Článek je součástí výzkumného tématu „Pokročilé bioremediační technologie a recyklační procesy syntetických organických sloučenin (SOC). Zobrazit všech 14 článků
Nízkomolekulární polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU), jako je naftalen a substituované naftaleny (methylnaftalen, kyselina naftoová, 1-naftyl-N-methylkarbamát atd.), se široce používají v různých průmyslových odvětvích a jsou genotoxické, mutagenní a/nebo karcinogenní pro organismy. Tyto syntetické organické sloučeniny (SOC) neboli xenobiotika jsou považovány za prioritní znečišťující látky a představují vážnou hrozbu pro globální životní prostředí a veřejné zdraví. Intenzita lidských činností (např. zplyňování uhlí, rafinace ropy, emise z vozidel a zemědělské aplikace) určuje koncentraci, osud a transport těchto všudypřítomných a perzistentních sloučenin. Kromě fyzikálních a chemických metod čištění/odstraňování se jako bezpečná, nákladově efektivní a slibná alternativa objevily zelené a ekologicky šetrné technologie, jako je bioremediace, které využívají mikroorganismy schopné zcela degradovat POC nebo je přeměnit na netoxické vedlejší produkty. Různé bakteriální druhy patřící do kmenů Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia a Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus a Paenibacillus) a Actinobacteria (Rhodococcus a Arthrobacter) v půdní mikrobiotě prokázaly schopnost degradovat různé organické sloučeniny. Metabolické studie, genomika a metagenomická analýza nám pomáhají pochopit katabolickou složitost a rozmanitost přítomnou v těchto jednoduchých formách života, což lze dále využít pro efektivní biodegradaci. Dlouhodobá existence PAH vedla ke vzniku nových degradačních fenotypů prostřednictvím horizontálního přenosu genů s využitím genetických prvků, jako jsou plazmidy, transpozony, bakteriofágy, genomové ostrovy a integrační konjugační prvky. Systémová biologie a genetické inženýrství specifických izolátů nebo modelových společenstev (konsorcií) mohou umožnit komplexní, rychlou a efektivní bioremediaci těchto PAH prostřednictvím synergických efektů. V této recenzi se zaměřujeme na různé metabolické dráhy a diverzitu, genetické složení a diverzitu a buněčné reakce/adaptace bakterií degradujících naftalen a substituovaný naftalen. To poskytne ekologické informace pro terénní aplikace a optimalizaci kmenů pro efektivní bioremediaci.
Rychlý rozvoj průmyslových odvětví (petrochemie, zemědělství, farmaceutika, textilní barviva, kosmetika atd.) přispěl ke globální ekonomické prosperitě a zlepšení životní úrovně. Tento exponenciální rozvoj vedl k produkci velkého množství syntetických organických sloučenin (SOC), které se používají k výrobě různých produktů. Mezi tyto cizí sloučeniny nebo SOC patří polycyklické aromatické uhlovodíky (PAH), pesticidy, herbicidy, změkčovadla, barviva, léčiva, organofosfáty, zpomalovače hoření, těkavá organická rozpouštědla atd. Jsou emitovány do atmosféry, vodních a suchozemských ekosystémů, kde mají mnohostranné dopady a způsobují škodlivé účinky na různé bioformy prostřednictvím změny fyzikálně-chemických vlastností a struktury společenstev (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Mnoho aromatických polutantů má silný a destruktivní dopad na mnoho neporušených ekosystémů/horkých míst biodiverzity (např. korálové útesy, arktické/antarktické ledovcové příkrovy, vysokohorská jezera, hlubokomořské sedimenty atd.) (Jones 2010; Beyer a kol. 2020; Nordborg a kol. 2020). Nedávné geomikrobiologické studie ukázaly, že ukládání syntetických organických látek (např. aromatických polutantů) a jejich derivátů na povrchy umělých staveb (zastavěného prostředí) (např. památky kulturního dědictví a památky ze žuly, kamene, dřeva a kovu) urychluje jejich degradaci (Gadd 2017; Liu a kol. 2018). Lidská činnost může zesílit a zhoršit biologickou degradaci památek a budov v důsledku znečištění ovzduší a změny klimatu (Liu a kol. 2020). Tyto organické kontaminanty reagují s vodní párou v atmosféře a usazují se na konstrukci, což způsobuje fyzikální a chemickou degradaci materiálu. Biodegradace je všeobecně uznávána jako nežádoucí změny vzhledu a vlastností materiálů způsobené živými organismy, které ovlivňují jejich zachování (Pochon a Jaton, 1967). Další mikrobiální působení (metabolismus) těchto sloučenin může snížit strukturální integritu, účinnost ochrany a kulturní hodnotu (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Na druhou stranu se v některých případech ukázalo, že mikrobiální adaptace a reakce na tyto struktury jsou prospěšné, protože vytvářejí biofilmy a další ochranné krusty, které snižují rychlost rozkladu/rozkladu (Martino, 2016). Proto vývoj účinných dlouhodobých udržitelných strategií ochrany kamenných, kovových a dřevěných památek vyžaduje důkladné pochopení klíčových procesů, které se v tomto procesu podílejí. Ve srovnání s přírodními procesy (geologické procesy, lesní požáry, sopečné erupce, rostlinné a bakteriální reakce) vede lidská činnost k uvolňování velkých objemů polycyklických aromatických uhlovodíků (PAH) a dalšího organického uhlíku (OC) do ekosystémů. Mnoho PAH používaných v zemědělství (insekticidy a pesticidy, jako je DDT, atrazin, karbaryl, pentachlorfenol atd.), průmyslu (ropa, ropné kaly/odpady, plasty odvozené od ropy, PCB, změkčovadla, detergenty, dezinfekční prostředky, fumiganty, vonné látky a konzervační látky), produktech osobní péče (opalovací krémy, dezinfekční prostředky, repelenty proti hmyzu a polycyklické pižmo) a munici (výbušniny, jako je 2,4,6-TNT), jsou potenciální xenobiotika, která mohou mít vliv na zdraví planety (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna a Phale, 2008; Petrie a kol., 2015). Tento seznam lze rozšířit o sloučeniny odvozené od ropy (topné oleje, maziva, asfalteny), bioplasty s vysokou molekulovou hmotností a iontové kapaliny (Amde a kol., 2015). Tabulka 1 uvádí různé aromatické znečišťující látky a jejich použití v různých průmyslových odvětvích. V posledních letech se začaly zvyšovat antropogenní emise těkavých organických sloučenin, stejně jako oxidu uhličitého a dalších skleníkových plynů (Dvorak et al., 2017). Antropogenní dopady však výrazně převyšují ty přirozené. Kromě toho jsme zjistili, že v mnoha environmentálních prostředích přetrvává řada těkavých organických sloučenin, které byly identifikovány jako nově vznikající znečišťující látky s nepříznivými účinky na biomy (obrázek 1). Environmentální agentury, jako je Agentura pro ochranu životního prostředí Spojených států (USEPA), zařadily mnoho z těchto znečišťujících látek do svého seznamu priorit kvůli jejich cytotoxickým, genotoxickým, mutagenním a karcinogenním vlastnostem. Proto jsou zapotřebí přísné předpisy pro likvidaci a účinné strategie pro zpracování/odstraňování odpadu z kontaminovaných ekosystémů. Různé fyzikální a chemické metody čištění, jako je pyrolýza, oxidační termické zpracování, provzdušňování vzduchu, skládkování, spalování atd., jsou neúčinné a nákladné a generují korozivní, toxické a obtížně zpracovatelné vedlejší produkty. S rostoucím globálním environmentálním povědomím přitahují mikroorganismy schopné degradovat tyto znečišťující látky a jejich deriváty (jako jsou halogenované, nitro, alkylové a/nebo methylové skupiny) stále větší pozornost (Fennell a kol., 2004; Haritash a Kaushik, 2009; Phale a kol., 2020; Sarkar a kol., 2020; Schwanemann a kol., 2020). Použití těchto původních kandidátních mikroorganismů samostatně nebo ve smíšených kulturách (koloniích) k odstraňování aromatických znečišťujících látek má výhody z hlediska environmentální bezpečnosti, nákladů, účinnosti, efektivity a udržitelnosti. Výzkumníci také zkoumají integraci mikrobiálních procesů s elektrochemickými redoxními metodami, konkrétně bioelektrochemickými systémy (BES), jako slibnou technologii pro čištění/odstraňování znečišťujících látek (Huang a kol., 2011). Technologie BES přitahuje rostoucí pozornost díky své vysoké účinnosti, nízkým nákladům, environmentální bezpečnosti, provozu při pokojové teplotě, biokompatibilním materiálům a schopnosti získávat cenné vedlejší produkty (např. elektřinu, palivo a chemikálie) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Příchod vysoce výkonného sekvenování genomu a omických nástrojů/metod poskytl množství nových informací o genetické regulaci, proteomice a fluxomice reakcí různých degradačních mikroorganismů. Kombinace těchto nástrojů se systémovou biologií dále prohloubila naše chápání výběru a jemného doladění cílových katabolických drah v mikroorganismech (tj. metabolického designu) pro dosažení efektivní a účinné biodegradace. Abychom mohli navrhnout účinné strategie bioremediace s využitím vhodných kandidátních mikroorganismů, musíme porozumět biochemickému potenciálu, metabolické diverzitě, genetickému složení a ekologii (autoekologie/synekologie) mikroorganismů.
Obr. 1. Zdroje a cesty nízkomolekulárních PAH v různých prostředích a různé faktory ovlivňující biotu. Čárkované čáry představují interakce mezi prvky ekosystému.
V této recenzi jsme se pokusili shrnout data o degradaci jednoduchých PAH, jako je naftalen a substituované naftaleny, různými bakteriálními izoláty, a to z hlediska metabolických drah a diverzity, enzymů zapojených do degradace, složení/obsah a diverzitu genů, buněčných odpovědí a různých aspektů bioremediace. Pochopení biochemických a molekulárních úrovní pomůže při identifikaci vhodných hostitelských kmenů a jejich dalším genetickém inženýrství pro efektivní bioremediaci těchto prioritních polutantů. To pomůže při vývoji strategií pro vytvoření lokalitně specifických bakteriálních konsorcií pro efektivní bioremediaci.
Přítomnost velkého počtu toxických a nebezpečných aromatických sloučenin (splňujících Huckelovo pravidlo 4n + 2π elektrony, n = 1, 2, 3, …) představuje vážnou hrozbu pro různá média životního prostředí, jako je vzduch, půda, sedimenty a povrchové a podzemní vody (Puglisi et al., 2007). Tyto sloučeniny mají jednoduché benzenové kruhy (monocyklické) nebo více benzenových kruhů (polycyklické) uspořádané lineárně, úhlově nebo shlukově a vykazují stabilitu (stabilitu/nestabilitu) v prostředí díky vysoké negativní rezonanční energii a inertitě (inertnosti), což lze vysvětlit jejich hydrofobicitou a redukovaným stavem. Když je aromatický kruh dále nahrazen methylovými (-CH3), karboxylovými (-COOH), hydroxylovými (-OH) nebo sulfonátovými (-HSO3) skupinami, stává se stabilnějším, má silnější afinitu k makromolekulám a je bioakumulativní v biologických systémech (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Některé nízkomolekulární polycyklické aromatické uhlovodíky (LMWAH), jako je naftalen a jeho deriváty [methylnaftalen, kyselina naftoová, naftalensulfonát a 1-naftyl-N-methylkarbamát (karbaryl)], byly Agenturou pro ochranu životního prostředí USA zařazeny na seznam prioritních organických znečišťujících látek jako genotoxické, mutagenní a/nebo karcinogenní (Cerniglia, 1984). Uvolňování této třídy NM-PAH do životního prostředí může vést k bioakumulaci těchto sloučenin na všech úrovních potravního řetězce, a tím ovlivnit zdraví ekosystémů (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Zdroje a cesty PAH do bioty probíhají primárně prostřednictvím migrace a interakcí mezi různými složkami ekosystému, jako je půda, podzemní voda, povrchová voda, plodiny a atmosféra (Arey a Atkinson, 2003). Obrázek 1 ukazuje interakce a distribuci různých nízkomolekulárních PAH v ekosystémech a jejich cesty k biotě/expozici člověka. PAH se ukládají na površích v důsledku znečištění ovzduší a migrací (driftem) emisí z vozidel, průmyslových výfukových plynů (zplyňování uhlí, spalování a výroba koksu) a jejich ukládáním. Průmyslové činnosti, jako je výroba syntetických textilií, barviv a nátěrů; konzervace dřeva; zpracování gumy; výroba cementu; výroba pesticidů; a zemědělské aplikace jsou hlavními zdroji PAH v suchozemských a vodních systémech (Bamforth a Singleton, 2005; Wick a kol., 2011). Studie ukázaly, že půdy v příměstských a městských oblastech, v blízkosti dálnic a ve velkých městech jsou náchylnější k polycyklickým aromatickým uhlovodíkům (PAH) v důsledku emisí z elektráren, vytápění obytných budov, zatížení ovzduší a silniční dopravou a stavební činnosti (Suman et al., 2016). (2008) ukázala, že hladiny PAH v půdě v blízkosti silnic v New Orleans v Louisianě v USA dosahovaly až 7189 μg/kg, zatímco v otevřeném prostoru činily pouze 2404 μg/kg. Podobně byly v oblastech v blízkosti lokalit zplyňování uhlí v několika amerických městech hlášeny hladiny PAH až 300 μg/kg (Kanaly a Harayama, 2000; Bamforth a Singleton, 2005). Bylo hlášeno, že půdy z různých indických měst, jako je Dillí (Sharma et al., 2008), Ágra (Dubey et al., 2014), Bombaj (Kulkarni a Venkataraman, 2000) a Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014), obsahují vysoké koncentrace PAU. Aromatické sloučeniny se snáze adsorbují na půdní částice, organickou hmotu a jílové minerály, a stávají se tak významnými úložištěmi uhlíku v ekosystémech (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Hlavními zdroji PAU ve vodních ekosystémech jsou srážky (mokré/suché srážky a vodní pára), městský odtok, vypouštění odpadních vod, doplňování podzemních vod atd. (Srogi, 2007). Odhaduje se, že přibližně 80 % PAU v mořských ekosystémech pochází ze srážek, sedimentace a vypouštění odpadních vod (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Vyšší koncentrace PAU v povrchových vodách nebo výluhech ze skládek pevného odpadu nakonec pronikají do podzemních vod, což představuje závažnou hrozbu pro veřejné zdraví, protože více než 70 % populace v jižní a jihovýchodní Asii pije podzemní vodu (Duttagupta et al., 2019). Nedávná studie Duttagupty et al. (2020) o analýzách řek (32) a podzemních vod (235) ze Západního Bengálska v Indii zjistila, že odhadem 53 % městských obyvatel a 44 % venkovských obyvatel (celkem 20 milionů obyvatel) může být vystaveno naftalenu (4,9–10,6 μg/l) a jeho derivátům. Rozdílné způsoby využívání půdy a zvýšená těžba podzemních vod jsou považovány za hlavní faktory řídící vertikální transport (advekci) nízkomolekulárních PAU v podpovrchových vodách. Bylo zjištěno, že zemědělský odtok, vypouštění komunálních a průmyslových odpadních vod a vypouštění pevného odpadu/odpadků jsou ovlivněny PAU v povodích řek a podzemních sedimentech. Atmosférické srážky dále zhoršují znečištění PAU. Vysoké koncentrace PAU a jejich alkylderivátů (celkem 51) byly hlášeny v řekách/povodích po celém světě, jako jsou řeky Fraser, Louan, Denso, Missouri, Anacostia, Ebro a Delaware (Yunker a kol., 2002; Motelay-Massei a kol., 2006; Li a kol., 2010; Amoako a kol., 2011; Kim a kol., 2018). V sedimentech povodí řeky Gangy byly jako nejvýznamnější zjištěny naftalen a fenantren (detekovány v 70 % vzorků) (Duttagupta a kol., 2019). Studie navíc ukázaly, že chlorace pitné vody může vést k tvorbě toxičtějších okysličených a chlorovaných PAU (Manoli a Samara, 1999). PAH se hromadí v obilovinách, ovoci a zelenině v důsledku příjmu rostlin z kontaminovaných půd, podzemních vod a srážek (Fismes et al., 2002). Mnoho vodních organismů, jako jsou ryby, slávky, škeble a krevety, je kontaminováno PAH konzumací kontaminovaných potravin a mořské vody, stejně jako prostřednictvím tkání a kůže (Mackay a Fraser, 2000). Metody vaření/zpracování, jako je grilování, pečení, uzení, smažení, sušení, pečení a vaření na dřevěném uhlí, mohou také vést k významnému množství PAH v potravinách. To do značné míry závisí na volbě udicího materiálu, obsahu fenolických/aromatických uhlovodíků, postupu vaření, typu ohřívače, obsahu vlhkosti, přívodu kyslíku a teplotě spalování (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAH) byly také detekovány v mléce v různých koncentracích (0,75–2,1 mg/l) (Girelli et al., 2014). Akumulace těchto PAH v potravinách závisí také na fyzikálně-chemických vlastnostech potravin, zatímco jejich toxické účinky souvisí s fyziologickými funkcemi, metabolickou aktivitou, absorpcí, distribucí a distribucí v těle (Mechini et al., 2011).
Toxicita a škodlivé účinky polycyklických aromatických uhlovodíků (PAH) jsou známy již dlouhou dobu (Cherniglia, 1984). Nízkomolekulární polycyklické aromatické uhlovodíky (LMW-PAH) (dva až tři kruhy) se mohou kovalentně vázat na různé makromolekuly, jako je DNA, RNA a proteiny, a jsou karcinogenní (Santarelli a kol., 2008). Vzhledem ke své hydrofobní povaze jsou odděleny lipidovými membránami. U lidí cytochrom P450 monooxygenázy oxidují PAH na epoxidy, z nichž některé jsou vysoce reaktivní (např. baediol epoxid) a mohou vést k transformaci normálních buněk na maligní (Marston a kol., 2001). Transformační produkty PAH, jako jsou chinony, fenoly, epoxidy, dioly atd., jsou navíc toxičtější než původní sloučeniny. Některé PAH a jejich metabolické meziprodukty mohou ovlivňovat hormony a různé enzymy v metabolismu, a tím nepříznivě ovlivňovat růst, centrální nervový systém, reprodukční a imunitní systém (Swetha a Phale, 2005; Vamsee-Krishna a kol., 2006; Oostingh a kol., 2008). Bylo hlášeno, že krátkodobá expozice nízkomolekulárním PAH způsobuje u astmatiků zhoršenou funkci plic a trombózu a zvyšuje riziko rakoviny kůže, plic, močového měchýře a gastrointestinálního traktu (Olsson a kol., 2010; Diggs a kol., 2011). Studie na zvířatech rovněž ukázaly, že expozice PAH může mít nepříznivé účinky na reprodukční funkci a vývoj a může způsobit šedý zákal, poškození ledvin a jater a žloutenku. Bylo prokázáno, že různé produkty biotransformace PAH, jako jsou dioly, epoxidy, chinony a volné radikály (kationty), tvoří adukty s DNA. Bylo prokázáno, že stabilní adukty mění replikační aparát DNA, zatímco nestabilní adukty mohou DNA depurinovat (zejména na adenin a někdy na guanin); oba mohou generovat chyby, které vedou k mutacím (Schweigert a kol. 2001). Chinony (benzo-/pan-) mohou navíc generovat reaktivní formy kyslíku (ROS), což způsobuje fatální poškození DNA a dalších makromolekul, a tím ovlivňuje funkci/životaschopnost tkání (Ewa a Danuta 2017). Bylo hlášeno, že chronická expozice nízkým koncentracím pyrenu, bifenylu a naftalenu způsobuje rakovinu u pokusných zvířat (Diggs a kol. 2012). Vzhledem k jejich letální toxicitě je prioritou vyčištění/odstranění těchto PAH z postižených/kontaminovaných míst.
K odstranění PAU z kontaminovaných míst/prostředí se používají různé fyzikální a chemické metody. Procesy jako spalování, dechlorace, UV oxidace, fixace a extrakce rozpouštědly mají mnoho nevýhod, včetně tvorby toxických vedlejších produktů, složitosti procesu, bezpečnostních a regulačních problémů, nízké účinnosti a vysokých nákladů. Mikrobiální biodegradace (nazývaná bioremediace) je však slibným alternativním přístupem, který zahrnuje použití mikroorganismů ve formě čistých kultur nebo kolonií. Ve srovnání s fyzikálními a chemickými metodami je tento proces šetrný k životnímu prostředí, neinvazivní, nákladově efektivní a udržitelný. Bioremediaci lze provádět na postiženém místě (in situ) nebo na speciálně připraveném místě (ex situ), a proto je považována za udržitelnější sanační metodu než tradiční fyzikální a chemické metody (Juhasz a Naidu, 2000; Andreoni a Gianfreda, 2007; Megharaj a kol., 2011; Phale a kol., 2020; Sarkar a kol., 2020).
Pochopení mikrobiálních metabolických kroků zapojených do degradace aromatických polutantů má obrovské vědecké a ekonomické důsledky pro ekologickou a environmentální udržitelnost. Odhaduje se, že na celém světě je v sedimentech a organických sloučeninách (tj. ropě, zemním plynu a uhlí, tj. fosilních palivech) uloženo 2,1 × 10^18 gramů uhlíku (C), což významně přispívá ke globálnímu uhlíkovému cyklu. Rychlá industrializace, těžba fosilních paliv a lidská činnost však tyto litosférické zásobárny uhlíku vyčerpávají a ročně uvolňují do atmosféry odhadem 5,5 × 10^15 g organického uhlíku (jako znečišťujících látek) (Gonzalez-Gaya a kol., 2019). Většina tohoto organického uhlíku vstupuje do suchozemských a mořských ekosystémů sedimentací, transportem a odtokem. Kromě toho nové syntetické znečišťující látky odvozené z fosilních paliv, jako jsou plasty, změkčovadla a stabilizátory plastů (ftaláty a jejich izomery), vážně znečišťují mořské, půdní a vodní ekosystémy a jejich biotu, čímž zhoršují globální klimatická rizika. V Tichém oceánu mezi Severní Amerikou a jihovýchodní Asií se nahromadily různé druhy mikroplastů, nanoplastů, fragmentů plastů a jejich toxických monomerních produktů odvozených z polyethylentereftalátu (PET), které tvoří „Velkou tichomořskou odpadkovou skvrnu“ a poškozují mořský život (Newell et al., 2020). Vědecké studie prokázaly, že tyto znečišťující látky/odpad není možné odstranit žádnými fyzikálními ani chemickými metodami. V této souvislosti jsou nejužitečnějšími mikroorganismy ty, které jsou schopny oxidativně metabolizovat znečišťující látky na oxid uhličitý, chemickou energii a další netoxické vedlejší produkty, které nakonec vstupují do dalších procesů koloběhu živin (H, O, N, S, P, Fe atd.). Pochopení mikrobiální ekofyziologie mineralizace aromatických polutantů a její environmentální kontroly je proto klíčové pro posouzení mikrobiálního uhlíkového cyklu, čistého uhlíkového rozpočtu a budoucích klimatických rizik. Vzhledem k naléhavé potřebě odstranit tyto sloučeniny z životního prostředí se objevila různá ekologická odvětví zaměřená na čisté technologie. Alternativně je zhodnocení průmyslového odpadu/odpadních chemikálií akumulovaných v ekosystémech (tj. přístup „z odpadu k bohatství“) považováno za jeden z pilířů oběhového hospodářství a cílů udržitelného rozvoje (Close a kol., 2012). Pochopení metabolických, enzymatických a genetických aspektů těchto potenciálních kandidátů na degradaci je proto nanejvýš důležité pro efektivní odstranění a bioremediaci těchto aromatických polutantů.
Mezi mnoha aromatickými polutanty věnujeme zvláštní pozornost nízkomolekulárním PAH, jako je naftalen a substituované naftaleny. Tyto sloučeniny jsou hlavními složkami paliv získaných z ropy, textilních barviv, spotřebního zboží, pesticidů (naftalin a repelenty proti hmyzu), změkčovadel a taninů, a proto jsou rozšířené v mnoha ekosystémech (Preuss et al., 2003). Nedávné zprávy zdůrazňují akumulaci koncentrací naftalenu v sedimentech zvodnělé vrstvy, podzemních vodách a podpovrchových půdách, vadózních zónách a korytech řek, což naznačuje jeho bioakumulaci v životním prostředí (Duttagupta et al., 2019, 2020). Tabulka 2 shrnuje fyzikálně-chemické vlastnosti, aplikace a zdravotní účinky naftalenu a jeho derivátů. Ve srovnání s jinými vysokomolekulárními PAH jsou naftalen a jeho deriváty méně hydrofobní, lépe rozpustné ve vodě a široce rozšířené v ekosystémech, takže se často používají jako modelové substráty pro studium metabolismu, genetiky a metabolické diverzity PAH. Velké množství mikroorganismů je schopno metabolizovat naftalen a jeho deriváty a jsou k dispozici komplexní informace o jejich metabolických drahách, enzymech a regulačních vlastnostech (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Kromě toho jsou naftalen a jeho deriváty označeny jako prototypové sloučeniny pro hodnocení znečištění životního prostředí kvůli jejich vysoké hojnosti a biologické dostupnosti. Agentura pro ochranu životního prostředí USA odhaduje, že průměrné hladiny naftalenu jsou 5,19 μg na metr krychlový z cigaretového kouře, především z nedokonalého spalování, a 7,8 až 46 μg z vedlejšího proudu kouře, zatímco expozice kreosotu a naftalenu je 100 až 10 000krát vyšší (Preuss et al. 2003). Zejména u naftalenu byla zjištěna druhově, regionálně a pohlavně specifická respirační toxicita a karcinogenita. Na základě studií na zvířatech Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny (IARC) klasifikovala naftalen jako „možný lidský karcinogen“ (skupina 2B)1. Expozice substituovaným naftalenám, primárně inhalací nebo parenterálním (orálním) podáním, způsobuje poškození plicní tkáně a zvyšuje výskyt plicních nádorů u potkanů ​​a myší (Národní toxikologický program 2). Mezi akutní účinky patří nevolnost, zvracení, bolesti břicha, průjem, bolesti hlavy, zmatenost, nadměrné pocení, horečka, tachykardie atd. Na druhou stranu, širokospektrální karbamátový insekticid karbaryl (1-naftyl N-methylkarbamát) byl popsán jako toxický pro vodní bezobratlé, obojživelníky, včely medonosné a lidi a bylo prokázáno, že inhibuje acetylcholinesterázu a způsobuje paralýzu (Smulders et al., 2003; Bulen a Distel, 2011). Proto je pochopení mechanismů mikrobiální degradace, genetické regulace, enzymatických a buněčných reakcí klíčové pro vývoj strategií bioremediace v kontaminovaném prostředí.
Tabulka 2. Podrobné informace o fyzikálně-chemických vlastnostech, použití, metodách identifikace a souvisejících onemocněních naftalenu a jeho derivátů.
Ve znečištěných nikách mohou hydrofobní a lipofilní aromatické polutanty způsobovat řadu buněčných účinků na environmentální mikrobiom (společenství), jako jsou změny v fluiditě membrány, propustnosti membrány, bobtnání lipidové dvojvrstvy, narušení přenosu energie (elektronový transportní řetězec/protonový hybný síla) a aktivita membránově asociovaných proteinů (Sikkema et al., 1995). Kromě toho některé rozpustné meziprodukty, jako jsou katecholy a chinony, generují reaktivní formy kyslíku (ROS) a tvoří adukty s DNA a proteiny (Penning et al., 1999). Množství těchto sloučenin v ekosystémech tak vyvíjí selektivní tlak na mikrobiální společenstva, aby se stala efektivními degradátory na různých fyziologických úrovních, včetně absorpce/transportu, intracelulární transformace, asimilace/využití a kompartmentalizace.
Vyhledávání v projektu Ribosomal Database Project-II (RDP-II) odhalilo, že z médií nebo obohacených kultur kontaminovaných naftalenem nebo jeho deriváty bylo izolováno celkem 926 bakteriálních druhů. Skupina Proteobacteria měla nejvyšší počet zástupců (n = 755), následovaná Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) a neklasifikovanými bakteriemi (8) (obrázek 2). Zástupci γ-Proteobacteria (Pseudomonadales a Xanthomonadales) dominovali všem gramnegativním skupinám s vysokým obsahem G+C (54 %), zatímco Clostridiales a Bacillales (30 %) byly grampozitivními skupinami s nízkým obsahem G+C. Bylo zjištěno, že Pseudomonas (nejvyšší počet, 338 druhů) jsou schopny degradovat naftalen a jeho methylderiváty v různých znečištěných ekosystémech (uhelný dehet, ropa, ropa, kaly, ropné skvrny, odpadní vody, organický odpad a skládky), stejně jako v intaktních ekosystémech (půda, řeky, sedimenty a podzemní voda) (obrázek 2). Studie obohacení a metagenomická analýza některých z těchto oblastí navíc odhalily, že nekultivované druhy Legionella a Clostridium mohou mít degradační kapacitu, což naznačuje potřebu kultivace těchto bakterií za účelem studia nových metabolických drah a diverzity.
Obr. 2. Taxonomická rozmanitost a ekologické rozšíření bakteriálních zástupců v prostředí kontaminovaném naftalenem a deriváty naftalenu.
Mezi různými mikroorganismy degradujícími aromatické uhlovodíky je většina schopna degradovat naftalen jako jediný zdroj uhlíku a energie. Sled událostí spojených s metabolismem naftalenu byl popsán pro Pseudomonas sp. (kmeny: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 a CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 a další kmeny (ND6 a AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis a Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Metabolismus je iniciován vícesložkovou dioxygenázou [naftalendioxygenáza (NDO), dioxygenáza hydroxylující kruh], která katalyzuje oxidaci jednoho z aromatických kruhů naftalenu za použití molekulárního kyslíku jako druhého substrátu, čímž se naftalen přeměňuje na cis-naftalendiol (obrázek 3). Cis-dihydrodiol je přeměněn na 1,2-dihydroxynaftalen dehydrogenázou. Kruh štěpící enzym Dioxygenáza, 1,2-dihydroxynaftalen dioxygenáza (12DHNDO), přeměňuje 1,2-dihydroxynaftalen na kyselinu 2-hydroxychromen-2-karboxylovou. Enzymatická cis-trans izomerizace produkuje trans-o-hydroxybenzylidenpyruvát, který je štěpen hydratázovou aldolázou na salicylový aldehyd a pyruvát. Organická kyselina pyruvát byla první sloučeninou C3 odvozenou z uhlíkového skeletu naftalenu a nasměrovanou do centrální uhlíkové dráhy. Kromě toho NAD+-dependentní salicylaldehyd dehydrogenáza přeměňuje salicylaldehyd na kyselinu salicylovou. Metabolismus v této fázi se nazývá „horní dráha“ degradace naftalenu. Tato dráha je velmi běžná u většiny bakterií degradujících naftalen. Existuje však několik výjimek; například u termofilního Bacillus hamburgii 2 je degradace naftalenu iniciována naftalen-2,3-dioxygenázou za vzniku... 2,3-dihydroxynaftalen (Annweiler et al., 2000).
Obrázek 3. Dráhy degradace naftalenu, methylnaftalenu, kyseliny naftoové a karbarylu. Zakroužkovaná čísla představují enzymy zodpovědné za postupnou přeměnu naftalenu a jeho derivátů na následné produkty. 1 — naftalendioxygenáza (NDO); 2, cis-dihydrodioldehydrogenáza; 3, 1,2-dihydroxynaftalendioxygenáza; 4, izomeráza 2-hydroxychromen-2-karboxylové kyseliny; 5, trans-O-hydroxybenzylidenpyruváthydratáza aldoláza; 6, salicylaldehyddehydrogenáza; 7, salicylát-1-hydroxyláza; 8, katechol-2,3-dioxygenáza (C23DO); 9, 2-hydroxymukonátsemialdehyddehydrogenáza; 10, 2-oxopent-4-enoáthydratáza; 11, 4-hydroxy-2-oxopentanoátaldoláza; 12, acetaldehyddehydrogenáza; 13, katechol-1,2-dioxygenáza (C12DO); 14, mukonátcykloizomeráza; 15, mukonolaktondelta-izomeráza; 16, β-ketoadipatenollaktonhydroláza; 17, β-ketoadipátsukcinyl-CoA transferáza; 18, β-ketoadipát-CoA thioláza; 19, sukcinyl-CoA: acetyl-CoA sukcinyltransferáza; 20, salicylát-5-hydroxyláza; 21 – gentisát 1,2-dioxygenáza (GDO); 22, maleylpyruvátizomeráza; 23, fumarylpyruváthydroláza; 24, methylnaftalenhydroxyláza (NDO); 25, hydroxymethylnaftalendehydrogenáza; 26, naftaldehyddehydrogenáza; 27, oxidáza kyseliny 3-formylsalicylové; 28, hydroxyisoftalátdekarboxyláza; 29, karbarylhydroláza (CH); 30, 1-naftol-2-hydroxyláza.
V závislosti na organismu a jeho genetické výbavě je výsledná kyselina salicylová dále metabolizována buď katecholovou cestou za použití salicylát-1-hydroxylázy (S1H), nebo gentisátovou cestou za použití salicylát-5-hydroxylázy (S5H) (obrázek 3). Vzhledem k tomu, že kyselina salicylová je hlavním meziproduktem v metabolismu naftalenu (horní cesta), kroky od kyseliny salicylové k meziproduktu TCA se často označují jako dolní cesta a geny jsou organizovány do jednoho operonu. Je běžné, že geny v operonu horní cesty (nah) a operonu dolní cesty (sal) jsou regulovány společnými regulačními faktory; například NahR a kyselina salicylová působí jako induktory, což umožňuje oběma operonům kompletně metabolizovat naftalen (Phale et al., 2019, 2020).
Katechol je navíc cyklicky štěpen meta cestou katechol-2,3-dioxygenázou (C23DO) na 2-hydroxymukonát-semialdehyd (Yen a kol., 1988) a dále hydrolyzován 2-hydroxymukonát-semialdehydhydrolázou za vzniku kyseliny 2-hydroxypent-2,4-dienové. 2-hydroxypent-2,4-dienoát je poté hydratázou (2-oxopent-4-enoáthydratáza) a aldolázou (4-hydroxy-2-oxopentanoátaldoláza) přeměněn na pyruvát a acetaldehyd a poté vstupuje do centrální uhlíkové dráhy (obrázek 3). Alternativně je katechol cyklicky štěpen orto cestou katechol-1,2-oxygenázou (C12DO) na cis,cis-mukonát. Mukonátová cykloizomeráza, mukonolaktonová izomeráza a β-ketoadipát-nollakton hydroláza přeměňují cis,cis-mukonát na 3-oxoadipát, který vstupuje do centrální uhlíkové dráhy přes sukcinyl-CoA a acetyl-CoA (Nozaki a kol., 1968) (obrázek 3).
V gentisátové (2,5-dihydroxybenzoátové) metabolické dráze je aromatický kruh štěpen gentisát-1,2-dioxygenázou (GDO) za vzniku maleylpyruvátu. Tento produkt může být přímo hydrolyzován na pyruvát a malát, nebo může být izomerizován za vzniku fumarylpyruvátu, který může být následně hydrolyzován na pyruvát a fumarát (Larkin a Day, 1986). Volba alternativní metabolické dráhy byla pozorována u gramnegativních i grampozitivních bakterií na biochemické i genetické úrovni (Morawski a kol., 1997; Whyte a kol., 1997). Gramnegativní bakterie (Pseudomonas) preferují použití kyseliny salicylové, která je induktorem metabolismu naftalenu, a dekarboxylují ji na katechol pomocí salicylát-1-hydroxylázy (Gibson a Subramanian, 1984). Na druhou stranu u grampozitivních bakterií (Rhodococcus) salicylát-5-hydroxyláza přeměňuje kyselinu salicylovou na kyselinu gentisovou, zatímco kyselina salicylová nemá žádný indukční účinek na transkripci genů naftalenu (Grund a kol., 1992) (obrázek 3).
Bylo hlášeno, že druhy jako Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas a Mycobacterium mohou degradovat monomethylnaftalen nebo dimethylnaftalen (Dean-Raymond a Bartha, 1975; Cane a Williams, 1982; Mahajan a kol., 1994; Dutta a kol., 1998; Hedlund a kol., 1999). Mezi nimi byla degradační dráha 1-methylnaftalenu a 2-methylnaftalenu u Pseudomonas sp. CSV86 jasně studována na biochemické a enzymatické úrovni (Mahajan a kol., 1994). 1-Methylnaftalen je metabolizován dvěma cestami. Nejprve je aromatický kruh hydroxylován (nesubstituovaný kruh methylnaftalenu) za vzniku cis-1,2-dihydroxy-1,2-dihydro-8-methylnaftalenu, který je dále oxidován na methylsalicylát a methylkatechol a poté po rozštěpení kruhu vstupuje do centrální uhlíkové dráhy (obrázek 3). Tato dráha se nazývá „dráha zdroje uhlíku“. Ve druhé „detoxikační dráze“ může být methylová skupina hydroxylována pomocí NDO za vzniku 1-hydroxymethylnaftalenu, který je dále oxidován na kyselinu 1-naftoovou a vylučován do kultivačního média jako slepý produkt. Studie ukázaly, že kmen CSV86 není schopen růst na kyselině 1- a 2-naftoové jako jediném zdroji uhlíku a energie, což potvrzuje jeho detoxikační dráhu (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). V 2-methylnaftalenu podléhá methylová skupina hydroxylaci hydroxylázou za vzniku 2-hydroxymethylnaftalenu. Kromě toho nesubstituovaný naftalenový kruh podléhá hydroxylaci za vzniku dihydrodiolu, který se v sérii enzymaticky katalyzovaných reakcí oxiduje na 4-hydroxymethylkatechol a vstupuje do centrální uhlíkové dráhy prostřednictvím dráhy štěpení meta-kruhu. Podobně bylo popsáno, že S. paucimobilis 2322 využívá NDO k hydroxylaci 2-methylnaftalenu, který se dále oxiduje za vzniku methylsalicylátu a methylkatecholu (Dutta et al., 1998).
Naftoové kyseliny (substituované/nesubstituované) jsou vedlejší produkty detoxikace/biotransformace, které vznikají během degradace methylnaftalenu, fenanthrenu a anthracenu a uvolňují se do použitého kultivačního média. Bylo zjištěno, že půdní izolát Stenotrophomonas maltophilia CSV89 je schopen metabolizovat kyselinu 1-naftoovou jako zdroj uhlíku (Phale et al., 1995). Metabolismus začíná dihydroxylací aromatického kruhu za vzniku 1,2-dihydroxy-8-karboxynaftalenu. Výsledný diol je oxidován na katechol prostřednictvím 2-hydroxy-3-karboxybenzylidenpyruvátu, kyseliny 3-formylsalicylové, kyseliny 2-hydroxyisoftalové a kyseliny salicylové a vstupuje do centrální uhlíkové dráhy prostřednictvím dráhy štěpení meta-kruhu (obrázek 3).
Karbaryl je naftylkarbamátový pesticid. Od zelené revoluce v Indii v 70. letech 20. století vedlo používání chemických hnojiv a pesticidů ke zvýšení emisí polycyklických aromatických uhlovodíků (PAH) z disperzních zemědělských zdrojů (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Odhaduje se, že 55 % (85 722 000 hektarů) celkové orné půdy v Indii je ošetřeno chemickými pesticidy. Za posledních pět let (2015–2020) indický zemědělský sektor spotřeboval v průměru 55 000 až 60 000 tun pesticidů ročně (Ministerstvo družstev a blahobytu farmářů, Ministerstvo zemědělství, indická vláda, srpen 2020). V severní a střední Gangeské nížině (státy s nejvyšší populací a hustotou obyvatelstva) je používání pesticidů na plodinách rozšířené, přičemž převažují insekticidy. Karbaryl (1-naftyl-N-methylkarbamát) je širokospektrální, středně až vysoce toxický karbamátový insekticid používaný v indickém zemědělství v průměrném množství 100–110 tun. Běžně se prodává pod obchodním názvem Sevin a používá se k hubení hmyzu (mšic, mravenců, blech, roztočů, pavouků a mnoha dalších venkovních škůdců), kteří postihují různé plodiny (kukuřici, sóju, bavlnu, ovoce a zeleninu). Některé mikroorganismy, jako jsou Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus a Arthrobacter, lze také použít k hubení dalších škůdců. Bylo zjištěno, že RC100 může degradovat karbaryl (Larkin a Day, 1986; Chapalamadugu a Chaudhry, 1991; Hayatsu a kol., 1999; Swetha a Phale, 2005; Trivedi a kol., 2017). Degradační dráha karbarylu byla rozsáhle studována na biochemické, enzymatické a genetické úrovni v půdních izolátech Pseudomonas sp. Kmeny C4, C5 a C6 (Swetha a Phale, 2005; Trivedi a kol., 2016) (obr. 3). Metabolická dráha začíná hydrolýzou esterové vazby karbarylhydrolázou (CH) za vzniku 1-naftolu, methylaminu a oxidu uhličitého. 1-naftol je poté přeměněn na 1,2-dihydroxynaftalen 1-naftolhydroxylázou (1-NH), který je dále metabolizován centrální uhlíkovou cestou přes salicylát a gentisát. Bylo popsáno, že některé bakterie degradující karbaryl metabolizují naftalen na kyselinu salicylovou štěpením katecholového orto kruhu (Larkin a Day, 1986; Chapalamadugu a Chaudhry, 1991). Je pozoruhodné, že bakterie degradující naftalen metabolizují kyselinu salicylovou primárně prostřednictvím katecholu, zatímco bakterie degradující karbaryl preferují metabolizaci kyseliny salicylové gentisátovou cestou.
Deriváty kyseliny naftalensulfonové/disulfonové a kyseliny naftylaminsulfonové lze použít jako meziprodukty při výrobě azobarviv, smáčecích činidel, dispergačních činidel atd. Ačkoli tyto sloučeniny mají nízkou toxicitu pro člověka, hodnocení cytotoxicity ukázala, že jsou smrtelné pro ryby, dafnie a řasy (Greim et al., 1994). Bylo popsáno, že zástupci rodu Pseudomonas (kmeny A3, C22) zahajují metabolismus dvojitou hydroxylací aromatického kruhu obsahujícího skupinu sulfonové kyseliny za vzniku dihydrodiolu, který se dále spontánním štěpením sulfitové skupiny přeměňuje na 1,2-dihydroxynaftalen (Brilon et al., 1981). Výsledný 1,2-dihydroxynaftalen je katabolizován klasickou naftalenovou cestou, tj. katecholovou nebo gentisátovou cestou (obrázek 4). Bylo prokázáno, že kyselina aminonaftalensulfonová a kyselina hydroxynaftalensulfonová mohou být kompletně degradovány smíšenými bakteriálními konsorcii s komplementárními katabolickými dráhami (Nortemann a kol., 1986). Bylo prokázáno, že jeden člen konsorcia desulfurizuje kyselinu aminonaftalensulfonovou nebo kyselinu hydroxynaftalensulfonovou 1,2-dioxygenací, zatímco aminosalicylát nebo hydroxysalicylát se uvolňuje do kultivačního média jako slepý metabolit a následně je přijímán ostatními členy konsorcia. Kyselina naftalendisulfonová je relativně polární, ale špatně biologicky odbouratelná, a proto může být metabolizována různými cestami. K prvnímu desulfurizaci dochází během regioselektivní dihydroxylace aromatického kruhu a skupiny sulfonové kyseliny; k druhému desulfurizaci dochází během hydroxylace kyseliny 5-sulfosalicylové 5-hydroxylázou kyseliny salicylové za vzniku kyseliny gentisové, která vstupuje do centrální uhlíkové dráhy (Brilon a kol., 1981) (obrázek 4). Enzymy zodpovědné za degradaci naftalenu jsou také zodpovědné za metabolismus naftalensulfonátu (Brilon a kol., 1981; Keck a kol., 2006).
Obrázek 4. Metabolické dráhy degradace naftalensulfonátu. Čísla uvnitř kruhů představují enzymy zodpovědné za metabolismus naftylsulfonátu, podobné/identické s enzymy popsanými na obr. 3.
Nízkomolekulární PAH (LMW-PAH) jsou redukovatelné, hydrofobní a špatně rozpustné, a proto nejsou náchylné k přirozenému rozkladu/degradaci. Aerobní mikroorganismy je však dokáží oxidovat absorpcí molekulárního kyslíku (O2). Tyto enzymy patří převážně do třídy oxidoreduktáz a mohou provádět různé reakce, jako je hydroxylace aromatického kruhu (mono- nebo dihydroxylace), dehydrogenace a štěpení aromatického kruhu. Produkty získané těmito reakcemi jsou ve vyšším oxidačním stavu a snáze se metabolizují centrální uhlíkovou cestou (Phale et al., 2020). Bylo popsáno, že enzymy v degradační dráze jsou indukovatelné. Aktivita těchto enzymů je velmi nízká nebo zanedbatelná, pokud jsou buňky pěstovány na jednoduchých zdrojích uhlíku, jako je glukóza nebo organické kyseliny. Tabulka 3 shrnuje různé enzymy (oxygenázy, hydrolázy, dehydrogenázy, oxidázy atd.) zapojené do metabolismu naftalenu a jeho derivátů.
Tabulka 3. Biochemické charakteristiky enzymů zodpovědných za degradaci naftalenu a jeho derivátů.
Radioizotopové studie (18O2) ukázaly, že zabudování molekulárního O2 do aromatických kruhů oxygenázami je nejdůležitějším krokem v aktivaci další biodegradace sloučeniny (Hayaishi a kol., 1955; Mason a kol., 1955). Zabudování jednoho atomu kyslíku (O) z molekulárního kyslíku (O2) do substrátu je iniciováno buď endogenními, nebo exogenními monooxygenázami (nazývanými také hydroxylázy). Další atom kyslíku je redukován na vodu. Exogenní monooxygenázy redukují flavin pomocí NADH nebo NADPH, zatímco u endomonooxygenáz je flavin redukován substrátem. Poloha hydroxylace vede k rozmanitosti ve tvorbě produktů. Například salicylát-1-hydroxyláza hydroxyluje kyselinu salicylovou v poloze C1 za vzniku katecholu. Na druhou stranu, vícesložková salicylát-5-hydroxyláza (obsahující podjednotky reduktázy, ferredoxinu a oxygenázy) hydroxyluje kyselinu salicylovou v poloze C5 za vzniku kyseliny gentisové (Yamamoto a kol., 1965).
Dioxygenázy zabudovávají do substrátu dva atomy O2. V závislosti na vzniklých produktech se dělí na dioxygenázy hydroxylující kruh a dioxygenázy štěpící kruh. Dioxygenázy hydroxylující kruh přeměňují aromatické substráty na cis-dihydrodioly (např. naftalen) a jsou rozšířené mezi bakteriemi. Dosud bylo prokázáno, že organismy obsahující dioxygenázy hydroxylující kruh jsou schopny růst na různých zdrojích aromatického uhlíku a tyto enzymy jsou klasifikovány jako NDO (naftalen), toluendioxygenáza (TDO, toluen) a bifenyldioxygenáza (BPDO, bifenyl). NDO i BPDO mohou katalyzovat dvojitou oxidaci a hydroxylaci postranních řetězců různých polycyklických aromatických uhlovodíků (toluen, nitrotoluen, xylen, ethylbenzen, naftalen, bifenyl, fluoren, indol, methylnaftalen, naftalensulfonát, fenanthren, anthracen, acetofenon atd.) (Boyd a Sheldrake, 1998; Phale a kol., 2020). NDO je vícesložkový systém sestávající z oxidoreduktázy, ferredoxinu a oxygenázy obsahující aktivní místo (Gibson a Subramanian, 1984; Resnick a kol., 1996). Katalytická jednotka NDO se skládá z velké α podjednotky a malé β podjednotky uspořádaných v konfiguraci α3β3. NDO patří do velké rodiny oxygenáz a jeho α-podjednotka obsahuje Rieskeho místo [2Fe-2S] a mononukleární nehemový železo, které určuje substrátovou specificitu NDO (Parales et al., 1998). Typicky se v jednom katalytickém cyklu dva elektrony z redukce pyridinového nukleotidu přenesou na iont Fe(II) v aktivním místě prostřednictvím reduktázy, ferredoxinu a Rieskeho místa. Redukční ekvivalenty aktivují molekulární kyslík, což je předpokladem pro dihydroxylaci substrátu (Ferraro et al., 2005). Dosud bylo purifikováno a detailně charakterizováno pouze několik NDO z různých kmenů a genetická kontrola drah zapojených do degradace naftalenu byla detailně studována (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Dioxygenázy štěpící kruh (enzymy štěpící endo- nebo orto-kruh a enzymy štěpící exodiol- nebo meta-kruh) působí na hydroxylované aromatické sloučeniny. Například dioxygenáza štěpící orto-kruh je katechol-1,2-dioxygenáza, zatímco dioxygenáza štěpící meta-kruh je katechol-2,3-dioxygenáza (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Kromě různých oxygenáz existují také různé dehydrogenázy zodpovědné za dehydrogenaci aromatických dihydrodiolů, alkoholů a aldehydů a využívající NAD+/NADP+ jako akceptory elektronů, což jsou některé z důležitých enzymů zapojených do metabolismu (Gibson a Subramanian, 1984; Shaw a Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Enzymy, jako jsou hydrolázy (esterázy, amidázy), jsou druhou důležitou třídou enzymů, které využívají vodu ke štěpení kovalentních vazeb a vykazují širokou substrátovou specificitu. Karbarylhydroláza a další hydrolázy jsou považovány za součásti periplazmy (transmembrány) u gramnegativních bakterií (Kamini et al., 2018). Karbaryl má amidovou i esterovou vazbu, proto jej lze hydrolyzovat buď esterázou, nebo amidázou za vzniku 1-naftolu. Bylo popsáno, že karbaryl v kmeni Rhizobium rhizobium AC10023 a kmeni Arthrobacter RC100 funguje jako esteráza, respektive amidáza. Karbaryl v kmeni Arthrobacter RC100 funguje také jako amidáza. Bylo prokázáno, že RC100 hydrolyzuje čtyři insekticidy třídy N-methylkarbamátů, jako je karbaryl, methomyl, kyselina mefenamová a XMC (Hayaatsu et al., 2001). Bylo popsáno, že CH v Pseudomonas sp. C5pp může působit na karbaryl (100% aktivita) a 1-naftylacetát (36% aktivita), ale ne na 1-naftylacetamid, což naznačuje, že se jedná o esterázu (Trivedi et al., 2016).
Biochemické studie, vzorce regulace enzymů a genetická analýza ukázaly, že geny degradace naftalenu se skládají ze dvou indukovatelných regulačních jednotek neboli „operonů“: nah („upstream dráha“, přeměňující naftalen na kyselinu salicylovou) a sal („downstream dráha“, přeměňující kyselinu salicylovou na centrální uhlíkovou dráhu prostřednictvím katecholu). Kyselina salicylová a její analogy mohou působit jako induktory (Shamsuzzaman a Barnsley, 1974). V přítomnosti glukózy nebo organických kyselin je operon potlačen. Obrázek 5 ukazuje kompletní genetickou organizaci degradace naftalenu (ve formě operonu). Bylo popsáno několik pojmenovaných variant/forem genu nah (ndo/pah/dox) a bylo zjištěno, že mají vysokou sekvenční homologii (90 %) u všech druhů Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Geny upstream dráhy naftalenu byly obecně uspořádány v konsenzuálním pořadí, jak je znázorněno na obrázku 5A. Další gen, nahQ, byl také popsán jako gen zapojený do metabolismu naftalenu a obvykle se nacházel mezi nahC a nahE, ale jeho skutečná funkce je stále objasněna. Podobně byl gen nahY, zodpovědný za chemotaxi citlivou na naftalen, u některých členů nalezen na distálním konci nah operonu. U Ralstonia sp. byl gen U2 kódující glutathion-S-transferázu (gsh) umístěn mezi nahAa a nahAb, ale neovlivnil charakteristiky využití naftalenu (Zylstra et al., 1997).
Obrázek 5. Genetická organizace a diverzita pozorovaná během degradace naftalenu u bakteriálních druhů; (A) Horní naftalenová dráha, metabolismus naftalenu na kyselinu salicylovou; (B) Dolní naftalenová dráha, kyselina salicylová přes katechol k centrální uhlíkové dráze; (C) kyselina salicylová přes gentisát k centrální uhlíkové dráze.
„Nižší dráha“ (sal operon) se typicky skládá z nahGTHINLMOKJ a přeměňuje salicylát na pyruvát a acetaldehyd prostřednictvím dráhy štěpení katechol metaringu. Bylo zjištěno, že gen nahG (kódující salicyláthydroxylázu) je konzervován na proximálním konci operonu (obr. 5B). Ve srovnání s jinými kmeny degradujícími naftalen jsou u P. putida CSV86 operony nah a sal tandemové a velmi blízce příbuzné (přibližně 7,5 kb). U některých gramnegativních bakterií, jako je Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 a P. putida AK5, je naftalen metabolizován jako centrální uhlíkový metabolit prostřednictvím gentisátové dráhy (ve formě sgp/nag operonu). Genová kazeta je typicky reprezentována ve formě nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, kde nagR (kódující regulátor typu LysR) se nachází na horním konci (obrázek 5C).
Karbaryl vstupuje do centrálního uhlíkového cyklu metabolismem 1-naftolu, 1,2-dihydroxynaftalenu, kyseliny salicylové a kyseliny gentisové (obrázek 3). Na základě genetických a metabolických studií bylo navrženo rozdělit tuto dráhu na „upstream“ (přeměna karbarylu na kyselinu salicylovou), „střední“ (přeměna kyseliny salicylové na kyselinu gentisovou) a „downstream“ (přeměna kyseliny gentisové na meziprodukty centrální uhlíkové dráhy) (Singh et al., 2013). Genomická analýza C5pp (superkontig A, 76,3 kb) ukázala, že gen mcbACBDEF se podílí na přeměně karbarylové skupiny na kyselinu salicylovou, následovaný genem mcbIJKL v přeměně kyseliny salicylové na kyselinu gentisovou a genem mcbOQP v přeměně kyseliny gentisové na meziprodukty s centrálním uhlíkem (fumarát a pyruvát, Trivedi et al., 2016) (obrázek 6).
Bylo zjištěno, že enzymy zapojené do degradace aromatických uhlovodíků (včetně naftalenu a kyseliny salicylové) mohou být indukovány odpovídajícími sloučeninami a inhibovány jednoduchými zdroji uhlíku, jako je glukóza nebo organické kyseliny (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Mezi různými metabolickými cestami naftalenu a jeho derivátů byly do určité míry studovány regulační vlastnosti naftalenu a karbarylu. U naftalenu jsou geny v obou metabolických drahách, jak v upstreamových, tak v downstreamových, regulovány NahR, což je trans-působící pozitivní regulátor typu LysR. Je nezbytný pro indukci genu nah kyselinou salicylovou a jeho následnou expresi na vysoké úrovni (Yen a Gunsalus, 1982). Studie dále ukázaly, že integrativní hostitelský faktor (IHF) a XylR (sigma 54-dependentní transkripční regulátor) jsou také kritické pro transkripční aktivaci genů v metabolismu naftalenu (Ramos et al., 1997). Studie ukázaly, že enzymy dráhy otevírání katecholového meta-kruhu, konkrétně katechol-2,3-dioxygenáza, jsou indukovány v přítomnosti naftalenu a/nebo kyseliny salicylové (Basu a kol., 2006). Studie ukázaly, že enzymy dráhy otevírání katecholového ortho-kruhu, konkrétně katechol-1,2-dioxygenáza, jsou indukovány v přítomnosti kyseliny benzoové a cis,cis-mukonátu (Parsek a kol., 1994; Tover a kol., 2001).
V kmeni C5pp kóduje pět genů, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR a mcbS, regulátory patřící do rodiny transkripčních regulátorů LysR/TetR zodpovědných za kontrolu degradace karbarylu. Bylo zjištěno, že homologní gen mcbG je nejvíce příbuzný regulátoru typu LysR PhnS (58% identita aminokyselin) zapojenému do metabolismu fenanthrenu u Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Bylo zjištěno, že gen mcbH je zapojen do mezilehlé dráhy (konverze kyseliny salicylové na kyselinu gentisovou) a patří do transkripčního regulátoru typu LysR NagR/DntR/NahR u Pseudomonas a Burkholderia. Bylo popsáno, že členové této čeledi rozpoznávají kyselinu salicylovou jako specifickou efektorovou molekulu pro indukci degradačních genů. Na druhou stranu byly v downstreamové dráze (metabolity gentisát-centrální uhlíkové dráhy) identifikovány tři geny, mcbN, mcbR a mcbS, patřící k transkripčním regulátorům typu LysR a TetR.
U prokaryot jsou horizontální procesy přenosu genů (získávání, výměna nebo přenos) prostřednictvím plazmidů, transpozonů, profágů, genomových ostrovů a integračních konjugačních elementů (ICE) hlavními příčinami plasticity v bakteriálních genomech, což vede k získání nebo ztrátě specifických funkcí/znaků. Umožňují bakteriím rychle se přizpůsobit různým podmínkám prostředí, což hostiteli poskytuje potenciální adaptivní metabolické výhody, jako je degradace aromatických sloučenin. Metabolických změn se často dosahuje jemným doladěním degradačních operonů, jejich regulačních mechanismů a enzymatických specificit, což usnadňuje degradaci širší škály aromatických sloučenin (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Bylo zjištěno, že genové kazety pro degradaci naftalenu se nacházejí na různých mobilních elementech, jako jsou plazmidy (konjugační a nekonjugační), transpozony, genomy, ICE a kombinace různých bakteriálních druhů (obrázek 5). U Pseudomonas G7 jsou operony nah a sal plazmidu NAH7 transkribovány ve stejné orientaci a jsou součástí defektního transpozonu, který pro mobilizaci vyžaduje transpozázu Tn4653 (Sota et al., 2006). U kmene Pseudomonas NCIB9816-4 byl gen nalezen na konjugativním plazmidu pDTG1 jako dva operony (přibližně 15 kb od sebe), které byly transkribovány v opačných směrech (Dennis a Zylstra, 2004). U kmene Pseudomonas putida AK5 kóduje nekonjugativní plazmid pAK5 enzym zodpovědný za degradaci naftalenu gentisátovou dráhou (Izmalkova et al., 2013). U kmene Pseudomonas PMD-1 je operon nah umístěn na chromozomu, zatímco operon sal se nachází na konjugativním plazmidu pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). U Pseudomonas stutzeri AN10 se však všechny geny pro degradaci naftalenu (operony nah a sal) nacházejí na chromozomu a pravděpodobně jsou získávány transpozicí, rekombinací a přeskupením (Bosch et al., 2000). U Pseudomonas sp. CSV86 se operony nah a sal nacházejí v genomu ve formě ICE (ICECSV86). Struktura je chráněna tRNAGly, po níž následují přímé repetice indikující rekombinační/vazebná místa (attR a attL) a fágová integráza umístěná na obou koncích tRNAGly, a je tedy strukturálně podobná elementu ICEclc (ICEclcB13 u Pseudomonas knackmusii pro degradaci chlorkatecholu). Bylo popsáno, že geny na ICE lze přenášet konjugací s extrémně nízkou frekvencí přenosu (10-8), čímž se degradační vlastnosti přenášejí na příjemce (Basu a Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Většina genů zodpovědných za degradaci karbarylu se nachází na plazmidech. Arthrobacter sp. RC100 obsahuje tři plazmidy (pRC1, pRC2 a pRC300), z nichž dva konjugační plazmidy, pRC1 a pRC2, kódují enzymy, které přeměňují karbaryl na gentisát. Na druhou stranu enzymy zapojené do přeměny gentisátu na centrální uhlíkové metabolity se nacházejí na chromozomu (Hayaatsu et al., 1999). Bakterie rodu Rhizobium. Kmen AC100, používaný pro přeměnu karbarylu na 1-naftol, obsahuje plazmid pAC200, který nese gen cehA kódující CH jako součást transpozonu Tnceh obklopený sekvencemi podobnými inzerčním elementům (istA a istB) (Hashimoto et al., 2002). U kmene Sphingomonas CF06 se předpokládá, že gen pro degradaci karbaryl-substituované skupiny je přítomen v pěti plazmidech: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 a pCF05. DNA homologie těchto plazmidů je vysoká, což naznačuje existenci duplikace genu (Feng et al., 1997). U symbiontu degradujícího karbaryl-substituovanou skupinou, složeného ze dvou druhů Pseudomonas, obsahuje kmen 50581 konjugační plazmid pCD1 (50 kb) kódující gen pro karbaryl-hydrolázu mcd, zatímco konjugační plazmid u kmene 50552 kóduje enzym degradující 1-naftol (Chapalamadugu a Chaudhry, 1991). U kmene Achromobacter WM111 je gen pro furadan-hydrolázu mcd umístěn na plazmidu o velikosti 100 kb (pPDL11). Bylo prokázáno, že tento gen je přítomen na různých plazmidech (100, 105, 115 nebo 124 kb) v různých bakteriích z různých geografických oblastí (Parekh et al., 1995). U Pseudomonas sp. C5pp se všechny geny zodpovědné za degradaci karbarylu nacházejí v genomu o délce 76,3 kb (Trivedi et al., 2016). Analýza genomu (6,15 Mb) odhalila přítomnost 42 MGE a 36 GEI, z nichž 17 MGE se nacházelo v superkontigu A (76,3 kb) s průměrným asymetrickým obsahem G+C (54–60 mol %), což naznačuje možné horizontální přenosy genů (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 vykazuje podobné uspořádání genů degradujících karbaryl, ale tyto geny jsou umístěny na plazmidu (Zhu et al., 2019).
Kromě metabolické účinnosti na biochemické a genomické úrovni vykazují mikroorganismy také další vlastnosti nebo reakce, jako je chemotaxe, modifikace buněčného povrchu, kompartmentalizace, preferenční využití, produkce biosurfaktantů atd., které jim pomáhají efektivněji metabolizovat aromatické polutanty v kontaminovaném prostředí (obrázek 7).
Obrázek 7. Různé strategie buněčné odpovědi ideálních bakterií degradujících aromatické uhlovodíky pro efektivní biodegradaci cizích znečišťujících sloučenin.
Chemotaktické reakce jsou považovány za faktory zvyšující degradaci organických polutantů v heterogenně znečištěných ekosystémech. (2002) prokázali, že chemotaxe Pseudomonas sp. G7 na naftalen zvyšuje rychlost degradace naftalenu ve vodních systémech. Kmen divokého typu G7 degradoval naftalen mnohem rychleji než mutantní kmen s deficitem chemotaxe. Bylo zjištěno, že protein NahY (538 aminokyselin s membránovou topologií) je kotranskribován s geny metaštěpné dráhy na plazmidu NAH7 a podobně jako převodníky chemotaxe se zdá, že tento protein funguje jako chemoreceptor pro degradaci naftalenu (Grimm a Harwood 1997). Další studie Hansela a kol. (2009) ukázala, že protein je chemotaktický, ale jeho rychlost degradace je vysoká. (2011) prokázali chemotaktickou reakci Pseudomonas (P. putida) na plynný naftalen, kde difúze v plynné fázi vedla ke stálému toku naftalenu do buněk, což řídilo chemotaktickou reakci buněk. Vědci využili tohoto chemotaktického chování k vytvoření mikrobů, které by zvýšily rychlost degradace. Studie ukázaly, že chemosenzorické dráhy regulují i ​​další buněčné funkce, jako je buněčné dělení, regulace buněčného cyklu a tvorba biofilmu, čímž pomáhají kontrolovat rychlost degradace. Využití této vlastnosti (chemotaxe) pro efektivní degradaci je však brzděno několika úzkými místy. Hlavními překážkami jsou: (a) různé paralogní receptory rozpoznávají stejné sloučeniny/ligandy; (b) existence alternativních receptorů, tj. energetický tropismus; (c) významné sekvenční rozdíly v senzorických doménách stejné receptorové rodiny; a (d) nedostatek informací o hlavních bakteriálních senzorových proteinech (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Někdy biodegradace aromatických uhlovodíků produkuje více metabolitů/meziproduktů, které mohou být chemotaktické pro jednu skupinu bakterií, ale pro jiné odpudivé, což proces dále komplikuje. Pro identifikaci interakcí ligandů (aromatických uhlovodíků) s chemickými receptory jsme zkonstruovali hybridní senzorové proteiny (PcaY, McfR a NahY) fúzí senzorových a signálních domén Pseudomonas putida a Escherichia coli, které cílí na receptory pro aromatické kyseliny, meziprodukty TCA a naftalen (Luu et al., 2019).
Pod vlivem naftalenu a dalších polycyklických aromatických uhlovodíků (PAH) dochází ke významným změnám ve struktuře bakteriální membrány a integritě mikroorganismů. Studie ukázaly, že naftalen narušuje interakci acylového řetězce prostřednictvím hydrofobních interakcí, čímž zvyšuje bobtnání a tekutost membrány (Sikkema et al., 1995). Aby bakterie tomuto škodlivému účinku čelily, regulují tekutost membrány změnou poměru a složení mastných kyselin mezi iso/anteiso mastnými kyselinami s rozvětveným řetězcem a izomerací cis-nenasycených mastných kyselin na odpovídající trans-izomery (Heipieper a de Bont, 1994). U Pseudomonas stutzeri pěstovaných na naftalenu se poměr nasycených a nenasycených mastných kyselin zvýšil z 1,1 na 2,1, zatímco u Pseudomonas JS150 se tento poměr zvýšil ze 7,5 na 12,0 (Mrozik et al., 2004). Při pěstování na naftalenu vykazovaly buňky Achromobacter KAs 3–5 agregaci buněk kolem krystalů naftalenu a pokles povrchového náboje buněk (z -22,5 na -2,5 mV) doprovázený cytoplazmatickou kondenzací a vakuolizací, což naznačuje změny v buněčné struktuře a vlastnostech buněčného povrchu (Mohapatra et al., 2019). Ačkoli buněčné/povrchové změny jsou přímo spojeny s lepším příjmem aromatických polutantů, relevantní bioinženýrské strategie nebyly dosud důkladně optimalizovány. Manipulace s tvarem buněk byla zřídka používána k optimalizaci biologických procesů (Volke a Nikel, 2018). Delece genů ovlivňujících buněčné dělení způsobuje změny v buněčné morfologii. Delece genů ovlivňujících buněčné dělení způsobuje změny v buněčné morfologii. U Bacillus subtilis bylo prokázáno, že protein buněčného septa SepF se podílí na tvorbě septa a je nezbytný pro následné kroky buněčného dělení, ale nejedná se o esenciální gen. Delece genů kódujících peptidové glykanhydrolázy u Bacillus subtilis vedla k prodloužení buněk, zvýšení specifické rychlosti růstu a zlepšení produkční kapacity enzymů (Cui et al., 2018).
Pro dosažení účinné degradace kmenů Pseudomonas C5pp a C7 byla navržena kompartmentalizace dráhy degradace karbarylu (Kamini et al., 2018). Předpokládá se, že karbaryl je transportován do periplazmatického prostoru přes septum vnější membrány a/nebo prostřednictvím difuzibilních porinů. CH je periplazmatický enzym, který katalyzuje hydrolýzu karbarylu na 1-naftol, který je stabilnější, hydrofobnější a toxičtější. CH je lokalizován v periplazmě a má nízkou afinitu ke karbarylu, čímž řídí tvorbu 1-naftolu, čímž zabraňuje jeho akumulaci v buňkách a snižuje jeho toxicitu pro buňky (Kamini et al., 2018). Výsledný 1-naftol je transportován do cytoplazmy přes vnitřní membránu rozdělením a/nebo difuzí a poté je hydroxylován na 1,2-dihydroxynaftalen vysoce afinitním enzymem 1NH pro další metabolismus v centrální uhlíkové dráze.
Ačkoli mikroorganismy mají genetické a metabolické schopnosti degradovat xenobiotické zdroje uhlíku, hierarchická struktura jejich využití (tj. preferenční využití jednoduchých zdrojů uhlíku před komplexními) je hlavní překážkou biodegradace. Přítomnost a využití jednoduchých zdrojů uhlíku snižuje regulaci genů kódujících enzymy, které degradují komplexní/nepreferované zdroje uhlíku, jako jsou PAH. Dobře prostudovaným příkladem je, že když je Escherichia coli současně krmena glukózou a laktózou, glukóza je využívána efektivněji než laktóza (Jacob a Monod, 1965). Bylo popsáno, že Pseudomonas degraduje řadu PAH a xenobiotických sloučenin jako zdroje uhlíku. Hierarchie využití zdrojů uhlíku u Pseudomonas je organické kyseliny > glukóza > aromatické sloučeniny (Hylemon a Phibbs, 1972; Collier a kol., 1996). Existuje však výjimka. Je zajímavé, že Pseudomonas sp. CSV86 vykazuje unikátní hierarchickou strukturu, která přednostně využívá aromatické uhlovodíky (kyselinu benzoovou, naftalen atd.) před glukózou a kometabolizuje aromatické uhlovodíky s organickými kyselinami (Basu et al., 2006). U této bakterie nejsou geny pro degradaci a transport aromatických uhlovodíků downregulovány ani v přítomnosti druhého zdroje uhlíku, jako je glukóza nebo organické kyseliny. Při pěstování v médiu s glukózou a aromatickými uhlovodíky bylo pozorováno, že geny pro transport a metabolismus glukózy byly downregulovány, aromatické uhlovodíky byly využívány v první logaritmické fázi a glukóza byla využívána ve druhé logaritmické fázi (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Na druhou stranu přítomnost organických kyselin neovlivnila expresi metabolismu aromatických uhlovodíků, takže se očekává, že tato bakterie bude kandidátským kmenem pro studie biodegradace (Phale et al., 2020).
Je dobře známo, že biotransformace uhlovodíků může způsobit oxidační stres a zvýšenou regulaci antioxidačních enzymů v mikroorganismech. Neefektivní biodegradace naftalenu jak ve stacionární fázi buněk, tak v přítomnosti toxických sloučenin vede k tvorbě reaktivních forem kyslíku (ROS) (Kang et al. 2006). Vzhledem k tomu, že enzymy degradující naftalen obsahují železo-sirné klastry, za oxidačního stresu se železo v hemu a železo-sirných proteinech oxiduje, což vede k inaktivaci proteinů. Ferredoxin-NADP+ reduktáza (Fpr) spolu se superoxiddismutázou (SOD) zprostředkovává reverzibilní redoxní reakci mezi NADP+/NADPH a dvěma molekulami ferredoxinu nebo flavodoxinu, čímž zachycuje ROS a obnovuje železo-sirné centrum za oxidačního stresu (Li et al. 2006). Bylo hlášeno, že jak Fpr, tak SodA (SOD) u Pseudomonas mohou být indukovány oxidačním stresem a u čtyř kmenů Pseudomonas (O1, W1, As1 a G1) byla pozorována zvýšená aktivita SOD a katalázy během růstu za podmínek přídavku naftalenu (Kang et al., 2006). Studie ukázaly, že přidání antioxidantů, jako je kyselina askorbová nebo železnaté železo (Fe2+), může zvýšit rychlost růstu naftalenu. Když Rhodococcus erythropolis rostl v naftalenovém médiu, zvýšila se transkripce genů cytochromu P450 souvisejících s oxidačním stresem, včetně sodA (Fe/Mn superoxiddismutáza), sodC (Cu/Zn superoxiddismutáza) a recA (Sazykin et al., 2019). Srovnávací kvantitativní proteomická analýza buněk Pseudomonas kultivovaných v naftalenu ukázala, že zvýšená regulace různých proteinů spojených s reakcí na oxidační stres je strategií zvládání stresu (Herbst et al., 2013).
Bylo popsáno, že mikroorganismy produkují biosurfaktanty působením hydrofobních zdrojů uhlíku. Tyto surfaktanty jsou amfifilní povrchově aktivní sloučeniny, které mohou tvořit agregáty na rozhraní olej-voda nebo vzduch-voda. To podporuje pseudo-solubilizaci a usnadňuje adsorpci aromatických uhlovodíků, což vede k efektivní biodegradaci (Rahman et al., 2002). Díky těmto vlastnostem se biosurfaktanty široce používají v různých průmyslových odvětvích. Přidání chemických surfaktantů nebo biosurfaktantů do bakteriálních kultur může zvýšit účinnost a rychlost degradace uhlovodíků. Mezi biosurfaktanty byly rozsáhle studovány a charakterizovány rhamnolipidy produkované Pseudomonas aeruginosa (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Mezi další typy biosurfaktantů patří lipopeptidy (muciny z Pseudomonas fluorescens), emulgátor 378 (z Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg a Ron, 1999), trehalózadisacharidové lipidy z Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lichenin z Bacillus (Saraswathy a Hallberg, 2002) a surfaktant z Bacillus subtilis (Siegmund a Wagner, 1991) a Bacillus amyloliquefaciens (Zhi a kol., 2017). Bylo prokázáno, že tyto silné surfaktanty snižují povrchové napětí ze 72 dyn/cm na méně než 30 dyn/cm, což umožňuje lepší absorpci uhlovodíků. Bylo hlášeno, že Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia a další bakteriální druhy mohou produkovat různé biosurfaktanty na bázi rhamnolipidů a glykolipidů, pokud jsou pěstovány v naftalenovém a methylnaftalenovém médiu (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 může produkovat extracelulární biosurfaktant Biosur-Pm, pokud je pěstován na aromatických sloučeninách, jako je kyselina naftoová (Phale et al., 1995). Kinetika tvorby Biosur-Pm ukázala, že jeho syntéza je proces závislý na růstu a pH. Bylo zjištěno, že množství Biosur-Pm produkované buňkami při neutrálním pH bylo vyšší než při pH 8,5. Buňky pěstované při pH 8,5 byly hydrofobnější a měly vyšší afinitu k aromatickým a alifatickým sloučeninám než buňky pěstované při pH 7,0. U Rhodococcus spp. N6, vyšší poměr uhlíku k dusíku (C:N) a omezení železa jsou optimálními podmínkami pro produkci extracelulárních biosurfaktantů (Mutalik et al., 2008). Byly učiněny pokusy o zlepšení biosyntézy biosurfaktantů (surfaktinů) optimalizací kmenů a fermentace. Titr surfaktantu v kultivačním médiu je však nízký (1,0 g/l), což představuje výzvu pro velkovýrobu (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Proto se ke zlepšení jeho biosyntézy používají metody genetického inženýrství. Jeho inženýrská modifikace je však obtížná kvůli velké velikosti operonu (∼25 kb) a komplexní biosyntetické regulaci systému quorum sensing (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). U bakterií Bacillus byla provedena řada geneticky modifikovaných metod, jejichž hlavním cílem bylo zvýšení produkce surfaktinu nahrazením promotoru (operonu srfA), nadměrnou expresí proteinu YerP pro export surfaktinu a regulačních faktorů ComX a PhrC (Jiao et al., 2017). Tyto metody genetického inženýrství však dosáhly pouze jedné nebo několika málo genetických modifikací a dosud nedosáhly komerční produkce. Proto je nutné další studium optimalizačních metod založených na znalostech.
Studie biodegradace PAH se provádějí převážně za standardních laboratorních podmínek. Nicméně na kontaminovaných místech nebo v kontaminovaném prostředí bylo prokázáno, že mnoho abiotických a biotických faktorů (teplota, pH, kyslík, dostupnost živin, biologická dostupnost substrátu, další xenobiotika, inhibice konečných produktů atd.) mění a ovlivňuje degradační kapacitu mikroorganismů.
Teplota má významný vliv na biodegradaci PAH. S rostoucí teplotou klesá koncentrace rozpuštěného kyslíku, což ovlivňuje metabolismus aerobních mikroorganismů, protože ty potřebují molekulární kyslík jako jeden ze substrátů pro oxygenázy, které provádějí hydroxylaci nebo štěpení kruhu. Často se uvádí, že zvýšená teplota přeměňuje původní PAH na toxičtější sloučeniny, čímž inhibuje biodegradaci (Muller a kol., 1998).
Bylo zjištěno, že mnoho lokalit kontaminovaných PAH má extrémní hodnoty pH, jako například lokality kontaminované kyselými důlními odvodněními (pH 1–4) a lokality zplyňování zemního plynu/uhlí kontaminované alkalickým výluhem (pH 8–12). Tyto podmínky mohou vážně ovlivnit proces biodegradace. Proto se před použitím mikroorganismů pro bioremediaci doporučuje upravit pH přidáním vhodných chemikálií (se středním až velmi nízkým oxidačně-redukčním potenciálem), jako je síran amonný nebo dusičnan amonný pro alkalické půdy nebo vápnění uhličitanem vápenatým nebo uhličitanem hořečnatým pro kyselé lokality (Bowlen a kol. 1995; Gupta a Sar 2020).
Dodávka kyslíku do postižené oblasti je faktorem limitujícím rychlost biodegradace PAH. Vzhledem k redoxním podmínkám prostředí obvykle vyžadují procesy bioremediace in situ přísun kyslíku z externích zdrojů (orba, probublávání vzduchem a přidávání chemikálií) (Pardieck a kol., 1992). Odenkranz a kol. (1996) prokázali, že přidání peroxidu hořečnatého (sloučeniny uvolňující kyslík) do kontaminované zvodnělé vrstvy by mohlo účinně bioremediaovat sloučeniny BTEX. Jiná studie zkoumala degradaci fenolu a BTEX in situ v kontaminované zvodnělé vrstvě vstřikováním dusičnanu sodného a výstavbou extrakčních vrtů za účelem dosažení účinné bioremediace (Bewley a Webb, 2001).