Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepších výsledků doporučujeme používat novější verzi prohlížeče (nebo v aplikaci Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Mezitím, abychom zajistili průběžnou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Kyselina propionová (PPA) se používá ke studiu role mitochondriální dysfunkce u neurovývojových poruch, jako je porucha autistického spektra. Je známo, že PPA narušuje mitochondriální biogenezi, metabolismus a obměnu. Účinky PPA na mitochondriální dynamiku, štěpení a fúzi však zůstávají problematické kvůli komplexní časové povaze těchto mechanismů. V této studii používáme doplňkové kvantitativní zobrazovací techniky ke zkoumání, jak PPA ovlivňuje mitochondriální ultrastrukturu, morfologii a dynamiku v neuronům podobných buňkách SH-SY5Y. PPA (5 mM) způsobila významný pokles mitochondriální plochy (p < 0,01), průměru a obvodu Feretových lebek (p < 0,05) a plochy 2 (p < 0,01). Analýza lokátoru mitochondriálních událostí ukázala významný nárůst (p < 0,05) štěpných a fúzních událostí, čímž se zachovala integrita mitochondriální sítě za stresových podmínek. Kromě toho byla významně snížena exprese mRNA cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) a OPA1 (p < 0,05). To ilustruje remodelaci mitochondriální morfologie, biogeneze a dynamiky pro udržení funkce za stresových podmínek. Naše data poskytují nový vhled do vlivu PPA na mitochondriální dynamiku a zdůrazňují užitečnost zobrazovacích technik pro studium komplexních regulačních mechanismů zapojených do mitochondriálních stresových reakcí.
Mitochondrie se nedílně podílejí na řadě buněčných funkcí nad rámec svých typických rolí v produkci energie a biosyntéze. Mitochondriální metabolismus je klíčovým regulátorem kalciové signalizace, metabolické a redoxní homeostázy, zánětlivé signalizace, epigenetických modifikací, buněčné proliferace, diferenciace a programované buněčné smrti1. Zejména mitochondriální metabolismus je kritický pro vývoj, přežití a funkci neuronů a je široce zapojen do různých projevů neuropatologie2,3,4.
Během posledního desetiletí se metabolický stav stal centrálním regulátorem neurogeneze, diferenciace, zrání a plasticity5,6. V poslední době se mitochondriální morfologie a dynamika staly obzvláště důležitými součástmi mitózy, dynamického procesu, který udržuje zásobu zdravých mitochondrií v buňkách. Mitochondriální dynamika je regulována komplexními vzájemně závislými drahami od mitochondriální biogeneze a bioenergetiky až po mitochondriální štěpení, fúzi, transport a clearance7,8. Narušení kteréhokoli z těchto integračních mechanismů narušuje udržování zdravých mitochondriálních sítí a má závažné funkční důsledky pro neurovývoj9,10. Dysregulace mitochondriální dynamiky je skutečně pozorována u mnoha psychiatrických, neurodegenerativních a neurovývojových poruch, včetně poruch autistického spektra (PAS)11,12.
Porucha autistického spektra (PAS) je heterogenní neurovývojová porucha se složitou genetickou a epigenetickou architekturou. Dědičnost PAS je nesporná, ale základní molekulární etiologie zůstává nedostatečně pochopena. Hromadící se data z preklinických modelů, klinických studií a multi-omických molekulárních dat poskytují stále více důkazů o mitochondriální dysfunkci u PAS13,14. Dříve jsme provedli screening metylace DNA v celém genomu u kohorty pacientů s PAS a identifikovali jsme diferencovaně metylované geny seskupené podél mitochondriálních metabolických drah15. Následně jsme popsali diferenciální metylaci centrálních regulátorů mitochondriální biogeneze a dynamiky, která byla spojena se zvýšeným počtem kopií mtDNA a změněným metabolickým profilem moči u PAS16. Naše data poskytují stále více důkazů o tom, že mitochondriální dynamika a homeostáza hrají ústřední roli v patofyziologii PAS. Proto je zlepšení mechanistického chápání vztahu mezi mitochondriální dynamikou, morfologií a funkcí klíčovým cílem probíhajícího výzkumu neurologických onemocnění charakterizovaných sekundární mitochondriální dysfunkcí.
Molekulární techniky se často používají ke studiu role specifických genů v mitochondriálních stresových reakcích. Tento přístup však může být omezen mnohostrannou a časovou povahou mitotických kontrolních mechanismů. Diferenciální exprese mitochondriálních genů je navíc nepřímým ukazatelem funkčních změn, zejména proto, že se obvykle analyzuje pouze omezený počet genů. Proto byly navrženy přímější metody pro studium mitochondriální funkce a bioenergetiky17. Morfologie mitochondrií úzce souvisí s mitochondriální dynamikou. Tvar, konektivita a struktura mitochondrií jsou klíčové pro produkci energie a přežití mitochondrií a buněk5,18. Různé složky mitózy se navíc zaměřují na změny v mitochondriální morfologii, které mohou sloužit jako užitečné koncové body mitochondriální dysfunkce a poskytnout základ pro následné mechanistické studie.
Mitochondriální morfologii lze přímo pozorovat pomocí transmisní elektronové mikroskopie (TEM), což umožňuje detailní studium buněčné ultrastruktury. TEM přímo vizualizuje morfologii, tvar a strukturu mitochondriálních krist při rozlišení jednotlivých mitochondrií, spíše než aby se spoléhala pouze na transkripci genů, expresi proteinů nebo mitochondriální funkční parametry v buněčných populacích17,19,20. Kromě toho TEM usnadňuje studium interakcí mezi mitochondriemi a dalšími organelami, jako je endoplazmatické retikulum a autofagosomy, které hrají klíčovou roli v mitochondriální funkci a homeostáze21,22. Díky tomu je TEM dobrým výchozím bodem pro studium mitochondriální dysfunkce před zaměřením na specifické dráhy nebo geny. Vzhledem k tomu, že mitochondriální funkce se stává stále relevantnější pro neuropatologii, existuje jasná potřeba být schopen přímo a kvantitativně studovat mitochondriální morfologii a dynamiku v neuronálních modelech in vitro.
V tomto článku zkoumáme mitochondriální dynamiku v neuronálním modelu mitochondriální dysfunkce u poruch autistického spektra. Dříve jsme popsali diferenciální metylaci propionyl-CoA karboxylázy beta (PCCB) v ASD15, podjednotce mitochondriálního enzymu propionyl-CoA karboxylázy PCC. Je známo, že dysregulace PCC způsobuje toxickou akumulaci propionylových derivátů, včetně kyseliny propionové (PPA)23,24,25. Bylo prokázáno, že PPA narušuje neuronální metabolismus a mění chování in vivo a je zavedeným zvířecím modelem pro studium neurovývojových mechanismů zapojených do ASD26,27,28. Kromě toho bylo hlášeno, že PPA narušuje mitochondriální membránový potenciál, biogenezi a dýchání in vitro a byla široce používána k modelování mitochondriální dysfunkce v neuronech29,30. Dopad mitochondriální dysfunkce indukované PPA na morfologii a dynamiku mitochondrií však zůstává nedostatečně pochopen.
Tato studie využívá komplementární zobrazovací techniky ke kvantifikaci vlivu PPA na morfologii, dynamiku a funkci mitochondrií v buňkách SH-SY5Y. Nejprve jsme vyvinuli metodu TEM pro vizualizaci změn v morfologii a ultrastruktuře mitochondrií17,31,32. Vzhledem k dynamické povaze mitochondrií33 jsme také použili analýzu lokalizátoru mitochondriálních událostí (MEL) ke kvantifikaci změn v rovnováze mezi štěpením a fúzí, počtu a objemu mitochondrií při stresu PPA. Nakonec jsme zkoumali, zda je morfologie a dynamika mitochondrií spojena se změnami v expresi genů zapojených do biogeneze, štěpení a fúze. Celkově vzato naše data ilustrují výzvu objasnit složitost mechanismů regulujících mitochondriální dynamiku. Zdůrazňujeme užitečnost TEM při studiu mitochondriální morfologie jako měřitelného konvergentního koncového bodu mitózy v buňkách SH-SY5Y. Dále zdůrazňujeme, že data TEM poskytují nejbohatší informace v kombinaci se zobrazovacími technikami, které také zachycují dynamické události v reakci na metabolický stres. Další charakterizace molekulárních regulačních mechanismů, které podporují mitózu neuronálních buněk, může poskytnout důležitý vhled do mitochondriální složky nervového systému a neurodegenerativních onemocnění.
Pro vyvolání mitochondriálního stresu byly buňky SH-SY5Y ošetřeny PPA s použitím 3 mM a 5 mM propionátu sodného (NaP). Před TEM byly vzorky podrobeny kryogenní přípravě vzorků za použití vysokotlakého zmrazení a následného zmrazení (obr. 1a). Vyvinuli jsme automatizovaný postup pro analýzu mitochondriálního obrazu pro měření osmi morfologických parametrů mitochondriálních populací ve třech biologických replikátech. Zjistili jsme, že ošetření PPA významně změnilo čtyři parametry: plochu 2, plochu, obvod a Feretův průměr (obr. 1b–e). Plocha 2 se významně snížila jak při ošetření 3 mM, tak i 5 mM PPA (p = 0,0183 a p = 0,002) (obr. 1b), zatímco plocha (p = 0,003), obvod (p = 0,0106) a Feretův průměr se významně snížily. Ve skupině ošetřené 5 mM došlo k významnému snížení (p = 0,0172) ve srovnání s kontrolní skupinou (obr. 1c–e). Významné zmenšení plochy a obvodu ukázalo, že buňky ošetřené 5 mM PPA měly menší, zaoblenější mitochondrie a že tyto mitochondrie byly méně protáhlé než mitochondrie v kontrolních buňkách. To je také v souladu s významným poklesem Feretova průměru, což je nezávislý parametr, který naznačuje pokles největší vzdálenosti mezi okraji částic. Byly pozorovány změny v ultrastruktuře krist: kristy se pod vlivem stresu PPA staly méně výraznými (obr. 1a, panel B). Ne všechny snímky však jasně odrážely ultrastrukturu krist, takže kvantitativní analýza těchto změn nebyla provedena. Tato TEM data mohou odrážet tři možné scénáře: (1) PPA zvyšuje štěpení nebo inhibuje fúzi, což způsobuje zmenšení stávajících mitochondrií; (2) zvýšená biogeneze vytváří nové, menší mitochondrie nebo (3) indukuje oba mechanismy současně. Ačkoli tyto podmínky nelze pomocí TEM rozlišit, významné morfologické změny naznačují změny v mitochondriální homeostáze a dynamice pod stresem PPA. Následně jsme zkoumali další parametry, abychom dále charakterizovali tuto dynamiku a potenciální mechanismy, které ji podporují.
Kyselina propionová (PPA) remodeluje mitochondriální morfologii. (a) Reprezentativní snímky z transmisní elektronové mikroskopie (TEM) ukazují, že velikost mitochondrií se snižuje a mitochondrie se zmenšují a zaoblenější se zvyšující se léčbou PPA; 0 mM (neošetřené), 3 mM a 5 mM. Červené šipky označují mitochondrie. (b–e) Buňky SH-SY5Y ošetřené PPA po dobu 24 hodin byly připraveny pro TEM a výsledky byly analyzovány pomocí Fiji/ImageJ. Čtyři z osmi parametrů vykazovaly významné rozdíly mezi kontrolními (neošetřenými, 0 mM PPA) a ošetřenými (3 mM a 5 mM PPA) buňkami. (b) Oblast 2, (c) Plocha, (d) Obvod, (e) Průměr Fereta. Pro stanovení významných rozdílů (p < 0,05) byla použita jednosměrná analýza rozptylu (kontrola vs. ošetřená) a Dunnettův test vícenásobného srovnání. Datové body představují průměrnou hodnotu mitochondrií pro každou jednotlivou buňku a chybové úsečky představují průměr ± SEM. Zobrazená data představují n = 3, alespoň 24 buněk na replikaci; celkem bylo analyzováno 266 snímků; * označuje p < 0,05, ** označuje p < 0,01.
Pro další charakterizaci reakce mitochondriální dynamiky na PPA jsme mitochondrie obarvili tetramethylrhodamin ethylesterem (TMRE) a použili jsme časosběrnou mikroskopii a MEL analýzu k lokalizaci a kvantifikaci mitochondrií po 24 hodinách při 3 a 5 mM PPA. Léčba štěpení a fúze. (Obr. 2a). Po MEL analýze byly mitochondrie dále analyzovány za účelem kvantifikace počtu mitochondriálních struktur a jejich průměrného objemu. Pozorovali jsme malý, ale významný nárůst počtu štěpení při 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] ve srovnání se štěpením [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] a fúzí [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] a fúzí [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] (<0,05)] při 5 mM. Počet mitochondrií se významně zvýšil jak při 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)], tak při 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (obr. 3c), zatímco průměrný objem každé mitochondriální struktury zůstal nezměněn (obr. 3c). 3d). Celkově to naznačuje, že remodelace mitochondriální dynamiky slouží jako kompenzační reakce, která úspěšně udržuje integritu mitochondriální sítě. Zvýšení počtu štěpných událostí při 3 mM PPA naznačuje, že zvýšení počtu mitochondrií je částečně způsobeno mitochondriálním štěpením, ale vzhledem k tomu, že průměrný objem mitochondrií zůstává v podstatě nezměněn, nelze biogenezi vyloučit jako další kompenzační reakci. Tato data jsou však v souladu s menšími, kulatými mitochondriálními strukturami pozorovanými pomocí TEM a také demonstrují významné změny v mitochondriální dynamice vyvolané PPA.
Kyselina propionová (PPA) indukuje dynamickou mitochondriální remodelaci pro zachování integrity sítě. Buňky SH-SY5Y byly kultivovány, ošetřeny 3 a 5 mM PPA po dobu 24 hodin a barveny TMRE a Hoechst 33342, následovala MEL analýza. (a) Reprezentativní snímky z časosběrné mikroskopie zobrazující barevné a binarizované projekce maximální intenzity v čase 2 (t2) pro každou podmínku. Vybrané oblasti uvedené v každém binárním snímku jsou zvýrazněny a zobrazeny ve 3D ve třech různých časových rámcích (t1-t3) pro ilustraci dynamiky v čase; fúzní události jsou zvýrazněny zeleně; štěpné události jsou zvýrazněny zeleně. Zobrazeno červeně. (b) Průměrný počet dynamických událostí na podmínku. (c) Průměrný počet mitochondriálních struktur na buňku. (d) Průměrný objem (µm3) každé mitochondriální struktury na buňku. Zobrazená data jsou reprezentativní pro n = 15 buněk na léčenou skupinu. Zobrazené chybové úsečky představují průměr ± SEM, měřítko = 10 μm, * p < 0,05.
Kyselina propionová (PPA) způsobuje transkripční supresi genů spojených s mitochondriální dynamikou. Buňky SH-SY5Y byly ošetřeny 3 a 5 mM PPA po dobu 24 hodin. Relativní kvantifikace genů byla provedena pomocí RT-qPCR a normalizována na B2M. Geny mitochondriální biogeneze (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 a (d) NFE2L2. Geny mitochondriální fúze a fise (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 a (i) DRP1. Signifikantní rozdíly (p < 0,05) byly testovány pomocí jednocestné ANOVA (kontrola vs. léčba) a Dunnettova testu vícenásobného srovnání: * označuje p < 0,05, ** označuje p < 0,01 a **** označuje p < 0,0001. Sloupce představují průměrnou expresi ± SEM. Uvedená data představují biologické replikáty v n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) a n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1).
Data z analýz TEM a MEL společně naznačují, že PPA mění morfologii a dynamiku mitochondrií. Tyto zobrazovací techniky však neposkytují vhled do základních mechanismů, které tyto procesy řídí. Proto jsme zkoumali expresi mRNA devíti klíčových regulátorů mitochondriální dynamiky, biogeneze a mitózy v reakci na léčbu PPA. Kvantifikovali jsme onkogen buněčného myelomu (cMYC), jaderný respirační faktor (NRF1), mitochondriální transkripční faktor 1 (TFAM), transkripční faktor podobný NFE2 BZIP (NFE2L2), gastrin-like protein 2 (STOML2), atrofii zrakového nervu 1 (OPA1), mitofusin 1 (MFN1), mitofusin 2 (MFN2) a protein související s dynaminem 1 (DRP1) po 24 hodinách léčby 3 mM a 5 mM PPA. Pozorovali jsme ošetření PPA v koncentraci 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 a p < 0,0001) a 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) pokles (obr. 3a–c). Pokles exprese mRNA byl závislý na dávce: exprese cMYC, NRF1 a TFAM se při 3 mM snížila 5,7krát, 2,6krát a 1,9krát a při 5 mM 11,2krát, 3krát a 2,2krát. Naproti tomu centrální redoxní biogeneze NFE2L2 se při žádné koncentraci PPA nezměnil, ačkoli byl pozorován podobný na dávce závislý trend snížené exprese (obr. 3d).
Zkoumali jsme také expresi klasických genů zapojených do regulace štěpení a fúze. Předpokládá se, že STOML2 se podílí na fúzi, mitofagii a biogenezi a jeho exprese byla významně snížena (p < 0,0001) při 3 mM (2,4násobná změna) a 5 mM (2,8násobná změna) PPA (obr. 1). 3d). Podobně byla exprese fúzního genu OPA1 snížena při 3 mM (1,6násobná změna) a 5 mM (1,9násobná změna) PPA (p = 0,006 a p = 0,0024) (obr. 3f). Nenalezli jsme však významné rozdíly v expresi fúzních genů MFN1, MFN2 nebo štěpného genu DRP1 při 24hodinovém stresu PPA (obr. 3g–i). Dále jsme zjistili, že hladiny čtyř fúzních a štěpných proteinů (OPA1, MFN1, MFN2 a DRP1) se za stejných podmínek nezměnily (obr. 4a–d). Je důležité poznamenat, že tato data odrážejí jeden časový bod a nemusí odrážet změny v expresi nebo hladinách aktivity proteinů během raných fází stresu PPA. Významné snížení exprese cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 a OPA1 však naznačuje významnou transkripční dysregulaci mitochondriálního metabolismu, biogeneze a dynamiky. Tato data navíc zdůrazňují užitečnost zobrazovacích technik pro přímé studium změn konečného stavu mitochondriální funkce.
Hladiny proteinů fúzních a štěpných faktorů se po ošetření kyselinou propionovou (PPA) nezměnily. Buňky SH-SY5Y byly ošetřeny 3 a 5 mM PPA po dobu 24 hodin. Hladiny proteinů byly kvantifikovány Western blot analýzou a hladiny exprese byly normalizovány na celkový protein. Jsou znázorněny průměrná exprese proteinů a reprezentativní Western bloty cílového a celkového proteinu. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Sloupce představují průměr ± SEM a zobrazená data jsou reprezentativní pro n = 3 biologické replikáty. Vícenásobná srovnání (p < 0,05) byla provedena pomocí jednocestné analýzy rozptylu a Dunnettova testu. Původní gel a blot jsou znázorněny na obrázku S1.
Mitochondriální dysfunkce je spojena s multisystémovými onemocněními, od metabolických, kardiovaskulárních a svalových onemocnění až po neurologická onemocnění1,10. Mnoho neurodegenerativních a neurodegenerativních onemocnění je spojeno s mitochondriální dysfunkcí, což zdůrazňuje význam těchto organel po celou dobu života mozku. Mezi tato onemocnění patří Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba a porucha autistického spektra3,4,18. Přístup k mozkové tkáni pro studium těchto onemocnění je však obtížný, zejména na mechanistické úrovni, což činí buněčné modelové systémy nezbytnou alternativou. V této studii používáme buněčný modelový systém s použitím buněk SH-SY5Y ošetřených PPA k rekapitulaci mitochondriální dysfunkce pozorované u neuronálních onemocnění, zejména poruch autistického spektra. Použití tohoto PPA modelu ke studiu mitochondriální dynamiky v neuronech může poskytnout vhled do etiologie PAS.
Zkoumali jsme možnost využití TEM k pozorování změn v mitochondriální morfologii. Je důležité poznamenat, že TEM musí být používán správně, aby se maximalizovala jeho účinnost. Příprava kryogenních vzorků umožňuje lepší zachování neuronálních struktur současně fixací buněčných složek a snížením tvorby artefaktů34. V souladu s tím jsme pozorovali, že neuronům podobné buňky SH-SY5Y měly intaktní subcelulární organely a protáhlé mitochondrie (obr. 1a). To zdůrazňuje užitečnost kryogenních přípravných technik pro studium mitochondriální morfologie v neuronálních buněčných modelech. Ačkoli kvantitativní měření jsou klíčová pro objektivní analýzu dat TEM, stále neexistuje shoda na tom, jaké specifické parametry by měly být měřeny pro potvrzení mitochondriálních morfologických změn. Na základě velkého počtu studií, které kvantitativně zkoumaly mitochondriální morfologii17,31,32, jsme vyvinuli automatizovaný postup pro analýzu mitochondriálních obrazů, který měří osm morfologických parametrů, a to: plochu, plochu², poměr stran, obvod, kruhovitost, stupeň , Feretův průměr a kruhovitost.
Mezi nimi PPA významně zmenšila plochu 2, plochu, obvod a Feretův průměr (obr. 1b–e). To ukázalo, že mitochondrie se zmenšily a zaoblily, což je v souladu s předchozími studiemi, které prokázaly pokles mitochondriální plochy po 72 hodinách mitochondriálního stresu indukovaného PPA30. Tyto morfologické znaky mohou naznačovat mitochondriální štěpení, což je nezbytný proces k oddělení poškozených složek z mitochondriální sítě a podpoře jejich degradace prostřednictvím mitofagie35,36,37. Na druhou stranu může být pokles průměrné velikosti mitochondrií spojen se zvýšenou biogenezí, která vede k tvorbě malých vznikajících mitochondrií. Zvýšené štěpení nebo biogeneze představuje kompenzační reakci k udržení mitózy proti mitochondriálnímu stresu. Nelze však vyloučit snížený mitochondriální růst, zhoršenou fúzi nebo jiné stavy.
Ačkoli snímky s vysokým rozlišením vytvořené pomocí TEM umožňují stanovení morfologických charakteristik na úrovni jednotlivých mitochondrií, tato metoda produkuje dvourozměrné snímky v jednom časovém bodě. Pro studium dynamických reakcí na metabolický stres jsme barvili mitochondrie pomocí TMRE a použili časosběrnou mikroskopii s MEL analýzou, která umožňuje vysoce výkonnou 3D vizualizaci změn v mitochondriální síti v čase33,38. Pozorovali jsme jemné, ale významné změny v mitochondriální dynamice při stresu PPA (obr. 2). Při 3 mM se počet štěpných událostí významně zvýšil, zatímco fúzní události zůstaly stejné jako v kontrole. Při 5 mM PPA byl pozorován nárůst počtu štěpných i fúzních událostí, ale tyto změny byly přibližně proporcionální, což naznačuje, že kinetika štěpení a fúze dosahuje rovnováhy při vyšších koncentracích (obr. 2b). Průměrný objem mitochondrií zůstal nezměněn při 3 i 5 mM PPA, což naznačuje, že integrita mitochondriální sítě byla zachována (obr. 2d). To odráží schopnost dynamických mitochondriálních sítí reagovat na mírný metabolický stres a účinně udržovat homeostázu, aniž by způsobovala fragmentaci sítě. Při 3 mM PPA je zvýšení štěpení dostatečné k podpoře přechodu do nové rovnováhy, ale v reakci na stres vyvolaný vyššími koncentracemi PPA je nutná hlubší kinetická remodelace.
Počet mitochondrií se zvýšil při obou koncentracích stresu PPA, ale průměrný objem mitochondrií se významně nezměnil (obr. 2c). To může být způsobeno zvýšenou biogenezí nebo zvýšeným dělením; nicméně při absenci významného poklesu průměrného objemu mitochondrií je pravděpodobnější, že se biosyntéza zvyšuje. Data na obrázku 2 však podporují existenci dvou kompenzačních mechanismů: zvýšení počtu štěpných událostí, což je v souladu se zvýšenou regulací mitochondriálního štěpení, a zvýšení počtu událostí, což je v souladu s mitochondriální biogenezí. Dynamická kompenzace mírného stresu může v konečném důsledku sestávat ze simultánních procesů zahrnujících štěpení, fúzi, biogenezi a mitofagii. Ačkoli předchozí autoři prokázali, že PPA zvyšuje mitózu30,39 a mitofagii29, my poskytujeme důkazy o remodelaci dynamiky mitochondriálního štěpení a fúze v reakci na PPA. Tato data potvrzují morfologické změny pozorované pomocí TEM a poskytují další vhled do mechanismů spojených s mitochondriální dysfunkcí indukovanou PPA.
Protože ani TEM, ani MEL analýza neposkytly přímý důkaz o genových regulačních mechanismech, které jsou základem pozorovaných morfologických změn, zkoumali jsme RNA expresi genů zapojených do mitochondriálního metabolismu, biogeneze a dynamiky. Protoonkogen cMYC je transkripční faktor zapojený do regulace mitochondrií, glykolýzy, metabolismu aminokyselin a mastných kyselin40. Kromě toho je známo, že cMYC reguluje expresi téměř 600 mitochondriálních genů zapojených do mitochondriální transkripce, translace a sestavování komplexů, včetně NRF1 a TFAM41. NRF1 a TFAM jsou dva centrální regulátory mitózy, které působí po signální dráze PGC-1α a aktivují replikaci mtDNA. Tato dráha je aktivována signalizací cAMP a AMPK a je citlivá na energetický výdej a metabolický stres. Zkoumali jsme také NFE2L2, redoxní regulátor mitochondriální biogeneze, abychom zjistili, zda by účinky PPA mohly být zprostředkovány oxidačním stresem.
Ačkoli exprese NFE2L2 zůstala nezměněna, zjistili jsme konzistentní, na dávce závislý pokles exprese cMYC, NRF1 a TFAM po 24 hodinách léčby 3 mM a 5 mM PPA (obr. 3a–c). Snížení exprese cMYC bylo dříve popsáno jako reakce na mitochondriální stres42 a naopak, snížení exprese cMYC může způsobit mitochondriální dysfunkci remodelací mitochondriálního metabolismu, síťové konektivity a membránové polarizace43. Je zajímavé, že cMYC se také podílí na regulaci mitochondriálního štěpení a fúze42,43 a je známo, že zvyšuje fosforylaci DRP1 a lokalizaci mitochondrií během buněčného dělení44, stejně jako zprostředkovává mitochondriální morfologickou remodelaci v neuronálních kmenových buňkách45. Fibroblasty s deficitem cMYC skutečně vykazují sníženou velikost mitochondrií, což je v souladu se změnami vyvolanými stresem PPA43. Tato data ilustrují zajímavý, ale dosud nejasný vztah mezi cMYC a mitochondriální dynamikou a poskytují zajímavý cíl pro budoucí studie remodelace indukované stresem PPA.
Snížení NRF1 a TFAM je v souladu s rolí cMYC jakožto důležitého transkripčního aktivátoru. Tato data jsou také v souladu s předchozími studiemi na lidských buňkách rakoviny tlustého střeva, které ukázaly, že PPA snížila expresi mRNA NRF1 po 22 hodinách, což bylo spojeno s deplecí ATP a zvýšením ROS46. Tito autoři také uvedli, že exprese TFAM se zvýšila po 8,5 hodinách, ale vrátila se na výchozí hodnoty po 22 hodinách. Naproti tomu Kim a kol. (2019) ukázali, že exprese mRNA TFAM byla po 4 hodinách stresu PPA v buňkách SH-SY5Y významně snížena; po 72 hodinách však byla exprese proteinu TFAM významně zvýšena a počet kopií mtDNA byl významně zvýšen. Pokles počtu genů mitochondriální biogeneze, který jsme pozorovali po 24 hodinách, tedy nevylučuje možnost, že zvýšení počtu mitochondrií je spojeno s aktivací biogeneze v dřívějších časových bodech. Předchozí studie ukázaly, že PPA významně zvyšuje regulaci mRNA a proteinu PGC-1α v buňkách SH-SY5Y po ​​4 hodinách a 30 minutách, zatímco kyselina propionová zvyšuje mitochondriální biogenezi v telatých hepatocytech prostřednictvím PGC-1α po 12 hodinách a 39 minutách. Je zajímavé, že PGC-1α není jen přímým transkripčním regulátorem NRF1 a TFAM, ale bylo také prokázáno, že reguluje aktivitu MFN2 a DRP1 regulací štěpení a fúze47. Celkově vzato to zdůrazňuje úzkou vazbu mechanismů regulujících mitochondriální kompenzační reakce indukované PPA. Naše data navíc odrážejí významnou dysregulaci transkripční regulace biogeneze a metabolismu při stresu PPA.
Geny STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 a DRP1 patří mezi centrální regulátory mitochondriálního štěpení, fúze a dynamiky37,48,49. Existuje mnoho dalších genů zapojených do mitochondriální dynamiky, nicméně u STOML2, OPA1 a MFN2 bylo dříve zjištěno, že jsou v kohortách s ASD diferencovaně metylovány16 a několik nezávislých studií uvádí změny v těchto transkripčních faktorech v reakci na mitochondriální stres50,51.52. Exprese OPA1 i STOML2 byla významně snížena léčbou 3 mM a 5 mM PPA (obr. 3e, f). OPA1 je jedním z klasických regulátorů mitochondriální fúze prostřednictvím přímé interakce s MFN1 a 2 a hraje roli v remodelaci krist a mitochondriální morfologii53. Přesná role STOML2 v mitochondriální dynamice zůstává nejasná, ale důkazy naznačují, že hraje roli v mitochondriální fúzi, biogenezi a mitofagii.
STOML2 se podílí na udržování mitochondriální respirační vazby a tvorby komplexů dýchacího řetězce54,55 a bylo prokázáno, že výrazně mění metabolické vlastnosti rakovinných buněk56. Studie ukázaly, že STOML2 podporuje mitochondriální membránový potenciál a biogenezi prostřednictvím interakce s BAN a kardiolipinem55, 57, 58. Nezávislé studie navíc ukázaly, že interakce mezi STOML2 a PINK1 reguluje mitofagii59,60. Je pozoruhodné, že STOML2 přímo interaguje s MFN2 a stabilizuje ho a také hraje důležitou roli ve stabilizaci dlouhých izoforem OPA1 inhibicí proteázy zodpovědné za degradaci OPA153,61,62. Snížení exprese STOML2 pozorované v reakcích PPA může učinit tyto fúzní proteiny náchylnějšími k degradaci prostřednictvím drah závislých na ubikvitinu a proteazomu48. Ačkoli přesná role STOML2 a OPA1 v dynamické odpovědi na PPA není jasná, snížená exprese těchto fúzních genů (obrázek 3) může narušit rovnováhu mezi štěpením a fúzí a vést ke zmenšení velikosti mitochondrií (obrázek 3). 1).
Na druhou stranu, exprese proteinu OPA1 zůstala po 24 hodinách nezměněna, zatímco hladiny mRNA a proteinů MFN1, MFN2 nebo DRP1 se po ošetření PPA významně nezměnily (obr. 3g-i, obr. 4). To může naznačovat, že nedochází ke změnám v regulaci těchto faktorů zapojených do mitochondriální fúze a štěpení. Stojí však za zmínku, že každý z těchto čtyř genů je také regulován posttranskripčními modifikacemi (PTM), které řídí aktivitu proteinů. OPA1 má osm alternativních sestřihových variant, které jsou proteolyticky štěpeny v mitochondriích za vzniku dvou odlišných izoform 63. Rovnováha mezi dlouhými a krátkými izoformami nakonec určuje roli OPA1 v mitochondriální fúzi a udržování mitochondriální sítě 64. Aktivita DRP1 je regulována fosforylací kalcium/kalmodulin-dependentní proteinkinázy II (CaMKII), zatímco degradace DRP1 je regulována ubikvitinací a SUMOylací 65. Konečně, jak DRP1, tak MFN1/2 jsou GTPázy, takže aktivita může být ovlivněna rychlostí produkce GTP v mitochondriích 66. Proto, i když exprese těchto proteinů zůstává konstantní, nemusí to odrážet nezměněnou aktivitu nebo lokalizaci proteinů 67,68. Stávající repertoáry proteinů PTM často slouží jako první linie obrany zodpovědná za zprostředkování akutních stresových reakcí. V přítomnosti mírného metabolického stresu v našem modelu je pravděpodobné, že PTM podporuje zvýšenou aktivitu fúzních a štěpných proteinů k dostatečnému obnovení mitochondriální integrity, aniž by bylo nutné dodatečně aktivovat tyto geny na úrovni mRNA nebo proteinu.
Výše uvedené údaje dohromady zdůrazňují komplexní a časově závislou regulaci mitochondriální morfologie a výzvy spojené s objasněním těchto mechanismů. Pro studium genové exprese je nejprve nutné identifikovat specifické cílové geny v této dráze. Naše data však ukazují, že geny ve stejné dráze nereagují stejným způsobem na stejný stres. Předchozí studie dokonce ukázaly, že různé geny ve stejné dráze mohou vykazovat různé časové profily odezvy30,46. Kromě toho existují komplexní posttranskripční mechanismy, které narušují vztah mezi transkripcí a funkcí genů. Proteomické studie mohou poskytnout vhled do dopadu PTM a funkce proteinů, ale také představují výzvy, včetně metod s nízkou propustností, vysokého poměru signálu k šumu a nízkého rozlišení.
V této souvislosti má studium mitochondriální morfologie pomocí TEM a MEL velký potenciál k řešení základních otázek týkajících se vztahu mezi dynamikou a funkcí mitochondrií a toho, jak to ovlivňuje onemocnění. Nejdůležitější je, že TEM poskytuje přímou metodu pro měření mitochondriální morfologie jako konvergentního koncového bodu mitochondriální dysfunkce a dynamiky51. MEL také poskytuje přímou metodu pro vizualizaci štěpení a fúze v trojrozměrném buněčném prostředí, což umožňuje kvantifikaci dynamické mitochondriální remodelace i bez změn v genové expresi33. Zde zdůrazňujeme užitečnost mitochondriálních zobrazovacích technik u sekundárních mitochondriálních onemocnění. Tato onemocnění jsou typicky charakterizována chronickým mírným metabolickým stresem, který je charakterizován jemnou remodelací mitochondriálních sítí, spíše než akutním mitochondriálním poškozením. Mitochondriální kompenzace potřebná k udržení mitózy za chronického stresu má však hluboké funkční důsledky. V kontextu neurovědy může lepší pochopení těchto kompenzačních mechanismů poskytnout důležité informace o pleiotropní neuropatologii spojené s mitochondriální dysfunkcí.
Naše data v konečném důsledku zdůrazňují užitečnost zobrazovacích technik pro pochopení funkčních důsledků komplexních interakcí mezi genovou expresí, modifikacemi proteinů a aktivitou proteinů, které řídí dynamiku neuronálních mitochondrií. Použili jsme PPA k modelování mitochondriální dysfunkce v neuronálním buněčném modelu, abychom získali vhled do mitochondriální složky ASD. Buňky SH-SY5Y ošetřené PPA vykazovaly změny v mitochondriální morfologii: mitochondrie se staly malými a kulatými a kristy byly při pozorování pomocí TEM špatně definované. Analýza MEL ukazuje, že k těmto změnám dochází současně se zvýšením štěpení a fúzí, aby se udržela mitochondriální síť v reakci na mírný metabolický stres. PPA navíc významně narušuje transkripční regulaci mitochondriálního metabolismu a homeostázy. Identifikovali jsme cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 a OPA1 jako klíčové mitochondriální regulátory narušené stresem PPA a mohou hrát roli v mediaci změn v mitochondriální morfologii a funkci vyvolaných PPA. Pro lepší charakterizaci časových změn v genové expresi a aktivitě proteinů, lokalizaci a posttranslačních modifikacích vyvolaných PPA jsou zapotřebí další studie. Naše data zdůrazňují složitost a vzájemnou závislost regulačních mechanismů zprostředkovávajících mitochondriální stresovou reakci a demonstrují užitečnost TEM a dalších zobrazovacích technik pro cílenější mechanistické studie.
Buněčná linie SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) byla zakoupena od společnosti Sigma-Aldrich. Buňky SH-SY5Y byly pěstovány v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu/živné směsi F-12 (DMEM/F-12) a L-glutaminu (SC09411, ScienCell) v 25cm2 baňkách doplněných 20% fetálním bovinním sérem (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) a 1% penicilinem-streptomycinem (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) při 37 °C, 5% CO2. Buňky byly subkultivovány do 80% konfluence za použití 0,05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugovány při 300 g a naneseny na plotny v hustotě přibližně 7 × 105 buněk/ml. Všechny experimenty byly provedeny na nediferencovaných buňkách SH-SY5Y mezi pasážemi 19–22. PPA se podává jako NaP. Prášek NaP (CAS č. 137-40-6, chemický vzorec C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) se rozpustí v teplé vodě MilliQ na koncentraci 1 M a skladuje se při 4 °C. V den ošetření se tento roztok zředí 1 M PPA na 3 mM a 5 mM PPA v bezsérovém médiu (DMEM/F-12 s L-glutaminem). Koncentrace ošetření pro všechny experimenty byly bez PPA (0 mM, kontrola), 3 mM a 5 mM PPA. Experimenty byly provedeny v alespoň třech biologických replikátech.
Buňky SH-SY5Y byly naočkovány do baněk o objemu 25 cm5 rychlostí 5,5 × 105 buněk/ml a kultivovány po dobu 24 hodin. PPA byl do baňky přidán před 24hodinovou inkubací. Buněčné pelety byly shromážděny podle běžných protokolů pro subkultivaci savčích tkání (popsaných výše). Buněčné pelety byly resuspendovány ve 100 µl 2,5% glutaraldehydu, 1× PBS a skladovány při 4 °C do zpracování. Buňky SH-SY5Y byly krátce centrifugovány za účelem peletizace buněk a odstranění 2,5% roztoku glutaraldehydu, 1× PBS. Sediment byl resuspendován ve 4% agarózovém gelu připraveném v destilované vodě (poměr objemu agarózy k objemu sedimentu je 1:1). Kousky agarózy byly umístěny na mřížky na plochých destičkách a potaženy 1-hexadecenem před vysokotlakým zmrazením. Vzorky byly zmrazeny ve 100% suchém acetonu při -90 °C po dobu 24 hodin. Teplota byla poté zvýšena na -80 °C a byl přidán roztok 1% oxidu osmia a 0,1% glutaraldehydu. Vzorky byly skladovány při -80 °C po dobu 24 hodin. Poté byla teplota postupně zvyšována na pokojovou teplotu během několika dnů: z –80 °C na –50 °C po dobu 24 hodin, na –30 °C po dobu 24 hodin, na –10 °C po dobu 24 hodin a nakonec na pokojovou teplotu.
Po kryogenní přípravě byly vzorky impregnovány pryskyřicí a pomocí ultramikrotomu Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems) byly vyrobeny ultratenké řezy (∼100 nm). Řezy byly obarveny 2% uranylacetátem a citrátem olovnatým. Vzorky byly pozorovány pomocí transmisního elektronového mikroskopu FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (dříve FEI), Eindhoven, Nizozemsko) pracujícího při 200 kV (vysílač Lab6) a CCD kamery Gatan (Gatan, Spojené království) vybavené energetickým filtrem Tridiem.
V každé technické replikaci bylo pořízeno alespoň 24 snímků jednotlivých buněk, celkem tedy 266 snímků. Všechny snímky byly analyzovány pomocí makra Region of Interest (ROI) a makra Mitochondrie. Mitochondriální makro je založeno na publikovaných metodách17,31,32 a umožňuje poloautomatické dávkové zpracování TEM snímků ve Fiji/ImageJ69. Stručně řečeno: obraz je invertován a převrácen pomocí odečtu pozadí metodou rolling ball (poloměr 60 pixelů) a pásmového filtru FFT (s horní a dolní mezí 60 a 8 pixelů) a potlačení vertikálních čar s tolerancí orientace 5 %. Zpracovaný obraz je automaticky prahován pomocí algoritmu maximální entropie a je generována binární maska. Byly extrahovány oblasti obrazu spojené s ručně vybranými ROI v nezpracovaných TEM snímcích, charakterizující mitochondrie a s vyloučením plazmatické membrány a dalších oblastí s vysokým kontrastem. Pro každou extrahovanou oblast zájmu (ROI) byly analyzovány binární částice větší než 600 pixelů a pomocí vestavěných měřicích funkcí Fiji/ImageJ byla měřena plocha, obvod, hlavní a vedlejší osa částice, Feretův průměr, kulatost a kruhovitost. Podle Merrilla, Flippa a Stracka (2017) byly z těchto dat vypočítány plocha 2, poměr stran částice (poměr hlavní a vedlejší osy) a tvarový faktor (FF), kde FF = obvod 2/4pí x plocha. Definici parametrického vzorce lze nalézt v Merrill, Flippo a Strack (2017). Uvedená makra jsou k dispozici na GitHubu (viz Prohlášení o dostupnosti dat). V průměru bylo na jedno ošetření PPA analyzováno přibližně 5 600 částic, celkem tedy přibližně 17 000 částic (data nejsou uvedena).
Buňky SH-SH5Y byly umístěny do 8komorových kultivačních misek (ThermoFisher, #155411) pro adhezi přes noc a poté inkubovány s barvivy TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) a Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Snímky byly pořízeny za použití laserů o vlnových délkách 405 nm a 561 nm po dobu 10 minut a nezpracované snímky byly pořízeny jako z-stacky obsahující 10 obrazových mikrofotografií s a-krokem 0,2 μm mezi obrazovými snímky ve 12 po sobě jdoucích časových bodech. Snímky byly pořízeny pomocí platformy Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 s vysokým rozlišením (Carl Zeiss, Oberkochen, Německo) s použitím objektivu LCI Plan Apochromate 100x/1,4 Oil DIC M27. Snímky byly analyzovány v ImageJ s použitím dříve popsaného postupu a pluginu ImageJ k měření fúzních a štěpných událostí, průměrného počtu mitochondriálních struktur a průměrného objemu mitochondrií na buňku33. Makra MEL jsou k dispozici na GitHubu (viz Prohlášení o dostupnosti dat).
Buňky SH-SY5Y byly pěstovány na šestijamkových destičkách v hustotě 0,3 × 106 buněk/ml po dobu 24 hodin před ošetřením. RNA byla extrahována pomocí protokolu Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) s drobnými úpravami: před odebráním se do každé jamky přidá 300 μl lyzačního pufru RNA a v posledním kroku se každý vzorek lyzuje 30 μl vody bez DNázy/RNázy. Všechny vzorky byly zkontrolovány na množství a kvalitu pomocí UV-Vis spektrofotometru NanoDrop ND-1000. Celkový protein z buněčných lyzátů byl získán za použití 200 μl lyzačního pufru RIPA a koncentrace proteinu byla kvantifikována pomocí Bradfordova proteinového testu70.
Syntéza cDNA byla provedena za použití sady Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) dle pokynů výrobce s určitými úpravami. cDNA byla syntetizována v 20 μl reakcích s použitím 0,7 až 1 μg celkové RNA. Primery byly vybrány z dříve publikovaných prací 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (tabulka S1) a doprovodné sondy byly navrženy pomocí nástroje PrimerQuest od společnosti Integrated DNA Technologies. Všechny sledované geny byly normalizovány na jaderný gen B2M. Genová exprese STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC a OPA1 byla měřena pomocí RT-qPCR. Master mix obsahoval polymerázu LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), 10 μM forward a reverse primery, cDNA a vodu o kvalitě pro PCR, čímž se získal konečný objem 10 μl pro každou reakci. Exprese genů dělení a štěpení (DRP1, MFN1/2) byla měřena pomocí multiplexních testů TaqMan. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) byl použit dle pokynů výrobce s drobnými úpravami. Multiplexní RT-qPCR master mix obsahuje 1X LUNA Taq polymerázu, 10 μM forward a reverse primery, 10 μM sondu, cDNA a vodu o PCR kvalitě, což vede k konečnému objemu 20 μl pro každou reakci. RT-qPCR byla provedena za použití Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG – sériové číslo: R0618110). Podmínky cyklování jsou uvedeny v tabulce S1. Všechny vzorky cDNA byly amplifikovány v triplikátech a standardní křivka byla vytvořena pomocí série desetinásobných ředění. Z analýzy byly odstraněny odlehlé hodnoty s prahovou směrodatnou odchylkou cyklu (Ct) > 0,5, aby byla zajištěna reprodukovatelnost dat30,72. Relativní genová exprese byla vypočtena metodou 2-ΔΔCt79.
Vzorky proteinů (60 μg) byly smíchány s Laemmliho nanášecím pufrem v poměru 2:1 a analyzovány na 12% bezbarvém proteinovém gelu (Bio-Rad #1610184). Proteiny byly přeneseny na PVDF (polyvinylidenfluoridovou) membránu (#170-84156, Bio-Rad) pomocí systému Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Membrána byla blokována a inkubována s příslušnými primárními protilátkami (OPA1, MFN1, MFN2 a DRP1) (ředění 1:1000) po dobu 48 hodin, následovala inkubace se sekundárními protilátkami (1:10 000) po dobu 1 hodiny. Membrány byly poté zobrazeny za použití Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) a zaznamenány pomocí systému Bio-Rad ChemiDoc MP. Pro Western blot analýzu byl použit program ImageLab verze 6.1. Původní gel a blot jsou znázorněny na obrázku S1. Informace o protilátkách jsou uvedeny v tabulce S2.
Datové soubory jsou prezentovány jako průměr a směrodatná chyba průměru (SEM) alespoň tří nezávislých vzorků. Datové soubory byly testovány na normalitu pomocí Shapiro-Wilksova testu (pokud není uvedeno jinak) před předpokladem Gaussova rozdělení a stejných směrodatných odchylek a následnou analýzou. Kromě analýzy datového souboru byl použit Fisherův MEL LSD test (p < 0,05), jednocestná ANOVA (průměr léčby vs. kontroly) a Dunnettův test vícenásobného srovnání pro stanovení významnosti (p < 0,05). Signifikantní hodnoty p jsou v grafu zobrazeny jako *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Všechny statistické analýzy a grafy byly provedeny a generovány pomocí GraphPad Prism 9.4.0.
Makra Fiji/ImageJ pro analýzu TEM obrazů jsou veřejně dostupná na GitHubu: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makro Mitochondrial Event Locator (MEL) je veřejně dostupné na GitHubu: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM a Vijaya A. Mitochondrie: hlavní regulátory metabolismu, homeostázy, stresu, stárnutí a epigenetiky. Indonéština. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Mnohostranná mitochondriální dysfunkce u schizofrenie, komplex I jako možný patologický cíl. Schizofrenie. zdroj. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. a Beal, MF Mitochondriální dysfunkce u Parkinsonovy choroby. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG a Mehta V. Stresované mitochondrie: cíle invaze u Alzheimerovy choroby. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF a Ferreira GK Mitochondrie a mozek: bioenergetika a další. Neurotoxiny. zdroj. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. a kol. Pleiotropní mitochondrie: vliv mitochondrií na vývoj neuronů a onemocnění. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. a Morais, VA. Mitochondriální biogeneze v neuronech: jak a kde. Mezinárodní vztahy. J. Mohr. Věda. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. a Zhao, J. Regulace mitochondriální dynamiky savců: příležitosti a výzvy. front. endokrin. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. a Slack, RS Mitochondriální dynamika v regulaci neurogeneze: od vyvíjejícího se mozku po dospělý mozek. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).