá voda (Millipore, Morfheim, Francie). Jednorázové filtry do injekčních stříkaček (Chromafil Xtra PVDF-45/25, velikost pórů 0,45 μm, průměr membrány 25 mm) (Macherey-Nagel, Düren, Německo).
K přípravě vzorků byla použita ultrazvuková lázeň (Elma, Německo), centrifuga (Beckman Coulter, Krefeld, Německo) a HPLC (KNAUER, Německo).
Byl použit vysoce výkonný kapalinový chromatograf (KNAUER, Německo) vybavený UV detektorem. Podmínky HPLC analýzy byly následující: byl použit systém UHPLC Ultimate vybavený analytickou kolonou ODS-3 C18 (4,6 mm × 250 mm, velikost částic 5 μm) (MZ, Německo). Eluent HPLC (mobilní fáze) byla směs TFA/methanol (450:50 mL) s průtokem 1 mL min-1. Detekční vlnová délka byla 242 nm. Objem nástřiku byl 100 μL, teplota kolony 20 °C. Vzhledem k dlouhé retenční době léčiva (15 minut) by měla být další nástřik proveden po 25 minutách. Melamin byl identifikován porovnáním retenční doby a píku UV spektra melaminových standardů.
Standardní roztok melaminu (10 μg/ml) byl připraven s použitím vody a uložen v chladničce (4 °C) mimo dosah světla. Zásobní roztok byl zředěn mobilní fází a připraveny pracovní standardní roztoky. Každý standardní roztok byl 7krát nastříknut do HPLC. Kalibrační rovnice 10 byla vypočtena regresní analýzou stanovené plochy píku a stanovené koncentrace.
Komerčně dostupné sušené kravské mléko (20 vzorků) a vzorky různých značek kojenecké výživy na bázi kravského mléka (20 vzorků) byly zakoupeny v místních supermarketech a lékárnách v Íránu pro výživu kojenců různých věkových skupin (0–6 měsíců, 6–12 měsíců a >12 měsíců) a skladovány při teplotě chlazení (4 °C) do doby analýzy. Poté bylo zváženo 1 ± 0,01 g homogenizovaného sušeného mléka a smícháno s acetonitrilem:vodou (50:50, obj./obj.; 5 ml). Směs byla míchána 1 minutu, poté sonikována v ultrazvukové lázni po dobu 30 minut a nakonec třepána 1 minutu. Směs byla poté centrifugována při 9000 × g po dobu 10 minut při pokojové teplotě a supernatant byl filtrován do 2ml lahvičky s automatickým vzorkovačem pomocí 0,45 μm stříkačkového filtru. Filtrát (250 μl) byl poté smíchán s vodou (750 μl) a vstříknut do HPLC systému10,42.
Pro validaci metody jsme stanovili výtěžnost, přesnost, mez detekce (LOD), mez kvantifikace (LOQ) a preciznost za optimálních podmínek. LOD byla definována jako obsah vzorku s výškou píku trojnásobkem základní hladiny šumu. Na druhou stranu, obsah vzorku s výškou píku desetinásobkem poměru signálu k šumu byl definován jako LOQ.
Odezva zařízení byla stanovena pomocí kalibrační křivky sestávající ze sedmi datových bodů. Byly použity různé obsahy melaminu (0, 0,2, 0,3, 0,5, 0,8, 1 a 1,2). Byla stanovena linearita postupu výpočtu melaminu. Kromě toho bylo do slepých vzorků přidáno několik různých hladin melaminu. Kalibrační křivka byla sestrojena kontinuálním vstřikováním 0,1–1,2 μg mL−1 standardního roztoku melaminu do vzorků kojenecké výživy a sušeného mléka a její R2 = 0,9925. Přesnost byla posouzena opakovatelností a reprodukovatelností postupu a byla dosažena vstřikováním vzorků v první a tři následující dny (v triplikátu). Opakovatelnost metody byla posouzena výpočtem RSD % pro tři různé koncentrace přidaného melaminu. Pro stanovení přesnosti byly provedeny studie výtěžnosti. Stupeň výtěžnosti extrakční metodou byl vypočítán při třech úrovních koncentrace melaminu (0,1, 1,2, 2) ve vzorcích kojenecké výživy a sušeného mléka9,11,15.
Odhadovaný denní příjem (EDI) byl stanoven pomocí následujícího vzorce: EDI = Ci × Cc/BW.
Kde Ci je průměrný obsah melaminu, Cc je spotřeba mléka a BW je průměrná hmotnost dětí.
Analýza dat byla provedena pomocí SPSS 24. Normalita byla testována Kolmogorovovým-Smirnovovým testem; všechna data byla neparametrická (p = 0). Proto byly k určení statisticky významných rozdílů mezi skupinami použity Kruskalův-Wallisův test a Mann-Whitneyův test.
Ingelfinger, Jr. Melamin a jeho dopad na globální kontaminaci potravin. New England Journal of Medicine 359(26), 2745–2748 (2008).
Lynch, RA a kol. Vliv pH na migraci melaminu v dětských miskách. International Journal of Food Contamination, 2, 1–8 (2015).
Barrett, MP a Gilbert, IH. Cílená aplikace toxických sloučenin do nitra trypanosom. Progress in Parasitology 63, 125–183 (2006).
Nirman, MF a kol. Hodnocení melaminových dendrimerů jako nosičů léčiv in vitro a in vivo. International Journal of Pharmacy, 281(1–2), 129–132(2004).
Světová zdravotnická organizace. Schůze expertů 1–4 k přezkoumání toxikologických aspektů melaminu a kyseliny kyanurové (2008).
Howe, AK-C., Kwan, TH a Lee, PK-T. Toxicita melaminu a ledviny. Journal of the American Society of Nephrology 20(2), 245–250 (2009).
Ozturk, S. a Demir, N. Vývoj nového adsorbentu IMAC pro identifikaci melaminu v mléčných výrobcích pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Journal of Food Synthesis and Analysis 100, 103931 (2021).
Chansuvarn, V., Panic, S. a Imim, A. Jednoduché spektrofotometrické stanovení melaminu v tekutém mléce na základě Mannichovy Greenovy reakce. Spectrochem. Acta Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 113, 154–158 (2013).
Deabes, M. a El-Habib, R. Stanovení melaminu ve vzorcích kojenecké výživy, sušeného mléka a pangasius pomocí HPLC/diodové chromatografie. Journal of Environmental Analytical Toxicology, 2(137), 2161–0525.1000137 (2012).
Skinner, KG, Thomas, JD a Osterloh, JD. Toxicita melaminu. Journal of Medical Toxicology, 6, 50–55 (2010).
Světová zdravotnická organizace (WHO), Toxikologie a zdravotní aspekty melaminu a kyseliny kyanurové: Zpráva ze společného setkání expertů WHO/FAO s podporou Health Canada, Ottawa, Kanada, 1.–4. prosince 2008 (2009).
Korma, SA a kol. Srovnávací studie lipidového složení a kvality práškové kojenecké výživy obsahující nové funkční strukturní lipidy a komerční kojenecké výživy. European Food Research and Technology 246, 2569–2586 (2020).
El-Waseef, M. a Hashem, H. Zvýšení nutriční hodnoty, kvalitativních atributů a trvanlivosti kojenecké výživy s použitím palmového oleje. Middle East Journal of Agricultural Research 6, 274–281 (2017).
Yin, W. a kol. Produkce monoklonálních protilátek proti melaminu a vývoj nepřímé kompetitivní metody ELISA pro detekci melaminu v syrovém mléce, sušeném mléce a krmivech pro zvířata. Journal of Agricultural and Food Chemistry 58(14), 8152–8157 (2010).