Současnost†Aktuální adresa: OX11 0DE, Spojené království, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Spojené království, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Reakční centrum světlosklízejícího komplexu 1 (RC-LH1) je základní fotosyntetickou složkou purpurových fototrofních bakterií. Představili jsme dvě kryoelektronové mikroskopické struktury komplexu RC-LH1 z Rhodopseudomonas palustris. Struktura komplexu RC-LH114-W s rozlišením 2,65 Å se skládá ze 14 podjednotek LH1 smyček obklopujících RC, která je přerušena proteinem W, zatímco komplex bez proteinu W má kompletní RC složení obklopené RC. Uzavřená 16 podjednotek LH1 smyčka. Porovnání těchto struktur poskytuje vhled do dynamiky chinonu v komplexu RC-LH1, včetně dříve neurčených konformačních změn při vazbě chinonu v místě QB RC, stejně jako do umístění pomocných vazebných míst chinonu, která pomáhají jeho přenosu na RC. Unikátní struktura proteinu W zabraňuje uzavření LH1 smyčky, čímž vytváří kanál pro urychlení výměny chinon/chinolon.
Energie poskytovaná fotosyntézou může uživit téměř veškerý život na Zemi a má velký potenciál pro solární biotechnologii. Fialové fototrofní bakterie, které podporují globální fotosyntézu, vykazují také různé energetické režimy a metabolické schopnosti. Mohou se vyhnout fotosyntéze a růst jako heterotrofní bakterie ve tmě, mohou fixovat dusík a oxid uhličitý, produkovat vodík a degradovat aromatické sloučeniny (1-3). Aby bylo možné tyto procesy zásobovat energií, musí být světlo rychle a efektivně přeměněno na chemickou energii. Tento proces začíná, když anténní komplex zachycující světlo absorbuje světlo a přenáší zachycenou energii do reakčního centra (RC), čímž se zahájí separace náboje (4–7). Základní jednotkou fotosyntézy u purpurových fototrofních bakterií je RC typu 2, obklopený komplexem zachycujícím světlo 1 (LH1), který tvoří jádrový komplex RC-LH1. LH1 je tvořen polem zakřivených heterodimerů αβ, z nichž každý váže dvě molekuly bakteriálního chlorofylu (BChl) a jeden nebo dva karotenoidy (8-12). Nejjednodušší anténa LH1 se skládá ze 16 nebo 17 αβ heterodimerů obklopujících RC (9-13) v uzavřené smyčce, ale v jiných jádrových komplexech transmembránové peptidy přerušují kontinuitu okolního LH1, čímž podporují difúzi chinolu/chinonu mezi RC a komplexem cytochromu bc1 (11, 13-15). Fialová fototrofní rostlina Rhodopseudomonas (Rps.) je modelový organismus, který dokáže pochopit přenos energie a elektronů, které podporují fotosyntézu. První krystalová struktura Rps. Modelem komplexu palustris RC-LH1 je RC, obklopený 15 heterodimerními smyčkami LH1, které jsou přerušeny neznámým proteinem zvaným „Protein W“ (14). Protein W byl následně identifikován jako RPA4402, což je necharakterizovaný protein o hmotnosti 10,5 kDa se třemi předpokládanými transmembránovými helixy (TMH) (16). Navrhujeme přejmenovat gen rpa4402 kódující protein W na pufW, aby byl v souladu s nomenklaturou používanou pro geny kódující podjednotky RC-L, M (pufL, pufM) a LH1α, β (pufA, pufB). Je zajímavé, že protein W je přítomen pouze v asi 10 % RC-LH1, což ukazuje, že Rps. palustris produkuje dva různé komplexy RC-LH1. Zde uvádíme kryo-EM (cryo-EM) struktury s vysokým rozlišením dvou základních komplexů, jednoho s proteinem W a 14 αβ heterodimery, druhého bez proteinu W a uzavřenou 16heterodimerní smyčkou LH1. Naše struktura představuje zásadní změnu v chápání komplexu RC-LH1 Rps. palustris, protože jsme analyzovali homogenní populaci každé varianty a máme dostatečné rozlišení k jasnému přiřazení každého peptidu a vázaných pigmentů a souvisejících lipidů a chinonů. Porovnání těchto struktur ukazuje, že tři TMH proteiny-W, které dosud nebyly nalezeny v žádném jiném komplexu RC-LH1, generují chinonový kanál pro urychlení výměny chinon/chinolon. Byla identifikována řada konzervovaných vazebných míst pro lipidy a chinony a odhalili jsme novou konformační změnu po kombinaci chinonu a RC, která může být vhodná pro RC fotosystému II (PSII) okysličených fototrofních organismů. Naše zjištění poskytují nový pohled na kinetiku vazby a výměny chinon/chinolon v jádrovém komplexu RC-LH1 purpurových fototrofních bakterií.
Abychom usnadnili detailní studium dvou komplexů nalezených v Rps. palustris, izolovali jsme každý RC-LH1 biochemickými metodami. Komplex s deficitem proteinu W (dále jen ΔpufW) byl purifikován z kmene, kterému chybí gen pufW (16), a lze produkovat pouze jeden komplex RC-LH1. Komplex obsahující protein W je produkován kmenem. Protein W tohoto kmene je modifikován 10x His značkou na svém C-konci, takže komplex obsahující protein W může být účinně kombinován s většinou chybějícího proteinu W imobilizací kovu. Komplex je účinně oddělen (16) afinitní chromatografií (IMAC).
Jak je znázorněno na obrázku 1, oba komplexy obsahují třípodjednotkový RC (RC-L, RC-M a RC-H) obklopený anténou LH1. Struktura 2,80 Å komplexu bez proteinu W vykazuje 16 heterodimerů αβ, které tvoří uzavřenou smyčku LH1 zcela obklopující RC, dále označovaný jako komplex RC-LH116. Struktura 2,65 Å komplexu obsahujícího protein W má 14-heterodimer LH1 přerušený proteinem W, dále označovaný jako RC-LH114-W.
(A a B) Povrchové znázornění sloučeniny. (C a D) Vázané pigmenty exprimované v tyčinkách. (E a ​​F) Komplexy pozorované z cytoplazmatického povrchu mají peptidy a podjednotky LH1 znázorněné v kreslených obrázcích a jsou číslovány ve směru hodinových ručiček od mezery protein-W [v souladu s číslováním Rba. komplex sphaeroides (13)]. Pro LH1-α je barva proteinové podjednotky žlutá; pro LH1-β je barva proteinové podjednotky modrá; pro protein-W je protein červený; pro RC-H je azurová; pro RC-L je oranžová; pro RC-M je purpurová. Kofaktory jsou znázorněny tyčinkami, zelená představuje molekuly BChl a BPh a, fialová představuje karotenoidy a žlutá představuje molekuly UQ10. (G a H) Zvětšený pohled na mezeru protein-W v ekvivalentní oblasti komplexu RC-LH114-W (G) a komplexu RC-LH116 (H). Kofaktory jsou zobrazeny ve formě vyplňování prostoru, chelátovaný chinon je zobrazen modře. Mezera protein-W je zvýrazněna modrou přerušovanou čarou v (G) a malé otvory, kde chinon/chinolol difunduje na kruhu LH116, jsou zvýrazněny černou přerušovanou čarou v (H).
Obrázek 1 (A a B) ukazuje RC obklopený otevřenými nebo uzavřenými poli heterodimerů LH1αβ, z nichž každý váže dva BChl a jeden karotenoid (obrázek 1, C a D). Předchozí studie ukázaly, že Rps je komplex LH1. V biosyntetické dráze xanthinu spiruliny tyto druhy obsahují smíšené populace karotenoidů (17). Spiropyrroxanthin je však dominantním karotenoidem a jeho hustota je uspokojivá. Proto jsme se rozhodli modelovat spiroxanthin ve všech vazebných místech LH1. Alfa a beta polypeptidy jsou jednotlivé TMH s krátkými vnějšími oblastmi membrány (obrázek 1, A, B, E a F). Ačkoli nebyla pozorována hustota 17 zbytků na C-konci, alfa polypeptid byl v obou komplexech štěpen z Met1 na Ala46. β polypeptid byl v RC-LH116 redukován z Gly4 na Tyr52 a v RC-LH114-W ze Ser5 na Tyr52. Nebyla pozorována žádná hustota 3 nebo 4 N-terminálních nebo 13 C-terminálních zbytků (obrázek S1). Analýza hmotnostní spektrometrie smíšeného komplexu RC-LH1 připraveného z kmene divokého typu ukázala, že chybějící oblast byla výsledkem heterologního štěpení těchto peptidů (obrázek S1 a S2). Byla také pozorována N-terminální formylace α-Met1 (f). Analýza ukázala, že α-peptid se skládá ze zbytků fMet1 až Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 a β-peptid se skládá ze zbytků Ser2 až Ala53, což je v dobré shodě s mapou hustoty nízkoteplotní EM.
Koordinace α-His29 a β-His36 staví BChls do tváře; každý αβ heterodimer se se svými sousedy seskupuje a vytváří otevřenou smyčku (RC-LH114-W) nebo uzavřenou smyčku (RC-LH116) kolem RC pole pigmentů s vazbou excitonů (obrázek 1, C a D). Ve srovnání s pásmem 877 nm RC-LH114-W je absorpční červený posun RC-LH116 při 880 nm 3 nm (obrázek 2A). Spektrum kruhového dichroismu je však téměř stejné (obrázek 2B), což naznačuje, že ačkoli existuje jasný rozdíl mezi otevřenými a uzavřenými smyčkami, lokální prostředí BChls je velmi podobné. Absorpční rudý posun může být výsledkem sníženého tepelného pohybu a zvýšené stability na uzavřené smyčce (18, 19), změny vazby pigmentů způsobené uzavřenou smyčkou (20, 21) nebo kombinace těchto dvou efektů (11).
(A) Absorpční spektrum v ultrafialovém/viditelném/blízkém infračerveném záření, jehož vrcholy jsou označeny odpovídajícími pigmenty a normalizovány na vrchol BPh při 775 nm. (B) Spektrum kruhového dichroismu normalizované na absorbanci BChl při 805 nm. (C a D) Vybraná ΔA spektra z časově rozlišených absorpčních spekter komplexu RC-LH114-W (C) a komplexu RC-LH116 (D). Pro lepší srovnatelnost jsou všechna spektra normalizována na ∆A od −A při 0,2 ps. (E) Rychlost oxidace cytochromu c2 po ozáření v přítomnosti různých koncentrací UQ2 (viz obrázek S8 pro nezpracovaná data). (F) V buňkách pěstovaných za nízké, střední nebo vysoké intenzity světla (10, 30 nebo 300 μMm-2 s-1) podjednotky proteinu W a RC-L v purifikovaném komplexu a poměr oddělených membrán. Stanovte hladinu proteinu pomocí SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy a imunotestu (nezpracovaná data viz obrázek S9). Určete poměr vzhledem k purifikovanému komplexu RC-LH114-W. Stechiometrický poměr RC-L k proteinu-W v komplexu je 1:1.
BChl v poloze 1 v deformované smyčce αβ14 komplexu RC-LH114-W (obrázek 1, A, C a E) jsou o 6,8 Å blíže k primárnímu donoru RC (P) než ekvivalentní BChl v komplexu RC-LH116 (obrázek 1, B, D a F a obrázek S3); kinetika přechodové absorpce obou komplexů však ukazuje, že pro RC-LH114-W a RC-LH116 jsou časové konstanty přenosu excitační energie z LH1 do RC 40 ± 4 a 44 ± 3 ps (obrázek 2). , C a D, obrázek S4 a tabulka S2). V přenosu elektronů v rámci komplexu RC také není žádný významný rozdíl (obrázek S5 a související doplňkový text). Domníváme se, že blízká shoda doby přenosu energie mezi LH1 a RC-P je způsobena podobnou vzdáleností, úhlem a potenciální energií většiny BChl v obou smyčkách LH1. Zdá se, že zkoumání energetického vzoru LH1 k dosažení minimální vzdálenosti není rychlejší než přímý přenos energie ze suboptimálních míst do RC. Otevřená smyčka LH1 v RC-LH114-W může také podléhat nevýznamnému tepelnému pohybu za nízkých teplot pro strukturní analýzu a při pokojové teplotě existuje delší konformace kruhu αβ14 od pigmentační vzdálenosti βBChls v pozici RC1.
Komplex RC-LH116 obsahuje 32 BChl a 16 karotenoidů a jeho celkové uspořádání je stejné jako u Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), kmene Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) a zelených řas (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Po zarovnání byly pozorovány pouze malé odchylky v polohách heterodimerů αβ, zejména 1-5, 15 a 16 (obrázek S6). Přítomnost proteinu-W má významný vliv na strukturu LH1. Jeho tři TMH jsou spojeny krátkými smyčkami, přičemž N-terminál je na lumenové straně komplexu a C-terminál je na cytoplazmatické straně (obrázky 1A a 3, A až D). Protein-W je převážně hydrofobní (obrázek 3B) a TMH2 a TMH3 interagují s LH1αβ-14 za vzniku transmembránového povrchu (obrázek 3, B a E až G). Rozhraní se v transmembránové oblasti skládá převážně ze zbytků Phe, Leu a Val. Tyto zbytky jsou navzájem propojeny s hydrofobními aminokyselinami a pigmenty αβ-14. K interakci přispívají i některé polární zbytky, včetně vodíkové vazby mezi W-Thr68 a β-Trp42 na povrchu komplexní dutiny (obrázek 3, F a G). Na povrchu cytoplazmy sousedí Gln34 s keto skupinou karotenoidů αβ-14. Kromě toho byla molekula n-dodecyl β-d-maltosidu (β-DDM) rozštěpena a její hydrofobní konec se rozšířil k rozhraní mezi proteinem-W a αβ-14, přičemž lipidový konec se může nacházet v těle. Také jsme si všimli, že C-terminální oblasti rozlišení proteinu W a RCH jsou si velmi blízké, ale ne v rozsahu, který by jim bránil v vzniku specifických interakcí (obrázek 1, A a E). Mohou však existovat interakce v nerozlišených C-terminálních aminokyselinách těchto dvou proteinů, což by mohlo poskytnout mechanismus pro nábor proteinu W během sestavování komplexu RC-LH114-W.
(A) Protein-W, který je v kresleném znázornění obrácen k rozhraní s LH1αβ14, má tyčinkovitý postranní řetězec (červeně), zobrazený v části diagramu elektrostatického potenciálu (průhledný šedý povrch s úrovní kontury 0,13). (B) Protein-W znázorněný hydrofobním barevným povrchem. Polární a nabité oblasti jsou zobrazeny azurově, hydrofobní oblasti bíle a silně hydrofobní oblasti oranžově. (C a D) Protein-W znázorněný v kresleném znázornění, jeho orientace je stejná jako v (A) (C) a otočený o 180° (D). Podle polohy v sekvenci zaujímají rozlišitelné zbytky duhové barevné schéma, kde N-terminál je modrý a C-terminál červený. (E) Protein-W ve stejném pohledu jako v (A) a zbytky na rozhraní proteinu-W:LH1 jsou znázorněny tyčinkami s připojenými značkami. (F) Protein-W je v kresleném znázornění otočen o 90° vzhledem k (E) a LH1αβ14 a v sloupcovém znázornění vzhledem ke zbytkům na rozhraní. Přečnívající zbytky z beta polypeptidu jsou označeny. Kofaktor je znázorněn jako sloupec odpovídající barvě obrázku 1, rozložený β-DDM je zobrazen šedě a kyslík je zobrazen červeně. (G) Pohled na obrázku (F) je otočen o 180° s výraznými zbytky označeného alfa polypeptidu.
Protein-W nahrazuje αβ heterodimer (15. na obrázku 1F), čímž zabraňuje uzavření smyčky a naklonění prvních tří αβ heterodimerů. Bylo pozorováno, že maximální úhel sklonu prvního αβ-1 heterodimeru vzhledem k normále filmu byl 25° až 29° (obrázek 1, A a E), který byl vytvořen sklonem αβ-1 o 2° až 8° v RC A, což je v ostrém kontrastu s LH116 (obrázek 1, B a F). Druhý a třetí heterodimer jsou nakloněny o 12° až 22°, respektive 5° až 10°. Vzhledem ke sterické zábraně RC nezahrnuje sklon αβ-1 druhý pár αβ (který odpovídá 16. αβ na obrázku 1F), čímž vzniká zřetelná mezera v kruhu LH1 (obrázek 1, A a E). Vzhledem k absenci dvou heterodimerů αβ, doprovázené ztrátou čtyř BChl a dvou karotenoidů, se žádný z karotenoidů neváže na zkroucenou podjednotku αβ-1, což vede ke kruhu LH114-W obsahujícímu 13 karotenoidů Vegetarian a 28 BChl. Odhady lokálního rozlišení dvou komplexů v oblastech αβ1 až 7 jsou nižší než u zbytku smyčky LH1, což může odrážet inherentní plasticitu podjednotky LH1 sousedící s místem RC QB (obrázek 4).
Obrázky RC-LH114-W (A a B) a RC-LH116 (C a D) jsou zobrazeny ze stejného pohledu shora/bočního pohledu (A a B) (A a C) a povrchu dutiny jako na Obr. 1 (B a D). Barevné klíče jsou zobrazeny vpravo.
Jediným dalším charakteristickým jádrovým komplexem se stechiometrickým poměrem 1:14 je dimer Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Protein W a PufX však nemají žádnou zjevnou homologii a mají významný vliv na své příslušné struktury LH1. PufX je jediný TMH s N-terminální cytoplazmatickou doménou, která interaguje s cytoplazmatickou stranou podjednotky RC-H (13) v poloze odpovídající Rps. palustris LH116αβ-16. PufX vytváří kanál pro výměnu chinon/chinolon mezi RC-LH1 a komplexem cytochromu bcl a je přítomen ve všech jádrových komplexech Rba. sphaeroides (13). Ačkoli je rozhraní monomer-monomer v Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX se nachází ve vazebné pozici proteinu W v RC-LH114-W a mezera indukovaná PufX a proteinem-W je v ekvivalentní poloze (obrázek S7A). Mezera v RC-LH114-W je také zarovnána s hypotetickým chinonovým kanálem (8) Pseudomonas rosea LH1, který je tvořen peptidy, které nesouvisejí s proteinem W ani PufX (obrázek S7B). Kromě toho se chinonový kanál v Blc. Smaragdově zelený LH1, vytvořený vyloučením jedné γ podjednotky (7), nachází v podobné poloze (obrázek S7C). Ačkoli je zprostředkován různými proteiny, výskyt těchto chinonových/chinololových kanálů ve společné poloze v komplexu RC-LH1 se zdá být příkladem konvergentní evoluce, což naznačuje, že mezera vytvořená proteinem W může fungovat jako chinonový kanál.
Mezera ve smyčce LH114-W umožňuje vytvoření souvislé membránové oblasti mezi vnitřním prostorem komplexu RC-LH114-W a objemovou membránou (obrázek 1G), spíše než aby obě domény byly propojeny proteinovým pórem jako u proteinů. Komplex RC-LH116 je podobný uzavřenému jehličkovitému komplexu Tch. (22) (obrázek 1H). Vzhledem k tomu, že difuze chinonu membránou je rychlejší než difuze úzkým proteinovým kanálem, otevřená smyčka LH114-W může umožnit rychlejší obrat RC než uzavřená smyčka LH116 a difuze chinonu do RC může být omezenější. Abychom otestovali, zda protein W ovlivňuje přeměnu chinonů prostřednictvím RC, provedli jsme test oxidace cytochromu s určitou koncentrací ubichinonu 2 (UQ2) (analog přírodního UQ10 s kratším isoprenovým koncem) (obrázek 2E). Přestože přítomnost chelátovaného chinonu brání přesnému stanovení zdánlivé Michaelisovy konstanty (RC-LH114-W a RC-LH116 jsou vhodné pro 0,2±0,1 μM a 0,5±0,2 μM), maximální rychlost RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) je o 28±5 % vyšší než u RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Původně jsme odhadli, že protein-W je přítomen v přibližně 10 % jádrového komplexu (16); zde je míra obsazenosti buněk s nízkým, středním a vysokým světlem 15 ± 0,6 %, 11 ± 1 % a 0,9 ± 0,5 % (obrázek 2F). Kvantitativní srovnání hmotnostní spektrometrie ukázalo, že přidání histidinové značky nesnížilo relativní množství proteinu-W ve srovnání s kmeny divokého typu (P = 0,59), takže tyto hladiny nejsou artefaktem modifikovaného proteinu-W (obrázek S10). Tato nízká obsazenost proteinu-W v komplexu RC-LH1 však může umožnit některým RC zrychlené přepínání, čímž se zmírní pomalejší výměna chinonů/chinolonů v komplexu RC-LH116. Všimli jsme si, že míra obsazenosti při vysokém světle je v rozporu s nedávnými transkriptomickými daty, což naznačuje, že exprese genu pufW se zvyšuje za silného světla (obrázek S11) (23). Rozdíl mezi transkripcí pufW a inkorporací proteinu W do komplexu RC-LH1 je matoucí a může odrážet komplexní regulaci proteinu.
V RC-LH114-W je alokováno a modelováno 6 molekul kardiolipinu (CDL), 7 molekul fosfatidylcholinu (POPC), 1 molekula fosfatidylglycerolu (POPG) a 29 molekul β-DDM: 6 molekul CDL, 24 molekul POPC, 2 molekuly POPG a 12 molekul β-DDM. RC-LH116 (obrázek 5, A a B). V těchto dvou strukturách se CDL nachází téměř na cytoplazmatické straně komplexu, zatímco POPC, POPG a β-DDM se nacházejí převážně na luminální straně. Dvě molekuly lipidu a detergentu byly izolovány v oblasti αβ-1 až αβ-6 komplexu RC-LH114-W (obrázek 5A) a pět bylo izolováno v ekvivalentní oblasti RC-LH116 (obrázek 5B). Více lipidů bylo nalezeno na druhé straně komplexu, zejména CDL, akumulovaných mezi RC a αβ-7 až αβ-13 (obrázek 5, A a B). Další strukturně rozlišené lipidy a detergenty se nacházejí vně kruhu LH1 a dobře rozlišené acylové řetězce se rozprostírají mezi podjednotkami LH1, předběžně označenými jako β-DDM v RC-LH114-W a definovanými jako β-DDM v RC A směsi β-DDM a POPC-LH116. Podobné polohy chelatačních lipidů a detergentů v naší struktuře naznačují, že se jedná o fyziologicky relevantní vazebná místa (obrázek S12A). Polohy ekvivalentních molekul v Tch mají také dobrou konzistenci. Gentle a Trv. Kmen 970 RC-LH1 (obrázek S12, B až E) (9, 12) a vodíkové vazebné zbytky lipidové hlavice vykazovaly poměrně dobrou konzervaci v zarovnání sekvence (obrázek S13), což naznačuje, že konzervovaný CDL, který se váže na RC (24), může být tato místa konzervována v komplexu RC-LH1.
(A a B) Peptidy RC-LH114-W (A) a RC-LH116 (B) jsou znázorněny kreslenými kresbami a pigmenty tyčinkami, dle barevného schématu na obrázku 1. Lipidy jsou znázorněny červeně a detergenty šedě. UQ vázaný na místa RC QA a QB je žlutý, zatímco izolovaný UQ je modrý. (C a D) Stejné pohledy jako (A) a (B), s vynechanými lipidy. (E až G) Zvětšený pohled na Q1(E), Q2(F) a Q3(G) z RC-LH116 s postranními řetězci, které se vzájemně ovlivňují. Vodíkové vazby jsou znázorněny černými přerušovanými čarami.
V RC-LH116 jsou jak RC QA, tak QB UQ, které se podílejí na přenosu elektronů v procesu separace náboje, rozloženy ve svých vazebných místech. V RC-LH114-W však nebyl QB chinon rozlišen a bude podrobněji diskutován níže. Kromě chinonů QA a QB jsou ve struktuře RC-LH114-W alokovány dvě chelátované molekuly UQ (umístěné mezi kruhy RC a LH1) podle jejich dobře rozlišených hlavových skupin (umístěných v prostoru Q1 a Q2). Obrázek 5C). Dvě isoprenové jednotky jsou přiřazeny k Q1 a mapa hustoty rozlišuje všech 10 isoprenových zbytků Q2. Ve struktuře RC-LH116 byly rozlišeny tři chelátované molekuly UQ10 (Q1 až Q3, obrázek 5D) a všechny molekuly mají jasnou hustotu v celém zbytku (obrázek 5, D až G). V obou strukturách mají pozice chinonových hlavic Q1 a Q2 vynikající konzistenci (obrázek S12F) a interagují pouze s RC. Q1 se nachází na vstupu do W mezery RC-LH114-W (obrázek 1G a 5, C, D a E) a Q2 se nachází v blízkosti vazebného místa QB (obrázek 5, C, D a F). Konzervované zbytky L-Trp143 a L-Trp269 jsou velmi blízko Q1 a Q2 a poskytují potenciální π-stacking interakce (obrázek 5, E a F a obrázek S12). L-Gln88, 3,0 Å od distálního kyslíku Q1, poskytuje silnou vodíkovou vazbu (obrázek 5E); tento zbytek je konzervován ve všech RC s výjimkou nejvzdálenějšího vztahu (obrázek S13). L-Ser91 je konzervativně substituován za Thr ve většině ostatních RC (obrázek S13), je 3,8 Å od methylového kyslíku Q1 a může vytvářet slabé vodíkové vazby (obrázek 5E). Q3 se nezdá mít specifickou interakci, ale nachází se v hydrofobní oblasti mezi podjednotkou RC-M a podjednotkou LH1-α 5 až 6 (obrázek 5, D a G). Q1, Q2 a Q3 nebo blízké chelátované chinony byly také rozlišeny v Tch. Gentle, Trv. Strain 970 a Blc. Struktura irisu (9, 10, 12) ukazuje na konzervované pomocné vazebné místo pro chinon v komplexu RC-LH1 (obrázek S12G). Pět rozložených UQ v RC-LH116 je v dobré shodě s hodnotou 5,8 ± 0,7 pro každý komplex stanovenou vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC), zatímco tři rozložené UQ v RC-LH114-W jsou nižší než Naměřená hodnota 6,2 ± 0,3 (obr. S14) naznačuje, že ve struktuře jsou přítomny nerozložené molekuly UQ.
Pseudosymetrické L a M polypeptidy obsahují každý pět TMH a tvoří heterodimer, který kombinuje jeden dimer BChl, dva monomery BChl, dva monomery bakteriofága (BPh) a jednu molekulu nehemového železa a jednu nebo dvě molekuly UQ10. Díky přítomnosti vodíkových vazeb na terminální ketonové skupině a její známé akumulaci v Rps jsou karotenoidy začleněny do M-podjednotky, která se nazývá cis-3,4-dehydroorhodopin. Druhy (25). Doména vnější membrány RC-H je ukotvena k membráně jediným TMH. Celková struktura RC je podobná třípodjednotkové RC příbuzných druhů (jako je Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Makrocykly BChl a BPh, karotenoidní páteř a nehemové železo se v rozsahu rozlišení těchto struktur překrývají, stejně jako hlavní skupina UQ10 v místě QA a QB chinon v RC-LH116 (obrázek S15).
Dostupnost dvou RC struktur s různou mírou obsazenosti QB míst poskytuje novou příležitost ke zkoumání konzistentních konformačních změn doprovázejících vazbu QB chinonu. V komplexu RC-LH116 se QB chinon nachází v plně vázané „proximální“ poloze (26), ale separace RC-LH114-W neobsahuje QB chinon. V RC-LH114-W není QB chinon přítomen, což je překvapivé, protože komplex je aktivní, a to více než komplex RC-LH116 se strukturně rozštěpeným QB chinonem. Ačkoli dva kruhy LH1 chelatují asi šest chinonů, pět je strukturně rozštěpených v uzavřeném kruhu RC-LH116, zatímco pouze tři jsou strukturně omezené v otevřeném kruhu RC-LH114-W. Tato zvýšená strukturní porucha může odrážet rychlejší nahrazování QB míst RC-LH114-W, rychlejší kinetiku chinonů v komplexu a zvýšenou pravděpodobnost překročení smyčky LH1. Domníváme se, že absence UQ v místě RC QB RC-LH114-W může být výsledkem složitějšího a aktivnějšího komplexu a že místo QB RC-LH114-W bylo okamžitě zmrazeno v obratu UQ. Specifická fáze (vstup do místa QB byl uzavřen) odráží konformaci této aktivity.
Bez QB dochází k doprovodné rotaci L-Phe217 do polohy, která není kompatibilní s vazbou UQ10, protože to způsobí prostorovou kolizi s první isoprenovou jednotkou ocasu (obrázek 6A). Kromě toho jsou patrné hlavní konformační změny, zejména helix de (krátká helix ve smyčce mezi TMH D a E), kde je L-Phe217 posunut do vazebné kapsy QB, a rotace L-Tyr223 (obrázek 6A) za účelem přerušení vodíkové vazby s rámcem M-Asp45 a uzavření vstupu do vazebného místa QB (obrázek 6B). Helix de se otáčí ve své základně, Cα L-Ser209 je posunut o 0,33 Å, zatímco L-Val221Cα je posunut o 3,52 Å. Nejsou pozorovatelné žádné změny v TMH D a E, které by se v obou strukturách překrývaly (obrázek 6A). Pokud víme, je to první struktura v přirozeném RC, která uzavírá místo QB. Srovnání s kompletní (QB-vázanou) strukturou ukazuje, že před redukcí chinonu je nutná konformační změna, aby mohl vstoupit do chinonu. L-Phe217 se otáčí a vytváří π-stacking interakci s chinonovou hlavní skupinou a helix se posouvá směrem ven, což umožňuje kostře L-Gly222 a bočnímu řetězci L-Tyr223 vytvořit síť vodíkových vazeb se stabilní strukturou vodíkových vazeb (obrázek 6, A a C).
(A) Překrývající se kresba hologramu (řetězec L, oranžová/řetězec M, purpurová) a apo (šedá) struktury, ve které jsou klíčové zbytky zobrazeny ve formě tyčinky. UQ10 je znázorněn žlutým pruhem. Tečkovaná čára označuje vodíkové vazby vytvořené v celé struktuře. (B a C) Povrchové znázornění apolipoproteinu a celé kruhové struktury, zvýrazněný kyslík postranního řetězce L-Phe217 modře a L-Tyr223 červeně. Podjednotka L je oranžová; podjednotky M a H nejsou zbarveny. (D a E) Apolipoprotein (D) a celá (E) RC QB místa [vybarveno podle (A)] a Thermophilus thermophilus PSII (zelená, modrá s plastovým chinonem; PDB ID: 3WU2) Zarovnání (58).
Ačkoli je k dispozici několik struktur RC s deficitem QB bez LH1, konformační změny pozorované v této studii nebyly dosud popsány. Patří mezi ně struktura s deplecí QB ​​z Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) a Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), které jsou všechny téměř shodné s jejich celkovou strukturou QB. Bližší zkoumání 3PRC odhalilo, že molekuly detergentu LDAO (lauryldimethylaminoxid) se vážou na vstup do pozice QB, což může zabránit přesmyku do uzavřené konformace. Ačkoli se LDAO nerozkládá ve stejné poloze v 1EYS nebo 1OGV, tyto RC jsou připraveny za použití stejného detergentu, a proto mohou mít stejný účinek. Krystalová struktura Rba. Zdá se, že i Sphaeroides RC kokrystalizovaný s cytochromem c2 (PDB ID: 1L9B) má uzavřené vazebné místo QB. V tomto případě však N-terminální oblast RC-M polypeptidu (interagující s vazebným místem QB prostřednictvím H vazby zbytku Tyr na Q helixu) zaujímá nepřirozenou konformaci a konformační změna QB není dále zkoumána (30). Uklidňující je, že jsme tento druh deformace M polypeptidu neviděli ve struktuře RC-LH114-W, která je téměř stejná jako N-terminální oblast RC-LH116 RC. Je třeba také poznamenat, že po odstranění antény LH1 na bázi detergentu byly RC apolipoproteinu v PDB rozpuštěny, což eliminovalo vnitřní chinonové skupiny a lipidy v mezeře mezi RC a vnitřním povrchem okolního kruhu LH1 (31, 32). RC zůstává funkční, protože si zachovává všechny kofaktory, s výjimkou rozložitelného QB chinonu, který je méně stabilní a během procesu přípravy se často ztrácí (33). Kromě toho je známo, že odstranění LH1 a přirozených cyklických lipidů z RC může mít vliv na funkce, jako je zkrácená životnost stavu P+QB s odděleným nábojem (31, 34, 35). Proto spekulujeme, že existence lokálního kruhu LH1 obklopujícího RC může udržovat „uzavřené“ QB místo, a tím zachovat lokální prostředí v blízkosti QB.
Ačkoli apolipoprotein (bez QB chinonu) a kompletní struktura představují pouze dva momenty obratu QB místa, spíše než sérii událostí, existují náznaky, že vazba může být řízena, aby se zabránilo opětovné vazbě hydrochinonem za účelem inhibice inhibice substrátu. Interakce chinololu a chinonu v blízkosti QB místa apolipoproteinu může být odlišná, což vede k jeho odmítnutí RC. Dlouho se předpokládá, že konformační změny hrají roli ve vazbě a redukci chinonů. Schopnost zmrazených RC redukovat chinony po adaptaci na tmu je narušena (36); rentgenová krystalografie ukazuje, že toto poškození je způsobeno tím, že QB chinony jsou zachyceny v „distální“ konformaci asi 4,5 Å od aktivní proximální polohy (26, 37). Domníváme se, že tato distální vazebná konformace je momentem přechodného stavu mezi apolipoproteinem a plnou kruhovou strukturou, který následuje po počáteční interakci s chinonem a otevření QB místa.
Redukce chinonů typu II typu II, která se nachází v komplexu PSII některých fototrofních bakterií a sinic, řas a rostlin, má strukturální a funkční konzervaci (38). Strukturní uspořádání znázorněné na obrázku 6 (D a E) zdůrazňuje podobnost mezi RC PSII a místem QB bakteriálního komplexu RC. Toto srovnání je již dlouho modelem pro studium blízce příbuzných systémů vazby a redukce chinonů. Předchozí publikace naznačovaly, že konformační změny jsou doprovázeny redukcí chinonů pomocí PSII (39, 40). Vzhledem k evoluční konzervaci RC by tedy tento dříve nepozorovaný vazebný mechanismus mohl být použitelný i pro místo QB RC PSII v okysličených fototrofních rostlinách.
Kmeny Rps ΔpufW (neznačená delece pufW) a PufW-His (C-terminálně 10x His-značený protein-W exprimovaný z přirozeného lokusu pufW). Kmen palustris CGA009 byl popsán v naší předchozí práci (16). Tyto kmeny a izogenní rodič divokého typu byly získány z mrazničky nanesením malého počtu buněk na plotnu PYE (každá 5 g litr -1) (skladovanou v LB při -80 °C, obsahující 50 % (hm./obj.) glycerolového proteinu, kvasničného extraktu a sukcinátu) agaru [1,5 % (hm./obj.)]. Plato bylo inkubováno přes noc ve tmě při pokojové teplotě za anaerobních podmínek a poté osvětleno bílým světlem (~50 μmolm-2 s-1) halogenovými žárovkami OSRAM 116-W (RS Components, Spojené království) po dobu 3 až 5 dnů, dokud se neobjevila jediná kolonie. Jedna kolonie byla použita k inokulaci 10 ml média M22+ (41) doplněného 0,1 % (hm./obj.) kasaminokyselin (dále jen M22). Kultura byla pěstována za podmínek nízkého obsahu kyslíku ve tmě při teplotě 34 °C za třepání při 180 ot./min po dobu 48 hodin a poté bylo 70 ml kultury inokulováno za stejných podmínek po dobu 24 hodin. Semiaerobní kultura o objemu 1 ml byla použita k inokulaci 30 ml média M22 v 30ml univerzální průhledné skleněné lahvičce se šroubovacím uzávěrem a ozářena za míchání (~50 μmolm-2 s-1) po dobu 48 hodin sterilní magnetickou míchací tyčinkou. Poté bylo 30 ml kultury inokulováno přibližně 1 litrem kultury za stejných podmínek, která byla následně použita k inokulaci přibližně 9 litrů kultury osvětlené při ~200 μmolm-2 s-1 po dobu 72 hodin. Buňky byly sklizeny centrifugací při 7132 RCF po dobu 30 minut, resuspendovány v ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) a skladovány při -20 °C do doby použití.
Po rozmrazení přidejte k resuspendovaným buňkám několik krystalů deoxyribonukleázy I (Merck, Spojené království), lysozymu (Merck, Spojené království) a dvě tablety inhibitoru proteázy Roche holoenzym (Merck, Spojené království). V francouzské tlakové cele 20 000 psi (Aminco, USA) byly buňky 8 až 12krát rozrušeny. Po odstranění nerozbitých buněk a nerozpustných zbytků centrifugací při 18 500 RCF po dobu 15 minut při 4 °C byla membrána precipitována z pigmentovaného lyzátu centrifugací při 113 000 RCF po dobu 2 hodin při 43 000 °C. Rozpustnou frakci odlijte a barevnou membránu resuspendujte ve 100 až 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) a homogenizujte, dokud nezmizí všechny viditelné agregáty. Suspendovaná membrána byla inkubována v 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) obsahujícím 2 % (hmotn./obj.) β-DDM po dobu 1 hodiny ve tmě při 4 °C za mírného míchání. Poté byla centrifugována při 70 °C po dobu 1 hodiny při 4 °C, aby se rozpustilo 150 000 RCF a odstranily se zbytky nerozpustných látek.
Solubilizační membrána z kmene ΔpufW byla nanesena na 50ml DEAE Sepharose iontoměničovou kolonu se třemi objemy kolony (CV) vazebného pufru [20 mM tris-HCl (pH 8,0) obsahujícího 0,03 % (hmotnost/objem) β-DDM]. Kolonu promyjte dvěma CV vazebnými pufry a poté dvěma vazebnými pufry obsahujícími 50 mM NaCl. Komplex RC-LH116 byl eluován lineárním gradientem 150 až 300 mM NaCl (ve vazebném pufru) při 1,75 CV a zbývající vazebný komplex byl eluován vazebným pufrem obsahujícím 300 mM NaCl při 0,5 CV. Absorpční spektrum se měří mezi 250 a 1000 nm, frakce s absorbančním poměrem (A880/A280) větším než 1 se udržuje při 880 až 280 nm, dvakrát se zředí ve vazebném pufru a stejný postup se opakuje na DEAE koloně při purifikaci. Frakce s poměry A880/A280 vyššími než 1,7 a A880/A805 vyššími než 3,0 se zředí, provede se třetí kolo iontové výměny a frakce s poměry A880/A280 vyššími než 2,2 a A880/A805 vyššími než 5,0 se ponechají. Částečně vyčištěný komplex byl zakoncentrován na přibližně 2 ml v odstředivém filtru Amicon 100 000 s cut-off molekulové hmotnosti (MWCO) (Merck, Spojené království) a nanesen na vylučovací kolonu Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, USA) obsahující 200 mM NaCl pufr a poté eluován ve stejném pufru při 1,5 CV. Zaznamenejte absorpční spektra frakce s vylučovací metodou a zakoncentrujte absorpční spektra s poměry A880/A280 většími než 2,4 a A880/A805 většími než 5,8 až 100 A880 a ihned je použijte pro přípravu nebo skladování mřížky kryo-TEM. Uchovávejte při teplotě -80 °C do doby použití.
Solubilizační membrána z kmene PufW-His byla nanesena na 20ml kolonu HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8,0) obsahující 200 mM NaCl a 0,03 % (hmotn./hmotn.)) v pufru IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolona byla promyta pěti CV pufru IMAC a poté pěti CV pufru IMAC obsahujícího 10 mM histidin. Jádrový komplex byl eluován z kolony pěti pufry IMAC obsahujícími 100 mM histidin. Frakce obsahující komplex RC-LH114-W byla zakoncentrována na ~10 ml v míchané nádrži vybavené filtrem Amicon 100 000 MWCO (Merck, UK), 20krát zředěna vazebným pufrem a poté přidána do 25 ml roztoku. V koloně DEAE Sepharose byly předem použity čtyři CV vázané na pufr. Kolonu promyjte čtyřmi vazebnými pufry pro CV, poté eluujte komplex na osmi CV s lineárním gradientem 0 až 100 mM NaCl (ve vazebném pufru) a zbývající čtyři CV obsahující 100 mM vazebný pufr. Zbývající komplexy eluované na chloridu sodném v kombinaci s frakcemi s poměrem A880/A280 vyšším než 2,4 a poměrem A880/A805 vyšším než 4,6 byly zakoncentrovány na přibližně 2 ml v odstředivém filtru Amicon 100 000 MWCO a naplněny 1,5 CV IMAC předem. Kolonu s vylučovací kolonou Superdex 200 16/600 ekvilibrovanou pufrem a poté eluovány ve stejném pufru v množství 1,5 CV. Sbírejte absorpční spektra frakcí s vylučovacím číslem a zakoncentrujte absorpční spektra s poměry A880/A280 většími než 2,1 a A880/A805 většími než 4,6 na 100 A880, která se ihned použijí pro přípravu zmrazené TEM mřížky nebo se uchovávají při teplotě -80 °C do doby použití.
Pro přípravu nízkoteplotních TEM mřížek byl použit imerzní mrazák Leica EM GP. Komplex byl zředěn v pufru IMAC na A880 50 a poté bylo 5 μl naneseno na nově doutnavě vybitou měděnou síťku QUANTIFOIL 1.2/1.3 s uhlíkovým povlakem (Agar Scientific, Spojené království). Mřížku inkubujte při 20 °C a 60% relativní vlhkosti po dobu 30 s, poté ji osušte savým papírem po dobu 3 s a poté ji uhaste v kapalném ethanu při -176 °C.
Data komplexu RC-LH114-W byla zaznamenána na zařízení eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) pomocí mikroskopu Titan Krios, který pracuje s urychlovacím napětím 300 kV, s nominálním zvětšením 130 000× a energií mezery 20 eV. Pro záznam snímků v režimu počítání a sběr dat byl použit Gatan 968 GIF Quantum s detektorem píků K2. Kalibrovaná velikost pixelu je 1,048 Å a dávkový příkon je 3,83 e-Å-2s-1. Film byl nasbírán za 11 sekund a rozdělen na 40 částí. K zaostření mikroskopu byla použita oblast potažená uhlíkem a poté byly nasbírány tři filmy na otvor. Celkem bylo nasbíráno 3130 filmů s hodnotami rozostření mezi -1 a -3 μm.
Data pro komplex RC-LH116 byla shromážděna pomocí stejného mikroskopu v Asterbury Biostructure Laboratory (Univerzita v Leedsu, Spojené království). Data byla shromážděna v režimu počítání se zvětšením 130 k a velikost pixelu byla kalibrována na 1,065 Å s dávkou 4,6 e-Å-2s-1. Film byl nahrán za 12 sekund a rozdělen do 48 částí. Celkem bylo shromážděno 3359 filmů s hodnotami rozostření mezi -1 a -3 μm.
Veškeré zpracování dat probíhá v systému Relion 3.0 (42). Pro korekci pohybu paprsku dávkovým vážením použijte Motioncorr 2 (43) a poté použijte CTFFIND 4.1 (44) k určení parametru CTF (funkce přenosu kontrastu). Typické fotomikrofotografie po těchto počátečních fázích zpracování jsou znázorněny na obrázku 2. S16. Šablona automatického výběru je generována ručním výběrem přibližně 250 pixelů s 1000 částicemi v 250pixelovém snímku a bez referenční dvourozměrné (2D) klasifikace, čímž se odmítnou ty klasifikace, které splňují požadavky na kontaminaci vzorku nebo nemají žádné rozeznatelné charakteristiky. Poté byl proveden automatický výběr všech mikrofotografií a komplex RC-LH114-W obsahoval 849 359 částic a komplex RC-LH116 obsahoval 476 547 částic. Všechny vybrané částice prošly dvěma koly nereferenční 2D klasifikace a po každém běhu jsou částice, které splňují požadavky na uhlíkovou oblast, kontaminaci vzorku, neobsahují žádné zjevné znaky nebo se silně překrývají, odmítnuty. Výsledkem je 772 033 (90,9 %) a 359 678 (75,5 %) částic. Částice byly použity pro 3D klasifikaci RC-LH114-W a RC-LH116. Počáteční 3D referenční model byl generován metodou stochastického gradientního sestupu. S využitím počátečního modelu jako reference jsou vybrané částice ve 3D klasifikovány do čtyř kategorií. S využitím modelu v této kategorii jako reference se provede 3D zjemnění částic v největší kategorii, poté se pomocí počátečního 15Å dolnopropustného filtru pokryje oblast rozpouštědla, přidá se 6 pixelů s měkkými hranami a pixely se následně zpracují pro korekci modulační přenosové funkce píku Gatan K2 horního detektoru. Pro datovou sadu RC-LH114-W byl tento počáteční model upraven odstraněním silné hustoty na okrajích masky (oddělené od hustoty jádrového komplexu v UCSF Chimera). Výsledné modely (rozlišení RC-LH114-W a RC-LH116 je 3,91 a 4,16 Å) se používají jako reference pro druhé kolo 3D klasifikace. Použité částice jsou seskupeny do počáteční 3D třídy a neobsahují silnou korelaci s okolím. Překrývání nebo absence zjevných strukturních rysů. Po druhém kole 3D klasifikace byla vybrána kategorie s nejvyšším rozlišením [Pro RC-LH114-W je jedna kategorie 377 703 částic (44,5 %), pro RC-LH116 existují dvě kategorie, celkem 260 752 částic (54,7 %), kde jsou stejné pouze při zarovnání po počáteční rotaci s malým rozdílem]. Vybrané částice jsou znovu extrahovány v 400pixelovém boxu a zjemněny 3D zjemněním. Maska rozpouštědla je generována pomocí počátečního 15Å dolnoprůchodového filtru, 3pixelové expanze mapy a 3pixelové měkké masky. Pomocí zjemnění CTF na částici, korekce pohybu na částici a druhého kola zjemnění CTF na částici se po každém kroku provádí 3D zjemnění, maskování rozpouštědlem a následné zpracování pro další zjemnění výsledné textury. Při použití mezní hodnoty FSC (Fourierova korelačního koeficientu Shell) 0,143 je rozlišení finálních modelů RC-LH114-W a RC-LH116 2,65 a 2,80 Å. FSC křivka finálního modelu je znázorněna na obrázku 2. S17.
Všechny proteinové sekvence jsou staženy z UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) byl použit ke konstrukci homologního modelu RC, který obsahuje proteinové sekvence RC-L, RC-M a RC-H a krystalovou strukturu Rba. sphaeroides RC byl použit jako templát (PDB ID: 5LSE) (46). Pomocí nástroje „fit map“ v UCSF Chimera přizpůsobte vygenerovaný model mapě (47), vylepšete strukturu proteinu a přidejte kofaktor [4×BChl a (název zbytku z knihovny monomerů = BCL), 2×BPh a (BPH), jeden nebo dva druhy UQ10 (U10), jeden nehemový železo (Fe) a jeden 3,4-dihydrohexakarbonylcholin (QAK)] pomocí Coota (48). Protože QAK není v knihovně monomerů k dispozici, byl parametrizován pomocí nástroje eLBOW v PHENIX (49).
Dále byla zkonstruována podjednotka LH1. Nejprve byl použit nástroj pro automatickou konstrukci v programu PHENIX (49) k automatické konstrukci části sekvence LH1 s použitím mapy a proteinových sekvencí LH1-α a LH1-β jako vstupu. Vybral se nejkompletnější podjednotka LH1, extrahoval se a načetl se do Cootu, ručně se do něj přidala chybějící sekvence a ručně se upřesnila celá struktura před přidáním dvou BCl a (BCL) a spirilloxanthinu (CRT) [podle relevantních Rps. Hustota komplexu LH1 a známý obsah karotenoidů. Druh (17)]. Zkopíroval se kompletní podjednotka LH1 a pomocí nástroje UCSF Chimera „Docking Map Tool“ se ukotvila v sousední nemodelové oblasti hustoty LH1 a poté se upřesnila v Cootu; proces se opakuje, dokud nebudou vymodelovány všechny podjednotky LH1. Pro strukturu RC-LH114-W je protein segmentován od zbývajících neproteinových složek v mapě USCF Chimera extrakcí a nástroj Autobuild se používá k vytvoření počátečního modelu a modelování zbývajících podjednotek (protein-W). V PHENIX (49). Do výsledného modelu v Coot (48) přidejte všechny chybějící sekvence a poté ručně upřesněte celou podjednotku. Zbývající nepřidělená hustota odpovídá kombinaci lipidů (ID knihovny monomerů PDB CDL = CDL, POPC = 6PL a POPG = PGT), detergentu β-DDM (LMT) a molekul UQ10 (U10). Pomocí optimalizace PHENIX (49) a manuální optimalizace v Coot (48) zdokonalte celý počáteční model, dokud nebude možné dále zlepšit statistiky modelu a vizuální kvalitu proložení. Nakonec použijte LocScale (50) k zaostření lokální mapy a poté proveďte několik dalších cyklů modelování nepřidělené hustoty a automatické a manuální optimalizace.
Příslušné peptidy, kofaktory a další lipidy a chinony v rámci svých příslušných hustot jsou znázorněny na obrázcích 1 a 2. S18 až S23. Statistické informace o konečném modelu jsou uvedeny v tabulce S1.
Pokud není uvedeno jinak, byla absorpční spektra UV/Vis/NIR snímána na spektrofotometru Cary60 (Agilent, USA) v intervalech 1 nm od 250 nm do 1000 nm a s integračním časem 0,1 s.
Vzorek se zředí v křemenné kyvetě s 2mm dráhou na A880 = 1 a zaznamená se absorpční spektrum mezi 400 a 1000 nm. Kruhová dichroická spektra byla zaznamenána na spektropolarimetru Jasco 810 (Jasco, Japonsko) v 1nm intervalech mezi 400 nm a 950 nm při rychlosti skenování 20 nm min-1.
Molární extinkční koeficient se stanoví zředěním komplexu jádra na A880 přibližně 50. Objem 10 μl se zředí v 990 μl vazebného pufru nebo methanolu a ihned se zaznamená absorpční spektrum, aby se minimalizovala degradace BChl. Obsah BChl v každém vzorku methanolu byl vypočítán z extinkčního koeficientu při 771 nm 54,8 mM-1 cm-1 a byl stanoven extinkční koeficient (51). Naměřenou koncentraci BChl vydělte 32 (RC-LH114-W) nebo 36 (RC-LH116) pro stanovení koncentrace komplexu jádra, která se poté použije ke stanovení absorpčního spektra stejného vzorku odebraného v pufru. Extinkční koeficient. Pro každý vzorek byla provedena tři opakovaná měření a pro výpočet byla použita průměrná absorbance maxima BChl Qy. Extinkční koeficient RC-LH114-W měřený při 878 nm je 3280±140 mM-1 cm-1, zatímco extinkční koeficient RC-LH116 měřený při 880 nm je 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 byl kvantifikován podle metody popsané v (52). Stručně řečeno, HPLC s reverzní fází (RP-HPLC) byla provedena za použití HPLC systému Agilent 1200. Rozpusťte přibližně 0,02 nmol RC-LH116 nebo RC-LH114-W v 50 μl směsi methanol:chloroform 50:50 obsahující 0,02 % (hm./obj.) chloridu železitého a nastříkejte předem ekvilibrovanou injekci Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm. Rozpusťte v 1 ml-1 min-1 při 40 °C v HPLC rozpouštědle (80:20 methanol:2-propanol) na kolonu o rozměrech ×25 cm. Proveďte izokratickou eluci v HPLC rozpouštědle pro sledování absorbance při 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoidy) a 780 nm (BChl) po dobu 1 hodiny. Pík na chromatogramu při 275 nm v čase 25,5 minuty byl integrován a neobsahoval žádné další detekovatelné sloučeniny. Integrovaná plocha se používá k výpočtu molárního množství extrahovaného UQ10 s odkazem na kalibrační křivku vypočítanou z nástřiku čistých standardů od 0 do 5,8 nmol (obrázek S14). Každý vzorek byl analyzován ve třech replikátech a uváděná chyba odpovídá směrodatné odchylce průměru.
Roztok obsahující komplex RC-LH1 s maximální absorpcí Qy 0,1 byl připraven s 30 μM redukovaného cytochromu c2 z koňského srdce (Merck, Spojené království) a 0 až 50 μMUQ2 (Merck, Spojené království). Byly připraveny tři 1ml vzorky pro každou koncentraci UQ2 a inkubovány přes noc ve tmě při 4 °C, aby se zajistila úplná adaptace na tmu před měřením. Roztok byl naplněn do modulárního spektrofotometru OLIS RSM1000 vybaveného mřížkou plamen 300 nm/500 mm, vstupní štěrbinou 1,24 mm, střední štěrbinou 0,12 mm a výstupní štěrbinou 0,6 mm. Na vstupu do fotoelektronického trubice se vzorkem a referenčního fotonásobiče je umístěn 600 nm dlouhý propustný filtr, aby se vyloučilo excitační světlo. Absorbance byla sledována při 550 nm s integračním časem 0,15 s. Excitační světlo je emitováno z 880 nm LED diody M880F2 (Thorlabs Ltd., Spojené království) přes optický kabel s intenzitou 90 % a regulátorem DC2200 (Thorlabs Ltd., Spojené království) a je emitováno do zdroje světla pod úhlem 90°. Měřicí paprsek je namířen proti zrcadlu, aby odrazil veškeré světlo, které nebylo původně absorbováno vzorkem. Absorbanci sledujte 10 s před osvětlením po dobu 50 s. Poté byla absorbance dále sledována po dobu 60 s ve tmě, aby se posoudilo, do jaké míry chinolol spontánně redukuje cytochrom c23+ (viz obrázek S8 pro nezpracovaná data).
Data byla zpracována fitováním lineární počáteční rychlosti v rozmezí 0,5 až 10 s (v závislosti na koncentraci UQ2) a zprůměrováním rychlostí všech tří vzorků při každé koncentraci UQ2. Koncentrace RC-LH1 vypočítaná z příslušného extinkčního koeficientu byla použita k převodu rychlosti na katalytickou účinnost, vynesenou do grafu v programu Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) a fitováním do modelu Michaelis-Menten pro stanovení zdánlivých hodnot Km a Kcat.
Pro měření přechodné absorpce byl vzorek RC-LH1 zředěn na ~2 μM v pufru IMAC obsahujícím 50 mM askorbát sodný (Merck, USA) a 0,4 mM terbutin (Merck, USA). Jako obětní donor elektronů se používá kyselina askorbová a jako inhibitor QB se používá tert-butaklofen, aby se zajistilo, že hlavní donor RC zůstane redukovaný (tj. nefotooxidovaný) během celého procesu měření. Přibližně 3 ml vzorku se přidá do rotační cely na zakázku (o průměru přibližně 0,1 m, 350 ot./min) s optickou dráhou 2 mm, aby se zajistilo, že vzorek v laserové dráze má dostatek času na adaptaci na tmu mezi excitačními pulzy. Pro amplifikaci titan-safírového laserového systému (Spectra Physics, USA) se použijí laserové pulzy o délce ~100 fs, aby se vzorek excitoval při 880 nm s opakovací frekvencí 1 kHz (20 nJ pro NIR nebo 100 nJ pro Vis). Před sběrem dat se vzorek vystaví excitačnímu světlu po dobu přibližně 30 minut. Expozice způsobí inaktivaci QA (možná jednou nebo dvakrát snížit QA). Upozorňujeme však, že tento proces je reverzibilní, protože po dlouhém období adaptace na tmu se RC pomalu vrátí k aktivitě QA. K měření přechodových spekter s dobou zpoždění -10 až 7000 ps byl použit spektrometr Helios (Ultrafast Systems, USA). K oddělení datových sad, jejich sloučení a standardizaci použijte software Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA). K získání diferenciálních spekter souvisejících s rozpadem použijte softwarový balíček CarpetView (Light Conversion Ltd., Litva) nebo použijte funkci, která konvolvuje více exponentů s odezvou přístroje tak, aby odpovídala spektrálnímu vývoji pro jednu vlnovou délku v programu Origin (OriginLab, USA).
Jak již bylo zmíněno výše (53), byl připraven fotosyntetický film obsahující komplex LH1, kterému chyběla jak RC, tak periferní anténa LH2. Membrána byla zředěna v 20 mM Tris (pH 8,0) a poté vložena do křemenné kyvety s optickou dráhou 2 mm. Pro excitaci vzorku byl použit laserový puls o energii 30 nJ při 540 nm s dobou zpoždění -10 až 7000 ps. Datový soubor byl zpracován dle popisu pro vzorek Rps.pal.
Membrána byla peletována centrifugací při 150 000 RCF po dobu 2 hodin při 4 °C a poté byla její absorbance při 880 nm resuspendována v 20 mM tris-HCl (pH 8,0) a 200 mM NaCl. Membrána byla rozpuštěna pomalým mícháním v 2% (hm./obj.) β-DDM po dobu 1 hodiny ve tmě při 4 °C. Vzorek byl zředěn ve 100 mM triethylamoniumkarbonátu (pH 8,0) (TEAB; Merck, Spojené království) na koncentraci proteinu 2,5 mg ml-1 (analýza Bio-Rad). Další zpracování bylo provedeno podle dříve publikované metody (54), počínaje zředěním 50 μg proteinu do celkem 50 μl TEAB obsahujícího 1 % (hm./obj.) laurátu sodného (Merck, Spojené království). Po sonikaci po dobu 60 s byl vzorek redukován 5 mM tris(2-karboxyethyl)fosfinem (Merck, UK) při 37 °C po dobu 30 minut. Pro S-alkylaci byl vzorek inkubován s 10 mM methyl-S-methylthiomethansulfonátem (Merck, UK) a přidán z 200 mM zásobního roztoku isopropanolu po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Proteolytické štěpení bylo provedeno přidáním 2 μg směsi trypsin/endoproteinázový Lys-C (Promega UK) a inkubováno při 37 °C po dobu 3 hodin. Laurátový surfaktant byl extrahován přidáním 50 μl ethylacetátu a 10 μl 10% (v/v) kyseliny trifluoroctové (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) kvality LC a vortexováním po dobu 60 s. Fázová separace byla podpořena centrifugací při 15 700 RCF po dobu 5 minut. Podle protokolu výrobce byla k opatrnému odsátí a odsolení spodní fáze obsahující peptid použita spin kolona C18 (Thermo Fisher Scientific, Spojené království). Po vysušení vakuovou centrifugací byl vzorek rozpuštěn v 0,5% TFA a 3% acetonitrilu a 500 ng bylo analyzováno nanoflow RP chromatografií spojenou s hmotnostní spektrometrií za použití systémových parametrů podrobně popsaných dříve.
Pro identifikaci a kvantifikaci proteinů použijte MaxQuant v.1.5.3.30 (56) a vyhledejte databázi proteomů Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Data proteomiky získaná hmotnostní spektrometrií byla uložena v ProteomeXchange Alliance prostřednictvím partnerského repozitáře PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) pod identifikátorem datové sady PXD020402.
Pro analýzu pomocí RPLC ve spojení s hmotnostní spektrometrií s elektrosprejovou ionizací byl komplex RC-LH1 připraven z Rps divokého typu. Použitím dříve publikované metody (16) byla koncentrace proteinu produkovaného v buňkách palustris 2 mg ml-1 v 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl a 0,03% (hmotnost/objem) β- (analýza Bio-Rad) DDM. Podle protokolu výrobce použijte 2D purifikační soupravu (GE Healthcare, USA) k extrakci 10 μg proteinu precipitační metodou a sraženinu rozpusťte ve 20 μl 60% (v/v) kyseliny mravenčí (FA), 20% (v/v) acetonitrilu a 20% (v/v) vody. Pět mikrolitrů bylo analyzováno pomocí RPLC (Dionex RSLC) ve spojení s hmotnostní spektrometrií (Maxis UHR-TOF, Bruker). Pro separaci při 60 °C a 100 μlmin -1 s gradientem 85 % (v/v) rozpouštědla A [0,1 % (v/v) FA a 0,02 % (v/v) vodného roztoku TFA] až 85 % (v/v) rozpouštědla B [0,1 % (v/v) FA a 0,02 % (v/v) v 90 % (v/v) acetonitrilu TFA]. Za použití standardního zdroje elektrosprejové ionizace a výchozích parametrů po dobu delší než 60 minut hmotnostní spektrometr dosahuje poměru hmotnosti k náboji 100 až 2750 m/z. S pomocí nástroje FindPept z bioinformatického portálu ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/) namapujte hmotnostní spektrum na podjednotky komplexu.
Buňky byly kultivovány po dobu 72 hodin pod 100 ml NF-nízkého (10 μMm-2 s-1), středního (30 μMm-2 s-1) nebo vysokého (300 μMm-2 s-1) světla. Médium M22 (médium M22, ve kterém je síran amonný vynechán a sukcinát sodný je nahrazen octanem sodným) bylo použito v 100ml lahvičce se šroubovacím uzávěrem (23). V pěti 30sekundových cyklech byly naneseny skleněné kuličky o velikosti 0,1 mikronu v objemovém poměru 1:1 pro lýzu buněk a poté byly 5 minut chlazeny na ledu. Nerozpustná látka, nerozbité buňky a skleněné kuličky byly odstraněny centrifugací při 16 000 RCF po dobu 10 minut ve stolní mikrocentrifuze. Membrána byla separována v rotoru Ti 70.1 se 100 000 RCF v 20 mM tris-HCl (pH 8,0) s gradientem sacharózy 40/15% (hmotn./hmotn.) po dobu 10 hodin.
Jak je popsáno v naší předchozí práci, imunodetekce His značky na PufW (16). Stručně řečeno, purifikovaný jádrový komplex (11,8 nM) nebo membrána obsahující stejnou koncentraci RC (stanovenou oxidací odečtením redukovaného diferenčního spektra a porovnáním zátěže na barveném gelu) v 2x SDS nanášecím pufru (Merck, Spojené království) dvakrát zředěném. Proteiny byly separovány na replikačním 12% bis-tris NuPage gelu (Thermo Fisher Scientific, Spojené království). Gel byl obarven Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Spojené království) pro nanesení a vizualizaci podjednotky RC-L. Protein na druhém gelu byl přenesen na methanolem aktivovanou polyvinylidenfluoridovou (PVDF) membránu (Thermo Fisher Scientific, Spojené království) pro imunotest. PVDF membrána byla blokována v 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 a 5% (hmotnostní/v) sušeném odstředěném mléce a poté inkubována s primární protilátkou anti-His (v pufru Dilute the antibody pufru [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl a 0,05% (v/v) Tween-20] v poměru 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) po dobu 4 hodin. Po trojnásobném promytí po dobu 5 minut v protilátkovém pufru byla membrána smíchána se sekundární protilátkou proti myšímu proteinu křenové peroxidázy (Sigma-Aldrich, Spojené království) (ředěnou 1:10 000 v protilátkovém pufru). Inkubujte pro detekci (5 minut po 3 promytích v protilátkovém pufru) za použití chemiluminiscenčního substrátu WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Itálie) a přístroje Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Spojené království).
Zpracujte snímek vykreslením distribuce intenzity každého obarveného gelu nebo dráhy imunotestu, integrací plochy pod píkem a výpočtem poměru intenzit RC-L (obarvený gel) a Protein-W (imunotest) v programu ImageJ (57). Tyto poměry byly převedeny na molární poměry za předpokladu, že poměr RC-L k proteinu-W v čistém vzorku RC-LH114-W byl 1:1, a odpovídajícím způsobem normalizací celé datové sady.
Doplňující materiály k tomuto článku naleznete na adrese http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný za podmínek licence Creative Commons Attribution. Článek umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci v jakémkoli médiu za podmínky, že je původní dílo řádně citováno.
Poznámka: O uvedení vaší e-mailové adresy vás žádáme pouze proto, aby osoba, kterou stránce doporučíte, věděla, že chcete, aby e-mail viděla, a že se nejedná o spam. Nebudeme zaznamenávat žádné e-mailové adresy.
Tato otázka se používá k ověření, zda jste návštěvník, a k zabránění automatickému odesílání spamu.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktura komplexu světelné pasti 1 v reakčním centru s vysokým rozlišením poskytuje nové poznatky o dynamice chinonů.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktura komplexu světelné pasti 1 v reakčním centru s vysokým rozlišením poskytuje nové poznatky o dynamice chinonů.
©2021 American Association for the Advancement of Science. všechna práva vyhrazena. AAAS je partnerem HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.