Současnost *Aktuální adresa: Kolín nad Rýnem 50931, Německo, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-Related Diseases (CECAD).
Neurodegenerace mitochondriálních onemocnění je považována za nevratnou, protože metabolická plasticita neuronů je omezená, ale vliv mitochondriální dysfunkce na buněčnou autonomii neuronálního metabolismu v těle je špatně pochopen. Zde představujeme buněčně specifický proteom Purkyňových neuronů s progresivním deficitem OXPHOS způsobeným narušenou dynamikou mitochondriální fúze. Zjistili jsme, že mitochondriální dysfunkce spustila hlubokou změnu v oblasti proteomiky, která nakonec vedla k sekvenční aktivaci přesných metabolických programů před buněčnou smrtí. Neočekávaně jsme zjistili zjevnou indukci pyruvátkarboxylázy (PCx) a dalších enzymů proti stárnutí, které doplňují meziprodukty cyklu TCA. Inhibice PCx zhoršila oxidační stres a neurodegeneraci, což naznačuje, že ateroskleróza má ochranný účinek u neuronů, kterým chybí OXPHOS. Obnova mitochondriální fúze v terminálně degenerovaných neuronech tyto metabolické charakteristiky zcela obrací, a tím zabraňuje buněčné smrti. Naše zjištění identifikují dříve neznámé dráhy, které propůjčují mitochondriální dysfunkci odolnost, a ukazují, že neurodegeneraci lze zvrátit i v pozdních stádiích onemocnění.
Ústřední roli mitochondrií v udržování neuronálního energetického metabolismu zdůrazňují rozsáhlé neurologické symptomy spojené s lidskými mitochondriálními onemocněními. Většina těchto onemocnění je způsobena genovými mutacemi, které regulují expresi mitochondriálních genů (1, 2) nebo destrukcí genů související s dynamikou mitochondrií, což nepřímo ovlivňuje stabilitu mitochondriální DNA (mtDNA) (3, 4). Práce na zvířecích modelech ukázala, že v reakci na mitochondriální dysfunkci v okolních tkáních mohou být aktivovány konzervativní metabolické dráhy (5-7), což poskytuje důležité informace pro hlubší pochopení patogeneze těchto komplexních onemocnění. Naproti tomu je naše chápání metabolických změn specifických typů buněk způsobených obecným selháním produkce adenosintrifosfátu (ATP) v mozku zásadní (8), což zdůrazňuje potřebu identifikace terapeutických cílů, které lze použít k prevenci nebo předcházení onemocnění. Prevence neurodegenerace (9). Nedostatek informací spočívá ve skutečnosti, že nervové buňky jsou všeobecně považovány za buňky s velmi omezenou metabolickou flexibilitou ve srovnání s typy buněk okolních tkání (10). Vzhledem k tomu, že tyto buňky hrají ústřední roli v koordinaci dodávek metabolitů neuronům za účelem podpory synaptické transmise a reakce na poranění a onemocnění, je schopnost přizpůsobit buněčný metabolismus náročným podmínkám mozkové tkáně téměř omezena na gliové buňky (11-14). Inherentní buněčná heterogenita mozkové tkáně navíc do značné míry brání studiu metabolických změn, ke kterým dochází ve specifických neuronálních podskupinách. V důsledku toho je o přesných buněčných a metabolických důsledcích mitochondriální dysfunkce v neuronech známo jen málo.
Abychom pochopili metabolické důsledky mitochondriální dysfunkce, izolovali jsme Purkyňovy neurony (PN) v různých stádiích neurodegenerace způsobené destrukcí fúze vnější membrány mitochondrií (Mfn2). Ačkoli jsou mutace Mfn2 u lidí spojeny s formou hereditární motorické senzorické neuropatie známé jako Charcot-Marie-Tooth typ 2A (15), podmíněná destrukce Mfn2 u myší je dobře známou metodou indukce dysfunkce oxidace a fosforylace (OXPHOS). Různé neuronální podtypy (16-19) a výsledný neurodegenerativní fenotyp jsou doprovázeny progresivními neurologickými příznaky, jako jsou poruchy pohybu (18, 19) nebo cerebelární ataxie (16). Použitím kombinace kvantitativní (LFQ) proteomiky bez značení, metabolomiky, zobrazovacích a virologických metod ukazujeme, že progresivní neurodegenerace silně indukuje pyruvátkarboxylázu (PCx) a další faktory zapojené do arteriosklerózy PN in vivo. Exprese enzymů. Abychom ověřili relevanci tohoto zjištění, specificky jsme downregulovali expresi PCx u neuroneuroscientních buněk s deficitem Mfn2 a zjistili jsme, že tato operace zhoršila oxidační stres a urychlila neurodegeneraci, což dokazuje, že azoospermie způsobuje buněčnou smrt. Metabolická adaptabilita. Silná exprese MFN2 může zcela zachránit terminální degenerativní buňky s těžkým deficitem OXPHOS, masivní spotřebou mitochondriální DNA a zdánlivě narušenou mitochondriální sítí, což dále zdůrazňuje, že tato forma neurodegenerace se může zotavit i v pokročilém stádiu onemocnění před buněčnou smrtí.
Abychom vizualizovali mitochondrie v neuronálních buňkách s knockoutem Mfn2, použili jsme myší kmen, který umožňuje Cre-dependentním mitochondriím cílit expresi žlutého fluorescenčního proteinu (YFP) (mtYFP) (20) Cre a in vivo jsme ověřili mitochondriální morfologii. Zjistili jsme, že destrukce genu Mfn2 v neuronálních buňkách vede k postupnému dělení mitochondriální sítě (obrázek S1A) a nejranější změna byla zjištěna ve 3 týdnech věku. Naproti tomu podstatná degenerace vrstvy buněk neuronálních buněk, o čemž svědčí ztráta imunobarvení kalbindinem, nezačala dříve než ve 12 týdnech věku (obrázek 1, A a B). Časový nesoulad mezi nejranějšími změnami v mitochondriální morfologii a viditelným nástupem neuronální smrti nás vedl k prozkoumání metabolických změn vyvolaných mitochondriální dysfunkcí před buněčnou smrtí. Vyvinuli jsme strategii založenou na fluorescenčně aktivovaném buněčném třídění (FACS) pro izolaci PN exprimujících YFP (YFP+) (obrázek 1C) a u kontrolních myší (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP: :L7-cre), dále označovanou jako CTRL (obrázek S1B). Optimalizace strategie hradlování založená na relativní intenzitě signálu YFP nám umožňuje purifikovat tělísko YFP+ (YFPhigh) PN od ne-PN (YFPneg) (obrázek S1B) nebo od předpokládaných fluorescenčních axonálních/dendritických fragmentů (YFPlow; obrázek S1D, vlevo), což bylo potvrzeno konfokálním mikroskopem (obrázek S1D, vpravo). Abychom ověřili identitu klasifikované populace, provedli jsme LFQ proteomiku a poté analýzu hlavních komponent a zjistili jsme, že existuje jasné oddělení mezi buňkami YFPhigh a YFPneg (obrázek S1C). Buňky YFPhigh vykazovaly čisté obohacení známých markerů PN (tj. Calb1, Pcp2, Grid2 a Itpr3) (21, 22), ale žádné obohacení proteinů běžně exprimovaných v neuronech nebo jiných typech buněk (obrázek 1D). Porovnání vzorků v klasifikovaných buňkách YFPhigh odebraných v nezávislých experimentech ukázalo korelační koeficient > 0,9, což dokazuje dobrou reprodukovatelnost mezi biologickými replikáty (obrázek S1E). Stručně řečeno, tato data potvrdila náš plán pro akutní a specifickou izolaci proveditelných PN. Protože použitý systém driveru L7-cre indukuje mozaikovou rekombinaci v prvním týdnu po porodu (23), začali jsme s vyřazováním myší z CTRL a s podmíněným (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) sběrem neuronů. Po dokončení rekombinace se to nazývá Mfn2cKO ve věku 4 týdnů. Jako koncový bod jsme zvolili 8 týdnů věku, kdy byla PN vrstva intaktní i přes zjevnou mitochondriální fragmentaci (obrázek 1B a obrázek S1A). Celkem jsme kvantifikovali celkem 3013 proteinů, z nichž přibližně 22 % bylo založeno na anotacích MitoCarta 2.0 založených na mitochondriálním proteomu jako mitochondriích (obrázek 1E) (obrázek 1E) (24). Analýza diferenciální genové exprese provedená v 8. týdnu ukázala, že pouze 10,5 % všech proteinů mělo významné změny (obrázek 1F a obrázek S1F), z nichž 195 proteinů bylo down-regulováno a 120 proteinů up-regulováno (obrázek 1F). Za zmínku stojí, že „analýza inovativních drah“ této datové sady ukazuje, že diferenciálně exprimované geny patří převážně do omezeného souboru specifických metabolických drah (obrázek 1G). Je zajímavé, že ačkoli downregulace drah souvisejících s OXPHOS a kalciovou signalizací potvrzuje indukci mitochondriální dysfunkce u PN s deficitem fúze, jiné kategorie, které zahrnují hlavně metabolismus aminokyselin, jsou významně upregulovány, což je v souladu s metabolismem, ke kterému dochází u mitochondriálních PN. Rewiring je konzistentní. dysfunkce.
(A) Reprezentativní konfokální fotografie mozečkových řezů myší CTRL a Mfn2cKO vykazující progresivní ztrátu PN (kalbindin, šedá); jádra byla kontrastně barvena DAPI. (B) Kvantifikace (A) (jednosměrná analýza rozptylu, ***P<0,001; n = 4 až 6 kruhů od tří myší). (C) Experimentální postup. (D) Distribuce markerů specifických pro Purkyňovy choroby (nahoře) a další typy buněk na tepelné mapě (uprostřed). (E) Vennův diagram znázorňující počet mitochondriálních proteinů identifikovaných v klasifikované PN. (F) Volcano plot diferencovaně exprimovaných proteinů v neuronech Mfn2cKO po 8 týdnech (hraniční hodnota významnosti 1,3). (G) Analýza drah kreativity ukazuje pět nejdůležitějších drah up-regulace (červená) a down-regulace (modrá) v Mfn2cKO PN klasifikované jako 8 týdnů. Je zobrazena průměrná hladina exprese každého detekovaného proteinu. Tepelná mapa ve stupních šedi: upravená hodnota P. ns, není důležité.
Proteomická data ukázala, že exprese proteinů komplexů I, III a IV postupně klesala. Komplexy I, III a IV všechny obsahovaly esenciální podjednotky kódované mtDNA, zatímco komplex II, který byl kódován pouze jaderně, zůstal v podstatě nedotčen (obrázek 2A a obrázek S2A). V souladu s výsledky proteomiky imunohistochemie řezů tkáně mozečku ukázala, že hladina podjednotky MTCO1 (podjednotka 1 mitochondriální cytochrom C oxidázy) komplexu IV v PN postupně klesala (obrázek 2B). Podjednotka Mtatp8 kódovaná mtDNA byla významně snížena (obrázek S2A), zatímco ustálená hladina podjednotky ATP syntázy kódované jaderně zůstala nezměněna, což je v souladu se známým stabilním komplexem podsestavy ATP syntázy F1, když je exprese mtDNA stabilní. Tvorba je konzistentní. Přerušení (7). Vyhodnocení hladiny mtDNA v tříděných PN Mfn2cKO pomocí polymerázové řetězové reakce v reálném čase (qPCR) potvrdilo postupný pokles počtu kopií mtDNA. Ve srovnání s kontrolní skupinou bylo v 8 týdnech věku zachováno pouze asi 20 % hladiny mtDNA (obrázek 2C). V souladu s těmito výsledky bylo k detekci DNA použito konfokální mikroskopické barvení Mfn2cKO PN, které ukázalo časově závislou spotřebu mitochondriálních nukleotidů (obrázek 2D). Zjistili jsme, že pouze někteří kandidáti zapojení do degradace mitochondriálních proteinů a stresové reakce byli upregulováni, včetně Lonp1, Afg3l2 a Clpx a faktorů sestavování komplexu OXPHOS. Nebyly zjištěny žádné významné změny v hladinách proteinů zapojených do apoptózy (obrázek S2B). Podobně jsme zjistili, že mitochondriální a endoplazmatické retikulové kanály zapojené do transportu vápníku vykazují pouze drobné změny (obrázek S2C). Kromě toho hodnocení proteinů souvisejících s autofagií nezjistilo žádné významné změny, což je v souladu s viditelnou indukcí autofagosomů pozorovanou in vivo imunohistochemicky a elektronovou mikroskopií (obrázek S3). Progresivní dysfunkce OXPHOS u PN je však doprovázena zjevnými ultrastrukturálními mitochondriálními změnami. V buněčných tělech a dendritických stromech Mfn2cKO PN ve věku 5 a 8 týdnů lze pozorovat mitochondriální shluky a struktura vnitřní membrány prošla hlubokými změnami (obrázek S4, A a B). V souladu s těmito ultrastrukturálními změnami a významným poklesem mtDNA ukázala analýza akutních cerebelárních řezů s tetramethylrhodamin methylesterem (TMRM), že mitochondriální membránový potenciál u Mfn2cKO PN byl významně snížen (obrázek S4C).
(A) Analýza časového průběhu hladiny exprese komplexu OXPHOS. Uvažujte pouze proteiny s P < 0,05 v 8 týdnech (dvousměrná ANOVA). Tečkovaná čára: Bez úpravy ve srovnání s CTRL. (B) Vlevo: Příklad řezu mozečku značeného protilátkou anti-MTCO1 (měřítko, 20 μm). Plocha obsazená těly Purkyňových buněk je označena žlutě. Vpravo: Kvantifikace hladin MTCO1 (jednosměrná analýza rozptylu; n = 7 až 20 buněk analyzovaných od tří myší). (C) qPCR analýza počtu kopií mtDNA v tříděné PN (jednosměrná analýza rozptylu; n = 3 až 7 myší). (D) Vlevo: Příklad řezu mozečku značeného protilátkou anti-DNA (měřítko, 20 μm). Plocha obsazená těly Purkyňových buněk je označena žlutě. Vpravo: Kvantifikace lézí mtDNA (jednosměrná analýza rozptylu; n = 5 až 9 buněk od tří myší). (E) Příklad akutního řezu mozečku zobrazující mitoYFP + Purkyňovy buňky (šipka) v záznamu celobuněčné patch clamp metodou. (F) Kvantifikace IV křivky. (G) Reprezentativní záznamy depolarizačního proudu v Purkyňových buňkách CTRL a Mfn2cKO. Horní křivka: První pulz, který spustil AP. Spodní křivka: Maximální AP frekvence. (H) Kvantifikace postsynaptických spontánních vstupů (sPSP). Reprezentativní záznamová křivka a její poměr přiblížení jsou uvedeny v (I). Jednosměrná analýza rozptylu analyzovala n = 5 až 20 buněk od tří myší. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Reprezentativní křivky spontánního AP zaznamenaného pomocí perforovaného patch clamp režimu. Horní křivka: Maximální AP frekvence. Spodní křivka: přiblížení jednoho AP. (K) Kvantifikujte průměrnou a maximální AP frekvenci podle (J). Mann-Whitneyho test; n = 5 buněk bylo analyzováno od čtyř myší. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM; není důležitá.
U 8 týdnů starých Mfn2cKO PN bylo detekováno zjevné poškození OXPHOS, což naznačuje, že fyziologická funkce neuronů je výrazně abnormální. Proto jsme analyzovali pasivní elektrické charakteristiky neuronů s deficitem OXPHOS ve 4 až 5 týdnech a 7 až 8 týdnech provedením záznamů patch clamp z celých buněk v akutních řezech mozečku (obrázek 2E). Neočekávaně byl průměrný klidový membránový potenciál a vstupní odpor neuronů Mfn2cKO podobný kontrole, ačkoli mezi buňkami existovaly jemné rozdíly (tabulka 1). Podobně ve 4 až 5 týdnech věku nebyly zjištěny žádné významné změny ve vztahu proud-napětí (IV křivka) (obrázek 2F). Žádné neurony Mfn2cKO ve věku 7 až 8 týdnů však nepřežily intravenózní režim (krok hyperpolarizace), což naznačuje, že v této pozdní fázi existuje jasná citlivost na hyperpolarizační potenciál. Naproti tomu u neuronů Mfn2cKO jsou depolarizační proudy, které způsobují opakované výboje akčního potenciálu (AP), dobře tolerovány, což naznačuje, že jejich celkové vzorce výbojů se významně neliší od vzorců 8 týdnů starých kontrolních neuronů (tabulka 1 a obrázek 2G). Podobně byla frekvence a amplituda spontánních postsynaptických proudů (sPSC) srovnatelná s kontrolní skupinou a frekvence událostí se zvýšila ze 4 týdnů na 5 týdnů, poté ze 7 týdnů na 8 týdnů s podobným nárůstem (obrázek 2, H a I). ​​Období synaptické maturace u PN (25). Podobné výsledky byly získány po perforovaných PN záplatách. Tato konfigurace zabraňuje možné kompenzaci buněčných defektů ATP, k čemuž by mohlo dojít při záznamu celobuněčných záplat. Zejména nebyl ovlivněn klidový membránový potenciál a frekvence spontánního pálení neuronů Mfn2cKO (obrázek 2, J a K). Stručně řečeno, tyto výsledky naznačují, že PN se zjevnou dysfunkcí OXPHOS se dokáží dobře vyrovnat s vysokofrekvenčními výbojovými vzorci, což naznačuje, že existuje kompenzační mechanismus, který jim umožňuje udržovat téměř normální elektrofyziologické reakce.
Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM (jednofaktorová analýza rozptylu, Holm-Sidakův test vícenásobného srovnání; *P<0,05). Číslo jednotky je uvedeno v závorkách.
Snažili jsme se prozkoumat, zda některá kategorie v proteomickém souboru dat (obrázek 1G) obsahuje dráhy, které mohou působit proti závažnému deficitu OXPHOS, a tím vysvětlit, proč si postižená neuromuskulární onemocnění udržuje téměř normální elektrofyziologii (obrázek 2, E až K). Proteomická analýza ukázala, že enzymy zapojené do katabolismu aminokyselin s rozvětveným řetězcem (BCAA) byly významně upregulovány (obrázek 3A a obrázek S5A) a konečný produkt acetyl-CoA (CoA) nebo sukcinyl-CoA může doplňovat trikarboxyláty v arteriosklerózním kyselinovém cyklu (TCA). Zjistili jsme, že se zvýšil obsah BCAA transaminázy 1 (BCAT1) a BCAT2. Katalyzují první krok katabolismu BCAA tvorbou glutamátu z α-ketoglutarátu (26). Všechny podjednotky, které tvoří komplex ketokyselinové dehydrogenázy s rozvětveným řetězcem (BCKD), jsou upregulovány (komplex katalyzuje následnou a nevratnou dekarboxylaci výsledného uhlíkového skeletu BCAA) (obrázek 3A a obrázek S5A). V tříděných neuromuskulárních buňkách však nebyly zjištěny žádné zjevné změny v samotné BCAA, což může být způsobeno zvýšeným buněčným příjmem těchto esenciálních aminokyselin nebo použitím jiných zdrojů (glukózy nebo kyseliny mléčné) k doplnění cyklu TCA (obrázek S5B). PN bez OXPHOS také vykazovaly zvýšenou aktivitu rozkladu glutaminu a transaminace v 8 týdnech věku, což se může projevit zvýšenou regulací mitochondriálních enzymů glutaminázy (GLS) a glutaminpyruváttransaminázy 2 (GPT2) (obrázek 3, A a C). Za zmínku stojí, že zvýšená regulace GLS je omezena na sestřiženou izoformu glutaminázy C (GLS-GAC) (změna Mfn2cKO/CTRL je přibližně 4,5násobná, P = 0,05) a její specifická zvýšená regulace v rakovinných tkáních může podporovat mitochondriální bioenergii. (27)
(A) Tepelná mapa ukazuje násobnou změnu hladiny proteinu pro specifikovanou cestu po 8 týdnech. (B) Příklad řezu mozečku značeného protilátkou anti-PCx (měřítko, 20 μm). Žlutá šipka ukazuje na tělo Purkyňových buněk. (C) Analýza časového průběhu exprese proteinu identifikovaného jako důležitý kandidát pro aterosklerózu (vícenásobný t-test, *FDR <5 %; n = 3–5 myší). (D) Nahoře: Schematický diagram znázorňující různé způsoby vstupu značeného uhlíku obsaženého v radionuklidu [1-13C]pyruvát (tj. prostřednictvím PDH nebo transarteriální cesty). Dole: Houslový graf ukazuje procento jednoduše značeného uhlíku (M1) přeměněného na kyselinu asparagovou, kyselinu citronovou a kyselinu jablečnou po značení akutních řezů mozečku [1-13C]pyruvátem (párový t-test; ** P <0,01). (E) Komplexní analýza časového průběhu uvedené cesty. Uvažujte pouze proteiny s P <0,05 po 8 týdnech. Čárkovaná čára: žádná adjustovaná hodnota (dvoucestná analýza rozptylu; * P < 0,05; *** P < 0,001). Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM.
V naší analýze se katabolismus BCAA stal jednou z klíčových drah upregulace. Tato skutečnost silně naznačuje, že objem ventilace vstupující do cyklu TCA může být změněn u PN s nedostatkem OXPHOS. To může představovat hlavní formu neuronálního metabolického přepojení, které může mít přímý dopad na neuronální fyziologii a přežití během udržování těžké dysfunkce OXPHOS. V souladu s touto hypotézou jsme zjistili, že hlavní antiaterosklerotický enzym PCx je upregulován (Mfn2cKO/CTRL se mění přibližně 1,5krát; Obrázek 3A), což katalyzuje přeměnu pyruvátu na oxaloacetát (28), o kterém se předpokládá, že je v mozkové tkáni. Exprese je omezena na astrocyty (29, 30). V souladu s výsledky proteomiky konfokální mikroskopie ukázala, že exprese PCx byla specificky a významně zvýšena u PN s deficitem OXPHOS, zatímco reaktivita PCx byla omezena hlavně na sousední Bergmannovy gliové buňky kontroly (Obrázek 3B). Pro funkční testování pozorované zvýšené regulace PCx jsme ošetřili akutní mozečkové řezy stopovačem [1-13C]pyruvát. Když byl pyruvát oxidován pyruvátdehydrogenázou (PDH), jeho izotopové značení zmizelo, ale je začleněno do meziproduktů cyklu TCA, když je pyruvát metabolizován vaskulárními reakcemi (obrázek 3D). Naše proteomická data podporují pozorování velkého počtu markerů z tohoto stopovače v řezech Mfn2cKO s kyselinou asparagovou, zatímco kyselina citronová a kyselina jablečná měly také mírný, i když nevýznamný trend (obrázek 3D).
V dopaminových neuronech myší MitoPark s mitochondriální dysfunkcí způsobenou dopaminovými neurony specificky ničícími gen mitochondriálního transkripčního faktoru A (Tfam) (obrázek S6B) byla exprese PCx také významně zvýšena (31), což naznačuje, že acetonová kyselina je arterioskleróza. Výskyt onemocnění je regulován během dysfunkce neuronálního OXPHOS v těle. Za zmínku stojí, že bylo zjištěno, že unikátní enzymy (32-34), které mohou být exprimovány v neuronech, jež mohou být spojeny s arteriosklerózou, jsou významně zvýšeně regulovány v neuronech bez OXPHOS, jako je propionyl-CoA karboxyláza (PCC-A), malonyl-CoA přeměňuje propionyl-CoA na sukcinyl-CoA a mitochondriální jablečný enzym 3 (ME3), jehož hlavní úlohou je regenerace pyruvátu z malátu (obrázek 3, A a C) (33, 35). Dále jsme zjistili významné zvýšení hladiny enzymu Pdk3, který fosforyluje a tím inaktivuje PDH (36), zatímco u enzymu Pdp1, který aktivuje PDH, ani v samotném enzymovém komplexu PDH nebyly detekovány žádné změny (obrázek 3A). V souladu s tím byla u neuroneumatických buněk Mern2cKO zvýšena fosforylace podjednotky α1 (PDHE1α) pyruvátdehydrogenázy E1 komplexu PDH v Ser293 (známé inhibicí enzymové aktivity PDH) (obrázek S6C). Pyruvát nemá žádný cévní přístup.
Nakonec jsme zjistili, že superdráha biosyntézy serinu a glycinu, související mitochondriální folátový (1C) cyklus a biosyntéza prolinu (obrázek 1G a obrázek S5C) jsou podle zpráv během procesu aktivace významně upregulovány. Okolní tkáně jsou aktivovány s mitochondriální dysfunkcí (5-7). Konfokální analýza podporující tato proteomická data ukázala, že u PN s chybějícím OXPHOS byly mozečkové řezy 8 týdnů starých myší vystaveny serinhydroxymethyltransferáze 2 (SHMT2), klíčovému enzymu mitochondriálního folátového cyklu. Významná imunitní odpověď (obrázek S5D). U 13 akutních mozečkových řezů inkubovaných s CU-glukózou experimenty s metabolickým sledováním dále potvrdily upregulaci biosyntézy serinu a prolinu, což naznačuje, že tok izoforem uhlíku do serinu a prolinu se zvýšil (obrázek S5E). Vzhledem k tomu, že reakce podporované GLS a GPT2 jsou zodpovědné za syntézu glutamátu z glutaminu a transaminaci mezi glutamátem a α-ketoglutarátem, jejich zvýšená regulace naznačuje, že neurony s deficitem OXPHOS mají zvýšenou poptávku po glutamátu. To může být zaměřeno na udržení zvýšené biosyntézy prolinu (obrázek S5C). Na rozdíl od těchto změn proteomická analýza mozečkových astrocytů z PN-specifických myší Mfn2cKO ukázala, že tyto dráhy (včetně všech antiperoxidáz) se významně nezměnily v expresi, což dokazuje, že toto metabolické přesměrování je selektivní vůči degradované PN (obr. S6, D až G).
Stručně řečeno, tyto analýzy odhalily významně odlišné vzorce časové aktivace specifických metabolických drah u neuronálních neuronů. Ačkoli abnormální neuronální mitochondriální funkce může vést k časné ateroskleróze a remodelaci 1C (obrázek 3E a obrázek S5C) a dokonce i k předvídatelným změnám v expresi komplexů I a IV, změny v de novo syntéze serinu jsou patrné až v pozdních stádiích. Dysfunkce OXPHOS (obrázek 3E a obrázek S5C). Tato zjištění definují sekvenční proces, ve kterém stresem indukované mitochondriální (cyklus 1C) a cytoplazmatické (biosyntéza serinu) procesy reagují synergicky se zvýšením aterosklerózy v cyklu TCA a přetvářejí neuronální metabolismus.
8 týdnů staré OXPHOS-deficientní PN si mohou udržet vysokofrekvenční excitační aktivitu a podléhat významnému metabolickému opětovnému propojení, aby kompenzovaly mitochondriální dysfunkci. Tento objev otevírá zajímavou možnost, že i v tomto okamžiku mohou tyto buňky dostávat terapeutický zásah, který by zpomalil nebo zabránil neurodegeneraci. Tuto možnost jsme vyřešili dvěma nezávislými intervencemi. V první metodě jsme navrhli vektor s Cre-dependentním adeno-asociovaným virem (AAV), takže MFN2 může být selektivně exprimován v OXPHOS-deficientních PN in vivo (obrázek S7A). AAV kódující MFN2 a fluorescenční reportérový gen mCherry (Mfn2-AAV) byly ověřeny v primárních neuronových kulturách in vitro, což způsobilo expresi MFN2 Cre-dependentním způsobem a zachránilo mitochondriální morfologii, čímž zabránilo neuromutaci v neuronech Mfn2cKO (obrázek S7, B, D a E). Dále jsme provedli in vivo experimenty se stereotaktickým podáním 8 týdnů starého Mfn2-AAV do mozečkové kůry myší s Mfn2cKO a kontrolních myší a analyzovali jsme 12 týdnů staré myši (obrázek 4A). Léčené myši s Mfn2cKO uhynuly (obrázek 1, A a B) (16). Virová transdukce in vivo vedla k selektivní expresi PN v některých mozečkových kruzích (obrázek S7, G a H). Injekce kontrolního AAV exprimujícího pouze mCherry (Ctrl-AAV) neměla významný vliv na stupeň neurodegenerace u zvířat s Mfn2cKO. Naproti tomu analýza Mfn2cKO transdukovaných pomocí Mfn2-AAV ukázala významný ochranný účinek vrstvy PN buněk (obrázek 4, B a C). Zejména se zdá, že hustota neuronů je téměř nerozlišitelná od kontrolních zvířat (obrázek 4, B a C a obrázek S7, H a I). Exprese MFN1, ale nikoli MFN2, je stejně účinná v prevenci neuronální smrti (obrázek 4C a obrázek S7, C a F), což naznačuje, že exprese ektopického MFN1 může účinně doplnit nedostatek MFN2. Další analýza na úrovni jedné PN ukázala, že Mfn2-AAV do značné míry zachránil ultrastrukturu mitochondrií, normalizoval hladiny mtDNA a zvrátil vysokou expresi antiangiogenezního markeru PCx ​​(obrázek 4, C až E). Vizuální kontrola zachráněných myší Mfn2cKO v klidovém stavu ukázala, že se zlepšilo jejich držení těla a motorické symptomy (pohyb S1 až S3). Závěrem lze říci, že tyto experimenty ukazují, že opožděné opětovné zavedení MFN2 do PN s těžkým deficitem OXPHOS je dostatečné k obrácení spotřeby mtDNA a indukci aterosklerózy, čímž se zabrání degeneraci axonů a neuronální smrti in vivo.
(A) Schéma znázorňující experimentální harmonogram injekce AAV kódujícího MFN2, když je aktivována uvedená metabolická dráha. (B) Reprezentativní konfokální snímky 12 týdnů starých mozečkových řezů transdukovaných v 8 týdnech u myší Mfn2cKO a značených protilátkou proti kalbindinu. Vpravo: Škálování axonálních vláken. Měřítko axonálního zoomu je 450 a 75 μm. (C) Vlevo: Kvantifikace hustoty Purkyňových buněk v transdukční smyčce AAV (AAV+) (jednosměrná analýza rozptylu; n = 3 myši). Vpravo: Analýza fokusu mtDNA v transdukovaných PN ve 12. týdnu (nepárový t-test; n = 6 buněk od tří myší). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Reprezentativní transmisní elektronové mikrofotografie PN mozečkových řezů Mfn2cKO transdukovaných uvedenými virovými vektory. Růžová maska ​​znázorňuje plochu obsazenou dendrity a žlutý tečkovaný čtvereček znázorňuje zvětšení vpravo; n představuje jádro. Měřítko, 1 μm. (E) ukazuje příklad barvení PCx v PN transdukované ve 12 týdnech. Měřítko, 20 μm. OE, nadměrná exprese; FC, násobná změna.
Nakonec jsme zkoumali význam přežití buněk indukovaného peroxidázou u neuronukleóz (PN), u kterých došlo k dysfunkci OXPHOS. Vytvořili jsme mCherry kódující AAV-shRNA (short hairpin RNA) specificky cílící na myší PCx mRNA (AAV-shPCx) a virus nebo jeho scrambled control (AAV-scr) jsme injekčně aplikovali do mozečku myší Mfn2cKO. Injekce byla provedena ve čtvrtém týdnu věku (obrázek 5A), aby se dosáhlo účinného snížení exprese PCx v období, kdy se exprese PCx zvýšila (obrázek 3C) a vrstva PN buněk byla stále intaktní (obrázek 1A). Za zmínku stojí, že snížení exprese PCx (obrázek S8A) vede k významnému urychlení úmrtí PN, které je omezeno na infikovaný kruh (obrázek 5, B a C). Abychom pochopili mechanismus metabolických účinků vyvolaných zvýšenou regulací PCx, studovali jsme redoxní stav neuronů (PN) po knockdownu PCx a současné expresi optického biosenzoru Grx1-roGFP2 zprostředkovaného AAV (obrázek S8, B až D) za účelem vyhodnocení relativní změny redoxního potenciálu peptidu (38) u glutathionu. Poté jsme provedli dvoufotonovou fluorescenční zobrazovací mikroskopii (FLIM) v akutních řezech mozku 7týdenních Mfn2cKO nebo kontrolních sourozenců, abychom detekovali potenciální změny v cytoplazmatickém redoxním stavu po ověření podmínek FLIM (obrázek S8, E až G). Analýza ukázala významný nárůst oxidačního stavu jednotlivých Mfn2cKO PN bez exprese PCx, což se liší od kontrolních neuronů nebo Mfn2cKO PN exprimujících pouze scrambled shRNA (obrázek 5, D a E). Když byla exprese PCx snížena, procento Mfn2cKO PN vykazujících vysoce oxidovaný stav se zvýšilo více než třikrát (obrázek 5E), což naznačuje, že zvýšená regulace PCx udržovala redoxní kapacitu degenerovaných neuronů.
(A) Schéma znázorňující experimentální harmonogram injekce AAV kódujícího shPCx, když je aktivována uvedená metabolická dráha. (B) Reprezentativní konfokální fotografie 8 týdnů starých řezů mozečku u myší Mfn2cKO transdukovaných a značených protilátkou proti kalcineurinu ve 4 týdnech. Měřítko, 450 μm. (C) Kvantifikace hustoty Purkyňových buněk v AAV-transdukovaných smyčkách (jednosměrná analýza rozptylu; n = 3 až 4 myši). Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM; ***P<0,001. (D) Reprezentativní snímek FLIM ukazuje průměrnou délku života 7 týdnů starých PN exprimujících glutathionový redoxní senzor Grx1-roGFP2 za specifikovaných experimentálních podmínek. Poměr LUT (look-up table): časový interval přežití (v pikosekundách). Měřítko, 25 μm. (E) Histogram ukazuje rozložení hodnot životnosti Grx1-roGFP2 z (D) (n=158 až 368 buněk u dvou myší za každé podmínky). Koláčový graf nad každým histogramem: ukazuje počet buněk s významně delšími (červená, oxidovaná) nebo kratšími (modrá, redukovaná) hodnotami životnosti, které přesahují 1 SD průměrné hodnoty životnosti v CTRL-AAV-scr. (F) Navržený model ukazuje ochranný účinek upregulace neuronálního PCx.
Celkově vzato, data, která zde uvádíme, ukazují, že reexprese MFN2 může kompletně zachránit pokročilou neuronální neuropatii s těžkým deficitem OXPHOS, těžkou deplecí mtDNA a extrémně abnormální ista-like morfologií, čímž zajišťuje kontinuální progresi i u pokročilých onemocnění. Neurodegenerace poskytuje reverzibilní důkaz stádia před buněčnou smrtí. Tento stupeň metabolické flexibility je dále zdůrazněn schopností neuronů indukovat aterosklerózu (přepracování cyklu TCA), která inhibuje expresi PCx v neuronálních neuronech bez OXPHOS a zvyšuje buněčnou smrt, čímž hraje ochrannou roli (obrázek 5F).
V této studii jsme poskytli důkazy o tom, že reakcí neuronů (PN) na dysfunkci OXPHOS je postupná konvergence k ateroskleróze cyklu TCA prostřednictvím diferenciální aktivační dráhy aktivované metabolickými programy. Proteomickou analýzu jsme potvrdili mnoha doplňkovými metodami a odhalili, že když jsou neurony vystaveny těžké mitochondriální dysfunkci, vykazují dosud neznámou formu metabolické elasticity. K našemu překvapení celý proces přepojování nemusí nutně značit terminální metabolický stav, který postupně a nevratně doprovází neurodegeneraci, ale naše data naznačují, že může tvořit udržovací neuron i ve fázi před buněčnou smrtí. Mechanismus funkční kompenzace. Toto zjištění naznačuje, že neurony mají v těle značný stupeň metabolické plasticity. Tato skutečnost dokazuje, že pozdější opětovné zavedení MFN2 může zvrátit expresi klíčových metabolických markerů a zabránit degeneraci PN. Naopak inhibuje aterosklerózu a urychluje nervový systém. transsexuál.
Jedním z nejzajímavějších zjištění našeho výzkumu je, že neurony (PN) postrádající OXPHOS mohou modifikovat metabolismus cyklu TCA zvýšením regulace enzymů, které specificky stimulují arteriosklerózu. Metabolická přeskupení je běžným rysem rakovinných buněk, z nichž některé se spoléhají na glutamin jako doplněk meziproduktů cyklu TCA za účelem produkce redukčních ekvivalentů, které řídí dýchací řetězec a udržují produkci prekurzorů biosyntézy lipidů a nukleotidů (39, 40). Nedávná studie ukázala, že v periferních tkáních s dysfunkcí OXPHOS je opětovné propojení metabolismu glutaminu/glutamátu také významným rysem (5, 41), kde směr vstupu glutaminu do cyklu TCA závisí na závažnosti poškození OXPHOS (41). Chybí však jasné důkazy o jakékoli podobnosti neuronální metabolické plasticity v těle a jejím možném významu v kontextu onemocnění. V nedávné studii in vitro bylo prokázáno, že primární kortikální neurony mobilizují zásoby glutamátu pro neurotransmisi, čímž podporují oxidační metabolismus a aterosklerózu za podmínek metabolického stresu (42). Za zmínku stojí, že při farmakologické inhibici enzymu sukcinátdehydrogenázy cyklu TCA se předpokládá, že karboxylace pyruvátu udržuje syntézu oxaloacetátu v kultivovaných neuronech mozečkových granulí (34). Fyziologický význam těchto mechanismů pro mozkovou tkáň (kde se předpokládá, že ateroskleróza je omezena hlavně na astrocyty) má však stále důležitý fyziologický význam (43). V tomto případě naše data ukazují, že PN poškozené OXPHOS v těle mohou být přepnuty na degradaci BCAA a karboxylaci pyruvátu, což jsou dva hlavní zdroje suplementace meziproduktů TCA. Ačkoli byl navržen předpokládaný příspěvek katabolismu BCAA k neuronálnímu energetickému metabolismu, kromě role glutamátu a GABA pro neurotransmisi (44), stále neexistují žádné důkazy o těchto mechanismech in vivo. Proto je snadné spekulovat, že dysfunkční PN mohou automaticky kompenzovat spotřebu meziproduktů TCA poháněnou procesem asimilace zvýšením aterosklerózy. Zejména zvýšená regulace PCx může být nutná k udržení zvýšené poptávky po kyselině asparagové, což se naznačuje u proliferujících buněk s mitochondriální dysfunkcí (45). Naše metabolomická analýza však neodhalila žádné významné změny v ustálené hladině kyseliny asparagové v neuronech s deficitem Mfn2cKO (obrázek S6A), což pravděpodobně odráží odlišné metabolické využití kyseliny asparagové mezi proliferujícími buňkami a postmitotickými neurony. Přestože přesný mechanismus zvýšené regulace PCx v dysfunkčních neuronech in vivo je třeba dosud charakterizovat, prokázali jsme, že tato předčasná reakce hraje důležitou roli v udržování redoxního stavu neuronů, což bylo prokázáno v experimentech FLIM na řezech mozečku. Zejména zabránění zvýšené regulaci PCx ze strany neuronů může vést k oxidovanějšímu stavu a urychlit buněčnou smrt. Aktivace degradace BCAA a karboxylace pyruvátu nejsou způsoby, jak charakterizovat periferní tkáně mitochondriální dysfunkce (7). Proto se zdají být prioritní vlastností neuronů s deficitem OXPHOS, i když ne jedinou vlastností, která je důležitá pro neurodegeneraci. .
Cerebelární onemocnění je heterogenní typ neurodegenerativního onemocnění, které se obvykle projevuje ataxií a často poškozuje neuronální nervy (PNPH) (46). Tato populace neuronů je obzvláště náchylná k mitochondriální dysfunkci, protože jejich selektivní degenerace u myší je dostatečná k reprodukci mnoha motorických symptomů, které charakterizují lidskou spinocerebelární ataxii (16, 47, 48). Podle zpráv je transgenní myší model s mutantním genem spojen s lidskou spinocerebelární ataxií a má mitochondriální dysfunkci (49, 50), což zdůrazňuje důležitost studia důsledků deficitu OXPHOS u PNPH. Proto je obzvláště vhodné efektivně izolovat a studovat tuto jedinečnou populaci neuronů. Vzhledem k tomu, že PN jsou velmi citlivé na tlak a tvoří nízký podíl celkové populace mozečkových buněk, je pro mnoho studií založených na omice jejich selektivní separace jako celých buněk stále náročným aspektem. Ačkoli je téměř nemožné dosáhnout absolutní absence kontaminace jiných typů buněk (zejména dospělých tkání), kombinovali jsme účinný krok disociace s FACS, abychom získali dostatečný počet životaschopných neuronů pro následnou proteomickou analýzu a dosáhli poměrně vysokého pokrytí proteinů (přibližně 3000 proteinů) ve srovnání se stávající sadou dat o celém mozečku (51). Zachováním životaschopnosti celých buněk nám zde uvedená metoda umožňuje nejen kontrolovat změny v metabolických drahách v mitochondriích, ale také kontrolovat změny v jejich cytoplazmatických protějšcích, což doplňuje použití mitochondriálních membránových značek k obohacení buněčného typu. Nová metoda pro stanovení počtu mitochondrií v komplexních tkáních (52, 53). Metoda, kterou popisujeme, se netýká pouze studia Purkyňových buněk, ale lze ji snadno aplikovat na jakýkoli typ buňky k řešení metabolických změn v nemocných mozcích, včetně jiných modelů mitochondriální dysfunkce.
Konečně jsme identifikovali terapeutické okno během tohoto procesu metabolické přeskupení, které může zcela zvrátit klíčové projevy buněčného stresu a zabránit neuronální degeneraci. Pochopení funkčních důsledků zde popsaného přepojování by proto mohlo poskytnout základní poznatky o možných léčebných postupech pro udržení neuronální životaschopnosti během mitochondriální dysfunkce. Pro plné odhalení použitelnosti tohoto principu na jiná neurologická onemocnění je zapotřebí další výzkum zaměřený na analýzu změn v energetickém metabolismu v jiných typech mozkových buněk.
Myši MitoPark byly popsány dříve (31). Myši C57BL/6N s geny Mfn2 ohraničujícími loxP byly popsány dříve (18) a kříženy s myšmi L7-Cre (23). Výslední dvojitě heterozygotní potomci byli poté kříženi s homozygotními myšmi Mfn2loxP/Mfn2loxP za účelem generování Purkyňových specifických genových knockoutů pro Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). V podskupině páření byla alela Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) zavedena dalším křížením (20). Všechny postupy na zvířatech byly provedeny v souladu s evropskými, národními a institucionálními směrnicemi a schváleny LandesamtfürNatur of Umwelt a Verbraucherschutz, Severní Porýní-Vestfálsko, Německo. Práce na zvířatech se rovněž řídí pokyny Evropské federace asociací pro laboratorní vědy o zvířatech.
Po anestezii cervikální dislokace těhotné ženy bylo izolováno myší embryo (E13). Kortex byl preparován v Hanksově vyváženém solném roztoku (HBSS) doplněném 10 mM Hepes a převeden na Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium obsahující papain (20 U/ml) a cystein ​​(1μg/ml). Tkáň byla inkubována v DMEM (médiu DMEM) a disociována enzymatickým štěpením (1 μg/ml) při 37 °C po dobu 20 minut a poté mechanicky mleta v DMEM doplněném 10% fetálním bovinním sérem. Buňky byly nasety na krycí sklíčka potažená polylysinem v hustotě 2×10⁶ na 6cm kultivační misku nebo v hustotě 0,5×10⁶ buněk/cm² pro zobrazovací analýzu. Po 4 hodinách bylo médium nahrazeno Neurobasal bezsérovým médiem obsahujícím 1% doplněk B27 a 0,5 mM GlutaMax. Neurony byly poté po celou dobu experimentu udržovány při teplotě 37 °C a 5 % CO2 a krmeny jednou týdně. Pro indukci rekombinace in vitro byly druhý den in vitro použity k ošetření neuronů 3 μl (24jamková kultivační miska) nebo 0,5 μl (24jamková destička) následujícího virového vektoru AAV9: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, katalogové číslo 105530-AAV9) a AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalogové číslo 105545-AAV9).
Myší komplementární DNA Mfn1 a Mfn2 (získaná z plasmidu Addgene č. 23212 a 23213) je na C-konci označena sekvencí V5 (GKPIPNPLLGLDST) a je fúzována s mCherry v čtecím rámci prostřednictvím sekvence T2A. Grx1-roGFP2 je dar od Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Nahrazením kazety tdTomato pomocí konvenčních klonovacích metod byla kazeta subklonována do páteře pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (referenční číslo Addgene 28306) za vzniku vektorů pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 a pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Podobná strategie byla použita pro generování kontrolního vektoru pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Pro generování konstruktu AAV-shPCx je zapotřebí plazmidový vektor AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA]-CMV-mCherry-U6-mPcx-[shRNA#1]), který obsahuje sekvenci DNA kódující shRNA cílící na myší PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Pod kontrolou promotoru U6 se používá mCherry pod kontrolou promotoru CMV. Produkce pomocných vektorů AAV byla provedena podle pokynů výrobce (Cell Biolabs). Stručně řečeno, použijte transferový plazmid nesoucí kódující gen mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) nebo Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), stejně jako kódující kapsidový protein AAV1 a pomocný protein. Balicí plazmidový plazmid byl použit k přechodné transfekci buněk 293AAV, stejně jako k kódování kapsidového proteinu AAV1 a pomocného proteinu, za použití metody s fosforečnanem vápenatým. Surový virový supernatant byl získán cykly zmrazování a rozmrazování v lázni suchého ledu/ethanolu a buňky byly lyzovány ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). Vektor AAV byl purifikován diskontinuální ultracentrifugací s jodixanolovým gradientem (24 hodin při 32 000 ot/min a 4 °C) a zakoncentrován za použití odstředivého filtru Amicon ultra-15. Genomový titr AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 kopií genomu (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml) a AAV1-CAG-FLEX byl stanoven dle dříve popsaného postupu (54), měřen kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) a AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
Primární neurony byly seškrábnuty v ledově studeném 1x PBS, peletovány a poté homogenizovány v lyzačním pufru 0,5% Triton X-100 / 0,5% deoxycholátu sodného/PBS obsahujícím fosfatázu a inhibitor proteázy (Roche). Kvantifikace proteinů byla provedena pomocí testu s kyselinou bicinchoninovou (Thermo Fisher Scientific). Proteiny byly poté separovány elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a poté blotovány na polyvinylidenfluoridovou membránu (GE Healthcare). Blokujte nespecifická místa a inkubujte s primární protilátkou (podrobnosti viz tabulka S1) v 5% mléce v TBST (Tris-pufrovaný fyziologický roztok s Tween), promyjte a sekundární protilátka v TBST inkubujte. Inkubujte s primární protilátkou přes noc při +4 °C. Po promytí aplikujte sekundární protilátku na 2 hodiny při pokojové teplotě. Následně inkubací stejného blotu s protilátkou proti β-aktinu byla potvrzena stejná náplň. Detekce převodem na chemiluminiscenci a zesílením chemiluminiscence (GE Healthcare).
Neurony předem naseté na krycí sklíčka byly fixovány 4% paraformaldehydem (PFA)/PBS ve stanoveném časovém bodě při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Krycí sklíčka byla nejprve permeována 0,1% roztokem Triton X-100/PBS po dobu 5 minut při pokojové teplotě a poté v blokovacím pufru [3% bovinní sérový albumin (BSA)/PBS]. Druhý den byla krycí sklíčka promyta blokovacím pufrem a inkubována s příslušnou sekundární protilátkou konjugovanou s fluoroforem po dobu 2 hodin při pokojové teplotě; nakonec byly vzorky důkladně promyty v PBS s 4',6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI), kontrastně obarveny a poté fixovány na podložním sklíčku mikroskopu pomocí Aqua-Poly/Mount.
Myši (samci a samice) byly anestetizovány intraperitoneální injekcí ketaminu (130 mg/kg) a xylazinu (10 mg/kg) a subkutánně jim bylo podáno analgetikum karprofen (5 mg/kg). Myši byly umístěny do stereotaktického přístroje (Kopf) vybaveného vyhřívací podložkou. Lebka byla odkryta a pomocí zubní vrtačky byla ztenčena část mozečkové kůry odpovídající misní kosti (od lambda: ocas 1,8, laterální 1, odpovídající lalůčkům IV a V). Pomocí zakřivené jehly injekční stříkačky byl opatrně vytvořen malý otvor v lebce, aby nedošlo k narušení cévního systému pod ní. Poté byla do mikrootvoru (od -1,3 do -1 na ventrální straně tvrdé pleny) pomalu zavedena tenká skleněná kapilára a do mikroinjektoru (Narishige) bylo pomocí manuálních stříkaček (Narishige) několikrát za nízkého tlaku vstřikováno 200 až 300 nl AAV po dobu 10 až 20 minut. Po infuzi se kapilára umístí na dalších 10 minut, aby se virus mohl zcela rozšířit. Po odstranění kapilár se kůže opatrně zašije, aby se minimalizoval zánět rány a umožnilo se zvířeti zotavení. Zvířata byla několik dní po operaci léčena analgetiky (kaspofen), během nichž byl pečlivě sledován jejich fyzický stav a poté byla v určeném časovém bodě utracena. Všechny postupy byly provedeny v souladu s evropskými, národními a institucionálními směrnicemi a byly schváleny LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Severní Porýní-Vestfálsko, Německo.
Zvířata byla anestetizována ketaminem (100 mg/kg) a xylazinem (10 mg/kg) a srdce bylo nejprve perfuzováno 0,1 M PBS a poté 4% PFA v PBS. Tkáň byla preparována a fixována ve 4% PFA/PBS přes noc při 4 °C. K přípravě sagitálních řezů (tloušťka 50 μm) z fixovaného mozku v PBS byl použit vibrační nůž (Leica Microsystems GmbH, Vídeň, Rakousko). Pokud nebylo uvedeno jinak, barvení volně plovoucích řezů bylo provedeno výše popsaným způsobem (13) při pokojové teplotě a míchání. Stručně řečeno, nejprve byly získané řezy permeabilizovány 0,5% Triton X-100/PBS po dobu 15 minut při pokojové teplotě; u některých epitopů (Pcx a Shmt2) v tris-EDTA pufru při 80 °C (pH 9) se řezy místo tohoto kroku zahřívaly po dobu 25 minut. Následně byly řezy inkubovány s primární protilátkou (viz tabulka S1) v blokovacím pufru (3% BSA/PBS) při 4 °C přes noc za míchání. Následující den byly řezy promyty blokovacím pufrem a inkubovány s příslušnou sekundární protilátkou konjugovanou s fluoroforem po dobu 2 hodin při pokojové teplotě; nakonec byly řezy důkladně promyty v PBS, kontrastně obarveny DAPI a poté fixovány AquaPolymount na mikroskopickém podložním sklíčku.
Pro zobrazení vzorku byl použit laserový skenovací konfokální mikroskop (TCS SP8-X nebo TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) vybavený bílým laserem a 405 diodovým ultrafialovým laserem. Excitací fluoroforu a sběrem signálu pomocí hybridního detektoru (HyDs) byl použit software LAS-X pro sběr vrstvených snímků odpovídajících Nyquistovu vzorkování v sekvenčním režimu: u nekvantitativních panelů se jedná o vysoce dynamické signály (například v somatických buňkách a dendritech) (mtYFP). HyD se používá k detekci počtu PN v režimu BrightR. Pro snížení pozadí se používá hradlování od 0,3 do 6 ns.
Zobrazování tříděných buněk v reálném čase. Po třídění v médiu Neurobasal-A obsahujícím 1 % doplňku B27 a 0,5 mM GlutaMax byly buňky okamžitě nasety na podložní sklíčka potažená poly-l-lysinem (μ-Slide8 Well, Ibidi, katalogové číslo 80826) a poté uchovávány při teplotě 37 °C a 5 % CO2 po dobu 1 hodiny, aby se buňky usadily. Zobrazování v reálném čase bylo provedeno na laserovém skenovacím konfokálním mikroskopu Leica SP8 vybaveném bílým laserem, HyD, olejovým objektivem s numerickou aperturou (NA) 63×[1,4] a topným stolkem.
Myš byla rychle anestetizována oxidem uhličitým a dekapitována, mozek byl rychle vyjmut z lebky a nařezán na sagitální řezy o tloušťce 200 μm (pro experiment se značením 13C) nebo 275 μm (pro experimenty se dvěma fotony) naplněné následujícími materiály. Zmrzlina (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Německo) je naplněna následujícími látkami: 125 mM ledově vychlazený, uhlíkem nasycený (95 % O2 a 5 % CO2) nízkokapacitní umělý mozkomíšní mok (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM pufr s fosforečnanem sodným, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukóza, 0,5 mM CaCl2 a 3,5 mM MgCl2 (osmotický tlak 310 až 330 mmol). Získané řezy mozku se přenesou do preinkubační komory obsahující médium s vyšším obsahem Ca2+ ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM fosfátový pufr sodný, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM D-glukóza, 1,0 mM CaCl2 a 2,0 mM MgCl2) o pH 7,4 a o koncentraci 310 až 320 mmol).
Během zobrazovacího procesu byly řezy přesunuty do vyhrazené zobrazovací místnosti a experiment byl prováděn za kontinuální perfuze ACSF při konstantní teplotě 32 °C až 33 °C. Pro zobrazování řezů byl použit multifotonový laserový skenovací mikroskop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) vybavený objektivem Leica 25x (NA 0,95, voda) a titan-safírový laser (Chameleon Vision II, Coherent). Modul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2. Změny cytoplazmatického redoxního stavu PN byly měřeny dvoufotonovou FLIM v sagitálních mozkových řezech, kde biosenzor Grx1-roGFP2 cílil na PN. Ve vrstvě PN je akviziční pole vybráno přibližně 50 až 80 μm pod povrchem řezu, aby se zajistila přítomnost životaschopné PN (tj. absence perličkové struktury nebo neuronálních morfologických změn podél dendritů) a dvojitě pozitivní senzor roGFP2 a AAV kódující shRNA PCx nebo její kontrolní sekvenci (každý koexprimující mCherry). Snímky z jednoho vrstvení jsou snímány s 2x digitálním zoomem [excitační vlnová délka: 890 nm; 512 nm 512 pixelů]. Detekce: interní HyD, filtrační skupina fluorescein isothiokyanátu (FITC)] a průměrování obrazu během 2 až 3 minut je zajištěno, že je shromážděno dostatečné množství fotonů (celkem 1000 fotonů) pro fitování křivky. Citlivost sondy Grx1-roGFP2 a ověření podmínek FLIM byly provedeny monitorováním hodnoty délky života roGFP2 po přidání exogenního 10 mM H2O2 do perfuzního ACSF (pro maximalizaci oxidace, což vede k prodloužení délky života) a následném přidání 2 mM dithiothreitolu (minimalizace stupně redukce, což vede ke zkrácení délky života) (obrázek S8, D až G). K analýze získaných výsledků použijte software FLIMfit 5.1.1, fitujte jedinou exponenciální křivku rozpadu celého obrazu na naměřenou IRF (funkci odezvy přístroje) a χ2 je přibližně 1. Pro výpočet doby života jednoho PN byla ručně nakreslena maska ​​kolem nervového těla a pro kvantifikaci byla použita průměrná doba života v každé masce.
Analýza mitochondriálního potenciálu. Po 30minutové inkubaci akutního řezu se 100 nM TMRM přímo přidaným do perfuzního ACSF byly změny mitochondriálního potenciálu PN měřeny dvoufotonovým mikroskopem. Zobrazování TMRM bylo provedeno excitací sondy při 920 nm a použitím interního HyD (tetramethylrhodamin isothiokyanát: 585/40 nm) pro sběr signálů; použitím stejné excitační vlnové délky, ale s použitím jiného interního HyD (FITC: 525/50) pro zobrazení mtYFP. Pro vyhodnocení mitochondriálního potenciálu na úrovni jednotlivých buněk použijte plugin Image Calculator od ImageJ. Stručně řečeno, rovnice pluginu: signal = min (mtYFP, TMRM) se používá k identifikaci mitochondriální oblasti, která zobrazuje signál TMRM v Purkyňově somálském syndromu v konfokálním obrazu z jednoho vrstvení odpovídajícího kanálu. Pak je plocha pixelu ve výsledné masce kvantifikována a následně normalizována na odpovídajícím prahovém jednovrstvém obrazu mtYFP kanálu, aby se získala mitochondriální frakce ukazující mitochondriální potenciál.
Obrázek byl dekonvoluován pomocí softwaru Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). U naskenovaných obrázků dlaždic je montáž jedné dlaždice provedena pomocí algoritmu automatického sešívání poskytovaného softwarem LAS-X. Po kalibraci obrazu je k dalšímu zpracování obrazu a rovnoměrnému nastavení jasu a kontrastu použit program ImageJ a Adobe Photoshop. Pro grafickou přípravu je použit Adobe Illustrator.
Analýza fokusu mtDNA. Počet lézí mtDNA byl kvantifikován na mozečkových řezech značených protilátkami proti DNA pomocí konfokálního mikroskopu. Každá cílová oblast byla vytvořena pro tělo buňky a jádro každé buňky a příslušná plocha byla vypočítána pomocí pluginu Multi Measure (software ImageJ). Odečtěte plochu jádra od plochy těla buňky, abyste získali cytoplazmatickou plochu. Nakonec byl plugin Analyze Particles (software ImageJ) použit k automatické kvantifikaci cytoplazmatických bodů DNA indikujících mtDNA na prahovém snímku a získané výsledky byly normalizovány na průměr PN myší CTRL. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměrný počet nukleosidů na buňku.
Analýza exprese proteinů. Použijte plugin Image Calculator od ImageJ k vyhodnocení exprese proteinů v PN na úrovni jednotlivých buněk. Stručně řečeno, v jednovrstvém konfokálním obrazu odpovídajícího kanálu je pomocí rovnice: signál = min (mtYFP, protilátka) identifikována mitochondriální oblast, která vykazuje imunoreaktivitu vůči určité protilátce v Purkinově chorobě. Poté je kvantifikována plocha pixelu ve výsledné masce a následně normalizována na odpovídající prahový jednovrstvý obraz mtYFP kanálu, aby se získala mitochondriální frakce zobrazeného proteinu.
Analýza hustoty Purkyňových buněk. Plugin Cell Counter softwaru ImageJ byl použit k vyhodnocení hustoty Purkyňových buněk vydělením počtu spočítáných Purkyňových buněk délkou mozečkového prstence, který spočítáné buňky zabírají.
Příprava a odběr vzorků. Mozky kontrolní skupiny a myší Mfn2cKO byly fixovány v 2% PFA/2,5% glutaraldehydu v 0,1 M fosfátovém pufru (PB) a poté byly připraveny koronální řezy za použití nálevníků (Leica Mikrosysteme GmbH, Vídeň, Rakousko) (tloušťka 50 až 60 μm). Poté byly fixovány v PB pufru v 1% tetraoxidu a 1,5% ferokyanidu draselného při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Řezy byly třikrát promyty destilovanou vodou a poté obarveny 70% ethanolem obsahujícím 1% uranylacetátu po dobu 20 minut. Řezy byly poté dehydratovány v odstupňovaném alkoholu a zality do epoxidové pryskyřice Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, katalogové číslo 14040) mezi silikonem potaženými podložními sklíčky a nakonec při 60 °C polymerizovány v peci po dobu 48 hodin. Byla vybrána oblast mozečkové kůry a na mikroskopu Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vídeň, Rakousko) byly nařezány ultratenké řezy o tloušťce 50 nm a odebrány na měděnou štěrbinovou mřížku o rozměrech 2×1 mm potaženou polystyrenovou fólií. Řezy byly barveny roztokem 4% uranylacetátu v H2O po dobu 10 minut, několikrát promyty H2O, poté Reynoldsovým citrátem olovnatým v H2O po dobu 10 minut a poté několikrát promyty H2O. Mikrofotografie byly pořízeny transmisním elektronovým mikroskopem Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) s použitím digitální kamery TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Německo).
U myší infikovaných AAV byl mozek oddělen a nakrájen na 1 mm silný sagitální řez a mozeček byl vyšetřen fluorescenčním mikroskopem za účelem identifikace prstence infikovaného AAV (tj. exprimujícího mCherry). Používají se pouze experimenty, ve kterých injekce AAV vede k velmi vysoké transdukční účinnosti vrstvy Purkyňových buněk (tj. téměř celé vrstvy) v alespoň dvou po sobě jdoucích mozečkových kruzích. Smyčka transdukovaná AAV byla mikrodisekována pro noční postfixaci (4% PFA a 2,5% glutaraldehyd v 0,1 M kokoátovém pufru) a dále zpracována. Pro vložení EPON byla fixovaná tkáň promyta 0,1 M kokoátovým pufrem sodným (Applichem) a inkubována s 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) v 0,1 M kokoátovém pufru sodném (Applichem) po dobu 4 hodin, poté promyta po dobu 2 hodin. Opakujte 3krát s 0,1 M kokamidovým pufrem. Následně byla vzestupná série ethanolu použita k inkubaci každého ethanolového roztoku při 4 °C po dobu 15 minut za účelem dehydratace tkáně. Tkáň byla přenesena do propylenoxidu a inkubována přes noc v EPON (Sigma-Aldrich) při 4 °C. Tkáň byla umístěna do čerstvého EPONu při pokojové teplotě na 2 hodiny a poté zalita do 62 °C na 72 hodin. Pomocí ultramikrotomu (Leica Microsystems, UC6) a diamantového nože (Diatome, Biel, Švýcarsko) byly nařezány ultratenké řezy o tloušťce 70 nm a obarveny 1,5% uranylacetátem po dobu 15 minut při 37 °C a poté roztokem citrátu olovnatého po dobu 4 minut. Elektronové mikroskopy byly pořízeny pomocí transmisního elektronového mikroskopu JEM-2100 Plus (JEOL) vybaveného kamerou Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) a softwarem DigitalMicrograph (Gatan). Pro analýzu byly elektronové mikroskopy pořízeny s 5000× nebo 10 000× digitálním zoomem.
Morfologická analýza mitochondrií. Pro všechny analýzy byly kontury jednotlivých mitochondrií ručně vyznačeny na digitálních snímcích pomocí softwaru ImageJ. Analyzovány byly různé morfologické parametry. Hustota mitochondrií je vyjádřena v procentech získaných vydělením celkové mitochondriální plochy každé buňky plochou cytoplazmy (plocha cytoplazmy = plocha buňky - plocha buněčného jádra) × 100. Kruhovitost mitochondrií je vypočtena pomocí vzorce [4π∙(plocha/obvod 2)]. Byla analyzována morfologie mitochondrií a rozdělena do dvou kategorií („tubulární“ a „puchýřovité“) podle jejich hlavních tvarů.
Analýza počtu a hustoty autofagosomů/lysozomů. Pomocí softwaru ImageJ ručně vyznačte kontury každého autofagosomu/lysozomu v digitálním obrazu. Plocha autofagosomů/lysozomů je vyjádřena v procentech vypočítaných vydělením celkové plochy struktury autofagosomů/lysozomů každé buňky plochou cytoplazmy (plocha cytoplazmy = plocha buňky - plocha jádra) × 100. Hustota autofagosomů/lysozomů se vypočítá vydělením celkového počtu počtem struktur autofagosomů/lysozomů na buňku (vyjádřeno cytoplazmatickou plochou) (plocha cytoplazmy = plocha buňky - plocha jádra).
Značení pro akutní řezy a přípravu vzorků. Pro experimenty, které vyžadují značení glukózou, přeneste akutní mozkové řezy do preinkubační komory, která obsahuje nasycený uhlík (95 % O2 a 5 % CO2), ACSF s vysokým obsahem Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM pufr s fosforečnanem sodným, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukózy, 1,0 mM CaCl2 a 2,0 mM MgCl2, upraveno na pH 7,4 a 310 až 320 mOsm), ve kterém je glukóza 13C6-glukózovou substitucí (Eurisotop, katalogové číslo CLM-1396). Pro experimenty, které vyžadují značení pyruvátem, přeneste řezy akutního mozku do roztoku s vyšším obsahem Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM fosfátový pufr sodný, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM D-glukóza, 1,0 mM CaCl2 a přidejte 2,0 mM MgCl2, upravte pH na 7,4 a 310 až 320 mOsm) a přidejte 1 mM 1-[1-13C]pyruvát (Eurisotop, katalogové číslo CLM-1082). Řezy inkubujte 90 minut při 37 °C. Na konci experimentu byly řezy rychle promyty vodným roztokem (pH 7,4) obsahujícím 75 mM uhličitanu amonného a poté homogenizovány v poměru 40:40:20 (v:v:v) acetonitril (ACN):methanol:voda. Po 30minutové inkubaci řezů na ledu byly vzorky centrifugovány při 21 000 g po dobu 10 minut při 4 °C a čirý supernatant byl sušen v koncentrátoru SpeedVac. Výsledná sušená peleta metabolitů byla skladována při -80 °C do analýzy.
Analýza aminokyselin značených 13C pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií. Pro analýzu pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) byl metabolitový pelet resuspendován v 75 μl vody kvality LC-MS (Honeywell). Po centrifugaci při 21 000 g po dobu 5 minut při 4 °C bylo 20 μl vyčištěného supernatantu použito pro analýzu toku aminokyselin, zatímco zbytek extraktu byl okamžitě použit pro analýzu aniontů (viz níže). Analýza aminokyselin byla provedena za použití dříve popsaného protokolu derivatizace benzoylchloridu (55, 56). V prvním kroku bylo k 20 μl extraktu metabolitů přidáno 10 μl 100 mM uhličitanu sodného (Sigma-Aldrich) a poté bylo k ACN kvality LC přidáno 10 μl 2% benzoylchloridu (Sigma-Aldrich). Vzorek byl krátce vortexován a poté centrifugován při 21 000 g po dobu 5 minut při 20 °C. Vyčištěný supernatant se přenese do 2ml lahvičky s automatickým vzorkovačem s kónickou skleněnou vložkou (objem 200 μl). Vzorky byly analyzovány pomocí ultravysokoúčinného LC systému Acquity iClass (Waters) připojeného k vysoce přesnému hmotnostnímu spektrometru s vysokým rozlišením Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Pro analýzu byly 2 μl derivatizovaného vzorku vstříknuty do vysokopevnostní silikagelové T3 kolony o rozměrech 100 × 1,0 mm (Waters) obsahující částice o velikosti 1,8 μm. Průtoková rychlost je 100 μl/min a pufrovací systém se skládá z pufru A (10 mM mravenčan amonný a 0,15% kyselina mravenčí ve vodě) a pufru B (ACN). Gradient je následující: 0 % B v čase 0 minut; 0 % B. 0 až 15 % B v čase 0 až 0,1 minuty; 15 až 17 % B v čase 0,1 až 0,5 minuty; B při 17 až 55 % při 0,5 až 14 minutách; B při 55 až 70 % při 14 až 14,5 minutách; při 14,5 až 70 až 100 % B při 18 minutách; 100 % B při 18 až 19 minutách; 100 až 0 % B při 19 až 19,1 minutách; 0 % B při 19,1 až 28 minutách (55, 56). Hmotnostní spektrometr QE-HF pracuje v režimu pozitivní ionizace s hmotnostním rozsahem m/z (poměr hmotnost/náboj) 50 až 750. Použité rozlišení je 60 000 a získaný iontový cíl s regulací zisku (AGC) je 3 × 106 a maximální iontový čas je 100 milisekund. Zdroj vyhřívané elektrosprejové ionizace (ESI) pracuje s rozprašovacím napětím 3,5 kV, kapilární teplotou 250 °C, průtokem vzduchu v plášti 60 AU (libovolných jednotek) a pomocným průtokem vzduchu 20 AU. 250 °C. Čočka S je nastavena na 60 AU.
Analýza organických kyselin značených 13C pomocí aniontové chromatografie-MS. Zbývající sraženina metabolitů (55 μl) byla analyzována pomocí iontového chromatografického systému Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) připojeného k hmotnostnímu spektrometru QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Stručně řečeno, 5 μl extraktu metabolitů bylo vstříknuto do kolony Dionex IonPac AS11-HC vybavené HPLC (2 mm × 250 mm, velikost částic 4 μm, Thermo Fisher Scientific) v režimu částečné smyčky s plnicím poměrem 1. ) Předkolona Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Teplota kolony se udržuje na 30 °C a autosampler je nastaven na 6 °C. Pro generování gradientu hydroxidu draselného pomocí generátoru eluentu se použije patrona s hydroxidem draselným dodávaná s deionizovanou vodou. Separace metabolitů při průtoku 380 μl/min s použitím následujícího gradientu: 0 až 3 minuty, 10 mM KOH; 3 až 12 minut, 10 až 50 mM KOH; 12 až 19 minut, 50 až 100 mM KOH; 19 až 21 minut, 100 mM KOH; 21 až 21,5 minuty, 100 až 10 mM KOH. Kolona byla znovu ekvilibrována 10 mM KOH po dobu 8,5 minuty.
Eluované metabolity jsou po koloně kombinovány s proudem isopropanolu o průtoku 150 μl/min a poté vedeny do hmotnostního spektrometru s vysokým rozlišením pracujícího v režimu negativní ionizace. MS monitoruje hmotnostní rozsah od m/z 50 do 750 s rozlišením 60 000. AGC je nastaveno na 1×106 a maximální iontový čas je udržován na 100 ms. Vyhřívaný zdroj ESI byl provozován při rozprašovacím napětí 3,5 kV. Další nastavení iontového zdroje jsou následující: teplota kapiláry 275 °C; průtok plynu pláštěm 60 AU; průtok pomocného plynu 20 AU při 300 °C a nastavení čočky S na 60 AU.
Analýza dat metabolitů značených 13C. Pro analýzu dat izotopového poměru použijte software TraceFinder (verze 4.2, Thermo Fisher Scientific). Identita každé sloučeniny byla ověřena spolehlivou referenční sloučeninou a nezávisle analyzována. Pro provedení analýzy izotopového obohacení byla plocha extrahovaného iontového chromatogramu (XIC) každého izotopu 13C (Mn) extrahována z [M + H] +, kde n je číslo uhlíku cílové sloučeniny, použité k analýze aminokyselin, nebo [MH] + použité k analýze aniontů. Hmotnostní přesnost XIC je menší než pět ppm a přesnost RT je 0,05 minuty. Analýza obohacení se provádí výpočtem poměru každého detekovaného izotopu k součtu všech izotopů odpovídající sloučeniny. Tyto poměry jsou uvedeny jako procentuální hodnoty pro každý izotop a výsledky jsou vyjádřeny jako molární procento obohacení (MPE), jak bylo popsáno dříve (42).
Zmrazená neuronová peleta byla homogenizována v ledově vychlazeném 80% methanolu (v/v), vortexována a inkubována při -20 °C po dobu 30 minut. Vzorek byl znovu vortexován a míchán při +4 °C po dobu 30 minut. Vzorek byl centrifugován při 21 000 g po dobu 5 minut při 4 °C a poté byl výsledný supernatant sesbírán a sušen pomocí koncentrátoru SpeedVac při 25 °C pro následnou analýzu. Jak je popsáno výše, byla provedena LC-MS analýza aminokyselin tříděných buněk. Analýza dat byla provedena pomocí TraceFinderu (verze 4.2, Thermo Fisher Scientific) s použitím monoizotopové hmotnosti každé sloučeniny. Kvantilová normalizace dat metabolitů byla provedena pomocí softwarového balíčku preprocessCore (57).
Příprava řezů. Myš byla rychle anestetizována oxidem uhličitým a dekapitována, mozek byl rychle vyjmut z lebky a vibrační nůž naplněný ledem (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Německo) byl použit k jejímu nařezání na sagitální řezy o tloušťce 300 až 375 μm. Zplyňování uhlíkem za studena (95 % O2 a 5 % CO2). Nízký obsah Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM fosfátový pufr sodný, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukóza, 1,0 mM CaCl2 a 6,0 mM MgCl2. Upraveno na pH 7,4 a 310 až 330 mOsm). Získané mozkové řezy přeneste do komory obsahující roztok Ca2+ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM fosfátový pufr sodný, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM D-glukózy, 4,0 mM CaCl2 a 3,5 mM MgCl2) o pH 7,4 a tlaku 310 až 320 mOsm. Řezy skladujte 20 až 30 minut, aby se mohly před záznamem restaurovat.
Záznam. Pro všechny záznamy byl použit mikroskopický stolek vybavený pevnou záznamovou komorou a 20násobným zvětšením ve vodě (Scientifica). Předpokládané Purkyňovy buňky byly identifikovány podle (i) velikosti těla, (ii) anatomického umístění mozečku a (iii) exprese fluorescenčního reportérového genu mtYFP. Patch pipeta s odporem hrotu 5 až 11 megaohmů je vytahována pomocí borosilikátové skleněné kapiláry (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Německo) a horizontální pipety Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA. Všechny záznamy byly provedeny pomocí zesilovače ELC-03XS npi patch clamp (npi electronic GmbH, Tam, Německo), který byl řízen softwarem Signal (verze 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Velká Británie). Experiment byl zaznamenáván při vzorkovací frekvenci 12,5 kHz. Signál je filtrován dvěma krátkoprůchodovými Besselovými filtry s mezními frekvencemi 1,3 a 10 kHz. Kapacita membrány a pipety je kompenzována kompenzačním obvodem pomocí zesilovače. Všechny experimenty byly prováděny pod kontrolou kamery Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Německo), která byla řízena softwarem Hokawo (verze 2.8, Hamamatsu, Gerden, Německo).
Rutinní konfigurace a analýza celých buněk. Bezprostředně před záznamem naplňte pipetu vnitřním roztokem obsahujícím následující látky: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM glukonát draselný, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM guanosintrifosfát (GTP) (Na) a 10,0 mM kreatininfosfát byly upraveny na pH 7,25 a osmotický tlak byl 290 mOsm (sacharóza). Ihned po aplikaci síly 0 pA k protržení membrány byl změřen klidový membránový potenciál. Vstupní odpor se měří aplikací hyperpolarizovaných proudů -40, -30, -20 a -10 pA. Změřte velikost napěťové odezvy a použijte Ohmův zákon k výpočtu vstupního odporu. Spontánní aktivita byla zaznamenávána v napěťovém klešti po dobu 5 minut a sPSC byl identifikován a měřen v programu Igor Pro (verze 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) pomocí poloautomatického rozpoznávacího skriptu. IV křivka a ustálený proud byly měřeny upnutím baterie na různé potenciály (počínaje -110 mV) a zvyšováním napětí v krocích po 5 mV. Produkce AP byla testována aplikací depolarizačního proudu. Článek byl upnut na -70 mV za současné aplikace depolarizačního proudového pulzu. Velikost kroku každé záznamové jednotky se upravuje zvlášť (10 až 60 pA). Maximální frekvenci AP se vypočítá ručním spočítáním pulzních špiček, které způsobují nejvyšší frekvenci AP. Práh AP se analyzuje pomocí druhé derivace depolarizačního pulzu, který jako první spustí jeden nebo více AP.
Konfigurace a analýza perforované membrány. Proveďte záznam perforované membrány pomocí standardních protokolů. Použijte pipetu bez ATP a GTP, která neobsahuje následující složky: 128 mM glukonát K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA a 2 mM MgCl2, a upravte pH na 7,2 (pomocí KOH). ATP a GTP jsou z intracelulárního roztoku vynechány, aby se zabránilo nekontrolované permeabilitě buněčné membrány. Pipeta s perforovanou membránou se naplní vnitřním roztokem obsahujícím amfotericin (přibližně 200 až 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) pro získání záznamu s perforovanou membránou. Amfotericin byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (konečná koncentrace: 0,1 až 0,3 %; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Použitá koncentrace DMSO neměla významný vliv na studované neurony. Během procesu děrování byl kontinuálně monitorován odpor kanálu (Ra) a experiment byl zahájen po stabilizaci amplitudy Ra a AP (20-40 minut). Spontánní aktivita byla měřena v napěťových a/nebo proudových kleštích po dobu 2 až 5 minut. Analýza dat byla provedena pomocí programů Igor Pro (verze 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (verze 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) a GraphPad Prism (verze 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Pro identifikaci spontánních AP se používá plugin IgorPro NeuroMatic v3.0c. AP se automaticky identifikují pomocí daného prahu, který se nastavuje individuálně pro každý záznam. Pomocí intervalu špiček se určí frekvence špiček s maximální okamžitou frekvencí špiček a průměrnou frekvencí špiček.
Izolace PN. Adaptací na dříve publikovaný protokol byly PN purifikovány z mozečku myši ve specifikované fázi (58). Stručně řečeno, mozeček byl preparován a rozmělněn v ledově chladném disociačním médiu [bez HBSS Ca2+ a Mg2+, doplněném 20 mM glukózou, penicilinem (50 U/ml) a streptomycinem (0,05 mg/ml)] a poté štěpen v papainu [HBSS, doplněný 1-cystein·HCl (1 mg/ml), papainem (16 U/ml) a deoxyribonukleázou I (DNáza I; 0,1 mg/ml)]. Ošetřeno po dobu 30 minut při 30 °C. Nejprve promyjte tkáně v médiu HBSS obsahujícím vaječný hlen (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) a DNázu (0,1 mg/ml) při pokojové teplotě, aby se zabránilo enzymatickému štěpení, a poté v médiu HBSS obsahujícím 20 mM glukózy. Jemné rozemletí v HBSS, penicilinu (50 U/ml), streptomycinu (0,05 mg/ml) a DNázy (0,1 mg/ml) uvolní jednotlivé buňky. Výsledná buněčná suspenze byla filtrována přes 70μm buněčné síto, poté byly buňky peletovány centrifugací (1110 ot/min, 5 minut, 4 °C) a resuspendovány v třídicím médiu [HBSS, doplněné 20 mM glukózou, 20% fetálním bovinním sérem, penicilinem (50 U/ml) a streptomycinem (0,05 mg/ml)]; vyhodnoťte životaschopnost buněk pomocí propidiumjodidu a upravte hustotu buněk na 1×106 až 2×106 buněk/ml. Před průtokovou cytometrií byla suspenze filtrována přes buněčné sítko s velikostí pórů 50 μm.
Průtokový cytometr. Třídění buněk bylo provedeno při 4 °C za použití přístroje FACSAria III (BD Biosciences) a softwaru FACSDiva (BD Biosciences, verze 8.0.1). Buněčná suspenze byla tříděna pomocí trysky o průměru 100 μm pod tlakem 20 psi rychlostí ~2800 událostí/s. Vzhledem k tomu, že tradiční kritéria pro třídění buněk (velikost buněk, bimodální diskriminace a charakteristiky rozptylu) nemohou zajistit správnou izolaci PN od jiných typů buněk, je strategie třídění buněk nastavena na základě přímého srovnání intenzity YFP a autofluorescence u myší mitoYFP+ ​​​​a kontrolních myší mitoYFP −. YFP je excitován ozářením vzorku laserovým paprskem o vlnové délce 488 nm a signál je detekován pomocí pásmové propusti 530/30 nm. U myší mitoYFP+ ​​​​se k rozlišení fragmentů neuronálního těla a axonu používá také relativní síla reportérového genu Rosa26-mitoYFP. 7-AAD je excitován žlutým laserem o vlnové délce 561 nm a detekován pásmovou propustí 675/20 nm, aby se vyloučily mrtvé buňky. Aby se zároveň oddělily astrocyty, byla buněčná suspenze obarvena ACSA-2-APC, poté byl vzorek ozářen laserovým paprskem o vlnové délce 640 nm a k detekci signálu byl použit pásmový filtr 660/20 nm.
Odebrané buňky byly peletovány centrifugací (1110 ot/min, 5 minut, 4 °C) a skladovány při teplotě -80 °C do použití. Myši Mfn2cKO a jejich mláďata z vrhu jsou klasifikovány ve stejný den, aby se minimalizovala variabilita postupu. Prezentace a analýza dat FACS byly provedeny pomocí softwaru FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Jak je uvedeno výše (59), k izolaci DNA z tříděných neuronů pro následnou kvantifikaci mtDNA se používá real-time PCR. Linearita a prahová citlivost byly nejprve testovány provedením qPCR na různém počtu buněk. Stručně řečeno, 300 PN bylo odebráno v lyzačním pufru sestávajícím z 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 a proteinázy K (200 ng/ml) a inkubováno při 55 °C po dobu 120 minut. Buňky byly dále inkubovány při 95 °C po dobu 10 minut, aby se zajistila úplná inaktivace proteinázy K. Pomocí sondy TaqMan (Thermo Fisher) specifické pro mt-Nd1 byla mtDNA měřena semikvantitativní PCR v systému 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Science, katalogové číslo Mm04225274_s1), geny mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalogové číslo AIVI3E8) a 18S (Thermo Fisher Scientific, katalogové číslo Hs99999901_s1).
Příprava vzorku proteomu. Zahříváním roztoku na 95 °C po dobu 10 minut a sonikací v lyzačním pufru [6 M guanidinchlorid, 10 mM tris(2-karboxyethyl)fosfin hydrochlorid, 10 mM chloracetamid a 100 mM Tris-Lyse zmrazené neuronové pelety v HCl]. Na přístroji Bioruptor (Diagenode) po dobu 10 minut (30 sekund pulz / 30 sekund pauza). Vzorek byl zředěn 1:10 v 20 mM tris-HCl (pH 8,0), smíchán s 300 ng trypsinového zlata (Promega) a inkubován přes noc při 37 °C pro dosažení úplného digesce. Druhý den byl vzorek centrifugován při 20 000 g po dobu 20 minut. Supernatant byl zředěn 0,1% kyselinou mravenčí a roztok byl odsolen pomocí vlastnoručně vyrobených StageTips. Vzorek byl sušen v přístroji SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) při 45 °C a poté byl peptid suspendován v 0,1% kyselině mravenčí. Všechny vzorky byly připraveny současně stejnou osobou. Pro analýzu vzorků astrocytů bylo 4 μg odsolených peptidů značeno tandemovým hmotnostním značkovačem (TMT10plex, katalogové číslo 90110, Thermo Fisher Scientific) s poměrem peptidu k činidlu TMT 1:20. Pro značení TMT bylo 0,8 mg činidla TMT resuspendováno v 70 μl bezvodého ACN a sušený peptid byl rekonstituován do 9 μl 0,1 M TEAB (triethylamonium-hydrogenuhličitan), ke kterému bylo přidáno 7 μl činidla TMT v ACN. Koncentrace byla 43,75 %. Po 60 minutách inkubace byla reakce ukončena 2 μl 5% hydroxylaminu. Značené peptidy byly shromážděny, sušeny, resuspendovány ve 200 μl 0,1% kyseliny mravenčí (FA), rozděleny na dvě části a poté odsoleny pomocí vlastnoručně vyrobených StageTips. Za použití ultravysoce výkonného kapalinového chromatografu UltiMate 3000 (ultravysoce výkonný kapalinový chromatograf UltiMate 3000) byla jedna ze dvou polovin frakcionována na chromatografické koloně Acquity o rozměrech 1 mm x 150 mm naplněné částicemi C18 o velikosti 130 Å1,7 μm (Waters, katalogové číslo SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific. Peptidy byly separovány průtokem 30 μl/min, separovány od 1 % do 50 % pufru B po dobu 85 minut s postupným gradientem 96 minut, od 50 % do 95 % pufru B po dobu 3 minut, poté 8 minut pro 95 % pufr B; Pufr A je 5% ACN a 10 mM hydrogenuhličitanu amonného (ABC) a pufr B je 80% ACN a 10 mM ABC. Frakce sbírejte každé 3 minuty a sloučte je do dvou skupin (1 + 17, 2 + 18 atd.) a vysušte je ve vakuové odstředivce.
Analýza LC-MS/MS. Pro hmotnostní spektrometrii byly peptidy (číslo r119.aq) separovány na analytické koloně PicoFrit o průměru 25 cm a vnitřním průměru 75 μm (nová objektivová čočka, číslo dílu PF7508250) vybavené médiem ReproSil-Pur 120 C18-AQ o průměru 1,9 μm (Dr. Maisch, mat), použijte EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Německo). Kolona byla udržována při teplotě 50 °C. Pufry A a B jsou 0,1% kyselina mravenčí ve vodě a 0,1% kyselina mravenčí v 80% ACN. Peptidy byly separovány z 6% na 31% pufr B po dobu 65 minut a z 31% na 50% pufr B po dobu 5 minut s gradientem 200 nl/min. Eluované peptidy byly analyzovány na hmotnostním spektrometru Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Měření m/z peptidového prekurzoru se provádí s rozlišením 120 000 v rozsahu 350 až 1500 m/z. S využitím 27% normalizované energie srážky je pro štěpení pomocí disociace C pasti (HCD) s vysokou energií vybrán nejsilnější prekurzor s nábojovým stavem 2 až 6. Doba cyklu je nastavena na 1 s. Hodnota m/z peptidového fragmentu byla měřena v iontové pastě s použitím nejmenšího AGC terče 5×104 a maximální doby vstřikování 86 ms. Po fragmentaci byl prekurzor na 45 s umístěn na seznam dynamického vyloučení. Peptidy značené TMT byly separovány na 50 cm, 75 μm koloně Acclaim PepMap (Thermo Fisher Scientific, katalogové číslo 164942) a migrační spektra byla analyzována na hmotnostním spektrometru Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) vybaveném zařízením FAIMS (High-field Asymmetric Waveflow Ionts) (Thermo Fisher Scientific), které pracuje se dvěma kompenzačními napětími −50 a −70 V. Pro měření signálu TMT reportovaných iontů se používá MS3 vybraný na základě synchronizačního prekurzoru. Separace peptidů byla provedena na přístroji EASY-nLC 1200 s 90% lineární gradientovou elucí a koncentrací pufru 6 % až 31 %; pufr A byl 0,1 % FA a pufr B byl 0,1 % FA a 80 % ACN. Analytická kolona se provozuje při 50 °C. Pro rozdělení původního souboru podle kompenzačního napětí FAIMS použijte program FreeStyle (verze 1.6, Thermo Fisher Scientific).
Identifikace a kvantifikace proteinů. Původní data byla analyzována pomocí integrovaného vyhledávače Andromeda pomocí programu MaxQuant verze 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Kromě sekvencí Cre rekombinázy a YFP získaných z Aequorea victoria byla ve spektrech peptidových fragmentů vyhledána kanonická sekvence a izoformní sekvence myšího referenčního proteomu (Proteome ID UP000000589, staženo z UniProt v květnu 2017). Oxidace methioninu a N-terminální acetylace proteinu byly nastaveny jako variabilní modifikace; methylace cysteinu karbamoylem byla nastavena jako fixní modifikace. Parametry štěpení jsou nastaveny na „specifičnost“ a „trypsin/P“. Minimální počet peptidů a razor peptidů použitých pro identifikaci proteinu je 1; minimální počet unikátních peptidů je 0. Za podmínek porovnávání peptidových map byla míra identifikace proteinu 0,01. Je povolena možnost „Druhý peptid“. Pro přenos úspěšných identifikací mezi různými originálními soubory použijte možnost „porovnávání mezi běhy“. Pro kvantifikaci bez značení (LFQ) použijte minimální poměr LFQ s číslem 1 (60). Intenzita LFQ je filtrována pro alespoň dvě platné hodnoty v alespoň jedné genotypové skupině v každém časovém bodě a je extrapolována z normálního rozdělení s šířkou 0,3 a posunem dolů o 1,8. Pro analýzu výsledků LFQ použijte výpočetní platformu Perseus (https://maxquant.net/perseus/) a R (https://r-project.org/). Pro analýzu diferenciální exprese byl použit obousměrný střední t-test ze softwarového balíčku limma (61). Explorativní analýza dat je provedena pomocí ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally a pheatmap. Proteomická data založená na TMT byla analyzována pomocí MaxQuant verze 1.6.10.43. Vyhledejte nezpracovaná proteomická data v databázi lidské proteomiky UniProt, která byla stažena v září 2018. Analýza zahrnuje korekční faktor izotopové čistoty poskytnutý výrobcem. Použijte limma v R pro analýzu diferenciálních výrazů. Původní data, výsledky vyhledávání v databázi a pracovní postup a výsledky analýzy dat jsou uloženy v alianci ProteomeXchange prostřednictvím partnerského repozitáře PRIDE s identifikátorem datové sady PXD019690.
Analýzu obohacují funkční anotace. K určení bohatosti termínů funkčních anotací v datové sadě po 8 týdnech byl použit nástroj Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) (obrázek 1). Stručně řečeno, kvantitativní seznam proteinů získaný z analýzy dat LC-MS/MS (tandemová hmotnostní spektrometrie) byl použit s následujícími kritérii filtrování: Jako druh a pozadí je vybrán Mus musculus a kategorie ukazuje, že hodnota P upravená Benjaminim pro obohacení 0,05 nebo nižší je považována za významnou. V tomto grafu je zobrazeno pět nejvyšších nadbytečných kategorií v každém klastru na základě upravené hodnoty P. Pomocí vícenásobného t-testu, s použitím dvoustupňového lineárního boost programu Benjaminiho, Kriegera a Yekutieliho (Q = 5 %), je provedena analýza exprese proteinů v čase u důležitých kandidátů identifikovaných v každé kategorii a každý řádek je analyzován samostatně. Není nutné používat konzistentní SD.
Abychom mohli porovnat výsledky této studie s publikovanými databázemi a vytvořit Vennův diagram na obrázku 1, zkombinovali jsme kvantitativní seznam proteinů s anotacemi MitoCarta 2.0 (24). K vygenerování diagramu jsme použili online nástroj Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
Podrobné informace o statistických postupech použitých pro proteomickou analýzu naleznete v příslušné části Materiály a metody. Pro všechny ostatní experimenty lze nalézt podrobné informace v odpovídající legendě. Pokud není uvedeno jinak, všechna data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM a všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru GraphPad Prism 8.1.2.
Doplňující materiály k tomuto článku naleznete na adrese http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný za podmínek licence Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, která umožňuje použití, distribuci a reprodukci v jakémkoli médiu, pokud konečné použití není pro komerční zisk a předpokladem je, že původní dílo je správné. Odkaz.
Poznámka: O uvedení vaší e-mailové adresy vás žádáme pouze proto, aby osoba, kterou stránce doporučíte, věděla, že chcete, aby e-mail viděla, a že se nejedná o spam. Nebudeme zaznamenávat žádné e-mailové adresy.
Tato otázka se používá k ověření, zda jste návštěvník, a k zabránění automatickému odesílání spamu.
Autor E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomická analýza dysfunkčních neuronů ukázala, že metabolické programy jsou aktivovány, aby působily proti neurodegeneraci.
Autor E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomická analýza dysfunkčních neuronů ukázala, že metabolické programy jsou aktivovány, aby působily proti neurodegeneraci.
©2020 American Association for the Advancement of Science. všechna práva vyhrazena. AAAS je partnerem HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.