Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu pro CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v prohlížeči Internet Explorer). Mezitím budeme web zobrazovat bez stylů a JavaScriptu, abychom zajistili jeho nepřetržitou podporu.
Inzulínové nanočástice (NP) s vysokým obsahem náplně našly různé uplatnění v různých lékových formách. Tato práce si klade za cíl vyhodnotit vliv procesů lyofilizace a sušení rozprašováním na strukturu chitosanových nanočástic s náplní inzulínu, s mannitolem jako kryoprotektantem nebo bez něj. Kvalitu těchto nanočástic jsme také posoudili jejich opětovným rozpuštěním. Před dehydratací byla velikost částic zesítěných nanočástic chitosanu/tripolyfosfátu sodného/inzulínu optimalizována na 318 nm, PDI byl 0,18, účinnost zapouzdření byla 99,4 % a náplň byla 25,01 %. Po rekonstituci si všechny nanočástice, s výjimkou těch, které byly vyrobeny lyofilizací bez použití manitolu, zachovaly svou sférickou strukturu částic. Ve srovnání s nanočásticemi obsahujícími mannitol dehydratovanými buďto rozprašováním, nanočástice sušené rozprašováním bez manitolu také vykazovaly nejmenší průměrnou velikost částic (376 nm) a nejvyšší obsah náplně (25,02 %) s podobnou mírou zapouzdření (98,7 %) a PDI. (0,20) sušením nebo lyofilizací. Nanočástice sušené rozprašováním bez manitolu také vedly k nejrychlejšímu uvolňování inzulínu a nejvyšší účinnosti buněčného vychytávání. Tato práce ukazuje, že rozprašovací sušení může dehydratovat nanočástice inzulínu bez nutnosti kryoprotektanty ve srovnání s konvenčními metodami lyofilizace, což představuje významnou výhodu v podobě větší nosnosti, nižších požadavků na aditiva a provozních nákladů.
Od svého objevení v roce 19221,2,3 zachraňuje inzulin a jeho farmaceutické přípravky životy pacientů s diabetem 1. typu (DM1) a diabetem 2. typu (DM1). Vzhledem ke svým vlastnostem jakožto proteinu s vysokou molekulovou hmotností se však inzulin snadno agreguje, rozkládá proteolytickými enzymy a eliminuje se při prvním průchodu játry. Lidé s diagnózou diabetu 1. typu potřebují injekce inzulinu po zbytek života. Mnoho pacientů, u kterých byl původně diagnostikován diabetes 2. typu, také potřebuje dlouhodobé injekce inzulinu. Denní injekce inzulinu jsou pro tyto osoby vážným zdrojem každodenní bolesti a nepohodlí s negativními dopady na duševní zdraví. V důsledku toho se rozsáhle studují jiné formy podávání inzulinu, které způsobují menší nepohodlí, jako je perorální podávání inzulinu5, protože mají potenciál obnovit kvalitu života přibližně 5 miliard lidí s diabetem na celém světě.
Technologie nanočástic poskytla významný pokrok v pokusech o perorální podávání inzulínu4,6,7. Technologie, která účinně zapouzdřuje a chrání inzulín před degradací pro cílené doručení do specifických míst v těle. Použití nanočásticových formulací má však několik omezení, zejména kvůli problémům se stabilitou suspenzí částic. Během skladování může dojít k určité agregaci, což snižuje biologickou dostupnost nanočástic s obsahem inzulínu8. Kromě toho je třeba zvážit také chemickou stabilitu polymerní matrice nanočástic a inzulínu, aby byla zajištěna stabilita inzulínových nanočástic (NP). V současné době je technologie lyofilizace zlatým standardem pro vytváření stabilních NP a zároveň zabraňuje nežádoucím změnám během skladování9.
Lyofilizace však vyžaduje přidání kryoprotektantu, aby se zabránilo ovlivnění sférické struktury nanočástic mechanickým namáháním ledových krystalů. To významně snižuje množství inzulínových nanočástic po lyofilizaci, protože kryoprotektant zaujímá většinu hmotnostního poměru. Vyrobené inzulínové nanočástice se proto často jeví jako nevhodné pro výrobu suchých práškových formulací, jako jsou perorální tablety a perorální filmy, a to kvůli potřebě velkého množství suchých nanočástic k dosažení terapeutického okna inzulínu.
Sušení rozprašováním je dobře známý a levný průmyslový proces pro výrobu suchých prášků z kapalných fází ve farmaceutickém průmyslu10,11. Řízení procesu tvorby částic umožňuje správné zapouzdření několika bioaktivních sloučenin12, 13. Dále se stalo účinnou technikou pro přípravu zapouzdřených proteinů pro orální podání. Během sušení rozprašováním se voda velmi rychle odpařuje, což pomáhá udržovat nízkou teplotu jádra částice11,14, což umožňuje jeho aplikaci k zapouzdření složek citlivých na teplo. Před sušením rozprašováním by měl být potahový materiál důkladně homogenizován s roztokem obsahujícím zapouzdřené složky11,14. Na rozdíl od lyofilizace zlepšuje homogenizace před zapouzdřením při sušení rozprašováním účinnost zapouzdření během dehydratace. Vzhledem k tomu, že proces zapouzdření sušení rozprašováním nevyžaduje kryoprotektanty, lze sušení rozprašováním použít k výrobě sušených nanočástic s vysokým obsahem náplně.
Tato studie popisuje produkci nanočástic s obsahem inzulínu zesítěním chitosanu a tripolyfosfátu sodného za použití metody iontového gelu. Iontová gelace je metoda přípravy, která umožňuje produkci nanočástic elektrostatickými interakcemi mezi dvěma nebo více iontovými druhy za určitých podmínek. K dehydrataci optimalizovaných nanočástic zesítěných chitosanem/tripolyfosfátem sodným/inzulinem byly použity techniky lyofilizace i sušení rozprašováním. Po dehydrataci byla jejich morfologie analyzována pomocí SEM. Jejich rekombinační schopnost byla hodnocena měřením jejich distribuce velikosti, povrchového náboje, PDI, účinnosti zapouzdření a obsahu náplně. Kvalita resolubilizovaných nanočástic vyrobených různými metodami dehydratace byla také hodnocena porovnáním jejich ochrany proti inzulínu, chování při uvolňování a účinnosti buněčného vychytávání.
Hodnota pH směsného roztoku a poměr chitosanu a inzulínu jsou dva klíčové faktory, které ovlivňují velikost částic a účinnost zapouzdření (EE) finálních nanočástic, protože přímo ovlivňují proces ionotropní gelace. Ukázalo se, že pH směsného roztoku silně koreluje s velikostí částic a účinností zapouzdření (obr. 1a). Jak je znázorněno na obr. 1a, s rostoucím pH ze 4,0 na 6,0 se průměrná velikost částic (nm) snižovala a EE se významně zvyšovala, zatímco když se pH zvýšilo na 6,5, průměrná velikost částic se začala zvyšovat a EE zůstala nezměněna. S rostoucím poměrem chitosanu k inzulínu se zvyšuje i průměrná velikost částic. Dále nebyla pozorována žádná změna EE, když byly nanočástice připraveny s hmotnostním poměrem chitosanu/inzulínu vyšším než 2,5:1 (hmotnostní poměr) (obr. 1b). Proto byly v této studii použity optimální podmínky přípravy (pH 6,0, hmotnostní poměr chitosanu/inzulínu 2,5:1). nanočástice s obsahem inzulinu pro další studium. Za těchto podmínek přípravy byla průměrná velikost částic nanočástic inzulinu optimalizována na 318 nm (obr. 1c), PDI byl 0,18, účinnost zabudování 99,4 %, zeta potenciál 9,8 mv a obsah inzulinu 25,01 % (m/m). Na základě výsledků transmisní elektronové mikroskopie (TEM) byly optimalizované nanočástice zhruba sférické a diskrétní s relativně jednotnou velikostí (obr. 1d).
Optimalizace parametrů inzulínových nanočástic: (a) vliv pH na střední průměr a účinnost zapouzdření (EE) inzulínových nanočástic (připravených v hmotnostním poměru chitosanu a inzulínu 5:1); (b) chitosan a vliv hmotnostního poměru inzulínu na střední průměr a účinnost zapouzdření (EE) inzulínových NP (připravených při pH 6); (c) distribuce velikosti částic optimalizovaných inzulínových nanočástic; (d) TEM mikrofotografie optimalizovaných inzulínových NP.
Je dobře známo, že chitosan je slabý polyelektrolyt s pKa 6,5. V kyselém prostředí je kladně nabitý, protože jeho hlavní aminoskupina je protonována vodíkovými ionty15. Proto se často používá jako nosič pro zapouzdření negativně nabitých makromolekul. V této studii byl chitosan použit k zapouzdření inzulínu s izoelektrickým bodem 5,3. Vzhledem k tomu, že se chitosan používá jako potahový materiál, se zvyšujícím se jeho podílem se odpovídajícím způsobem zvyšuje tloušťka vnější vrstvy nanočástic, což vede k větší průměrné velikosti částic. Kromě toho vyšší hladiny chitosanu mohou zapouzdřit více inzulínu. V našem případě byla EE nejvyšší, když poměr chitosanu a inzulínu dosáhl 2,5:1, a nedošlo k žádné významné změně EE, když se poměr dále zvyšoval.
Kromě poměru chitosanu a inzulínu hrálo při přípravě nanočástic klíčovou roli také pH. Gan a kol.17 studovali vliv pH na velikost částic chitosanových nanočástic. Zjistili kontinuální pokles velikosti částic, dokud pH nedosáhlo 6,0, a významný nárůst velikosti částic byl pozorován při pH > 6,0, což je v souladu s našimi pozorováními. Tento jev je způsoben skutečností, že se zvyšujícím se pH molekula inzulínu získává negativní povrchový náboj, což podporuje elektrostatické interakce s komplexem chitosan/tripolyfosfát sodný (TPP), což vede k malé velikosti částic a vysoké EE. Když však bylo pH upraveno na 6,5, aminoskupiny na chitosanu byly deprotonovány, což vedlo ke skládání chitosanu. Vysoké pH tedy vede k menší expozici aminových iontů TPP a inzulínu, což má za následek nižší zesítění, větší konečnou průměrnou velikost částic a nižší EE.
Analýza morfologických vlastností lyofilizovaných a sprejově sušených nanočástic může vést k výběru lepších technik dehydratace a tvorby prášku. Preferovaná metoda by měla zajistit stabilitu léčiva, jednotný tvar částic, vysoké množství léčiva a dobrou rozpustnost v původním roztoku. V této studii byly pro lepší porovnání obou technik během dehydratace použity inzulínové nanočástice s 1 % manitolu nebo bez něj. Mannitol se používá jako plnidlo nebo kryoprotektant v různých suchých práškových formulacích pro lyofilizaci a sprejové sušení. U lyofilizovaných inzulínových nanočástic bez manitolu, jak je znázorněno na obrázku 2a, byla pod rastrovací elektronovou mikroskopií (SEM) pozorována vysoce porézní prášková struktura s velkými, nepravidelnými a drsnými povrchy. Po dehydrataci bylo v prášku detekováno jen málo diskrétních částic (obr. 2e). Tyto výsledky naznačují, že většina NP se během lyofilizace bez jakéhokoli kryoprotektantu rozložila. U lyofilizovaných a sprejově sušených inzulínových nanočástic obsahujících 1 % mannitolu byly pozorovány sférické nanočástice s hladkými povrchy (obr. 2b, d, f, h). Inzulínové nanočástice sušené sprejovým sušením bez manitolu zůstaly sférické, ale... zvrásněný na povrchu (obr. 2c). Sférické a zvrásněné povrchy jsou dále diskutovány v níže uvedených testech chování při uvolňování a buněčné absorpce. Na základě viditelného vzhledu sušených nanočástic, jak sušené rozprašováním bez manitolu, tak i lyofilizované a sušené rozprašováním s mannitolem poskytly jemné prášky nanočástic (obr. 2f,g,h). Čím větší je povrch mezi povrchy částic, tím vyšší je rozpustnost, a proto je vyšší rychlost uvolňování.
Morfologie různých dehydratovaných nanočástic inzulínu: (a) SEM snímek lyofilizovaných nanočástic inzulínu bez manitolu; (b) SEM snímek lyofilizovaných nanočástic inzulínu s mannitolem; (c) sušené nanočástice inzulínu bez manitolu; SEM snímek; (d) SEM snímek sušených nanočástic inzulínu s mannitolem; (e) snímek prášku lyofilizovaných nanočástic inzulínu bez manitolu; (f) snímek lyofilizovaných nanočástic inzulínu s mannitolem; (g) snímek sušených práškových nanočástic inzulínu bez manitolu; (h) snímek sušených práškových nanočástic inzulínu s mannitolem.
Během lyofilizace působí mannitol jako kryoprotektant, udržuje nanočástice v amorfní formě a zabraňuje poškození ledovými krystalky19. Naproti tomu během sušení rozprašováním neprobíhá žádný krok zmrazování. Proto v této metodě mannitol není vyžadován. Ve skutečnosti sušené nanočástice bez mannitolu poskytly jemnější nanočástice, jak bylo popsáno dříve. Mannitol však může stále působit jako plnivo v procesu sušení rozprašováním, čímž dodává nanočásticím kulovitější strukturu20 (obr. 2d), což pomáhá dosáhnout rovnoměrného uvolňování těchto zapouzdřených nanočástic. Kromě toho je zřejmé, že některé velké částice lze detekovat jak v lyofilizovaných, tak i sušených rozprašováním sušených inzulínových nanočásticích obsahujících mannitol (obr. 2b,d), což může být způsobeno akumulací mannitolu v jádru částice spolu s enkapsulovaným inzulínem. Vrstva chitosanu. Za zmínku stojí, že v této studii, aby se zajistilo, že sférická struktura po dehydrataci zůstane neporušená, je poměr mannitolu a chitosanu udržován na hodnotě 5:1, takže velké množství plniva může také zvětšit velikost částic sušených NP.
Fyzikální směs volného inzulínu, chitosanu, chitosanu, TPP a inzulínu byla charakterizována pomocí Fourierovy transformační infračervené spektroskopie s utlumeným úplným odrazem (FTIR-ATR). Všechny dehydratované nanočástice byly charakterizovány pomocí FTIR-ATR spektroskopie. Zejména u zapouzdřených nanočástic lyofilizovaných s mannitolem a u nanočástic sušených rozprašováním s mannitolem a bez něj (obr. 3) byly pozorovány intenzity pásů 1641, 1543 a 1412 cm-1. Jak již bylo dříve popsáno, toto zvýšení pevnosti bylo spojeno se zesítěním mezi chitosanem, TPP a inzulínem. Zkoumání interakce mezi chitosanem a inzulínem ukázalo, že ve FTIR spektrech nanočástic chitosanu s obsahem inzulínu se pás chitosanu překrýval s pásem inzulínu, což zvyšovalo intenzitu karbonylu (1641 cm-1) a aminu (1543 cm-1). Tripolyfosfátové skupiny TPP jsou v chitosanu vázány na amoniové skupiny a tvoří pás při 1412 cm-1.
FTIR-ATR spektra volného inzulínu, chitosanu, fyzikálních směsí chitosanu/TPP/inzulínu a NP dehydratovaných různými metodami.
Tyto výsledky jsou navíc v souladu s výsledky získanými pomocí SEM, který ukázal, že zapouzdřené nanočástice zůstaly neporušené jak při postřiku, tak při lyofilizaci mannitolem, ale bez manitolu produkovalo zapouzdřené částice pouze sušení rozprašováním. Naproti tomu spektrální výsledky FTIR-ATR nanočástic lyofilizovaných bez manitolu byly velmi podobné fyzikální směsi chitosanu, TPP a inzulínu. Tento výsledek naznačuje, že v nanočásticích lyofilizovaných bez manitolu již nejsou přítomny zesíťovací vazby mezi chitosanem, TPP a inzulínem. Struktura nanočástic byla během lyofilizace bez kryoprotektantu zničena, což je patrné z výsledků SEM (obr. 2a). Na základě morfologie a výsledků FTIR dehydratovaných nanočástic inzulínu byly pro rekonstituční experimenty použity pouze lyofilizované, postřikem sušené a bezmannitolové nanočástice a nanočástice bez manitolu kvůli rozkladu nanočástic bez manitolu během dehydratace. Diskutujte dále.
Dehydratace se používá pro dlouhodobé skladování a přepracování do jiných formulací. Schopnost suchých nanočástic rekonstituovat se po skladování je klíčová pro jejich použití v různých formulacích, jako jsou tablety a filmy. Všimli jsme si, že průměrná velikost částic sušených inzulínových nanočástic bez manitolu se po rekonstituci zvýšila jen mírně. Na druhou stranu se velikost částic sušených a lyofilizovaných inzulínových nanočástic s mannitolem významně zvýšila (tabulka 1). PDI a EE se po rekombinaci všech nanočástic v této studii významně nezměnily (p > 0,05) (tabulka 1). Tento výsledek naznačuje, že většina částic zůstala po opětovném rozpuštění neporušená. Přidání manitolu však vedlo k výraznému snížení inzulínové zátěže lyofilizovaných a sušených mannitolových nanočástic (tabulka 1). Naproti tomu obsah inzulínové zátěže v nanočásticích sušených rozprašováním bez manitolu zůstal stejný jako předtím (tabulka 1).
Je dobře známo, že množství nanočástic je kritické při použití pro účely podávání léků. U nanočástic s nízkým množstvím je k dosažení terapeutického prahu zapotřebí velmi velké množství materiálu. Vysoká viskozita takových vysokých koncentrací nanočástic však vede k nepříjemnostem a obtížím při perorálním podávání, respektive injekčních formulacích 22. Kromě toho lze inzulínové nanočástice použít také k výrobě tablet a viskózních biofilmů 23, 24, což vyžaduje použití velkého množství nanočástic při nízkých úrovních množství, což vede k velkým tabletám a silným biofilmům, které nejsou vhodné pro perorální aplikaci. Proto jsou dehydratované nanočástice s vysokým množstvím inzulínu velmi žádoucí. Naše výsledky naznačují, že vysoká dávka inzulínu v nanočásticích sušených rozprašováním bez manitolu může nabídnout mnoho atraktivních výhod pro tyto alternativní metody podávání.
Všechny dehydratované NP byly uchovávány v chladničce po dobu tří měsíců. Výsledky SEM ukázaly, že morfologie všech dehydratovaných NP se během tříměsíčního skladování významně nezměnila (obr. 4). Po rekonstituci ve vodě vykazovaly všechny NP mírný pokles EE a uvolnily přibližně malé množství (~5 %) inzulínu během tříměsíčního skladování (tabulka 2). Průměrná velikost částic všech nanočástic se však zvýšila. Velikost částic NP sušených rozprašováním bez manitolu se zvýšila na 525 nm, zatímco velikost částic NP sušených rozprašováním a lyofilizovaných NP s mannitolem se zvýšila na 872, respektive 921 nm (tabulka 2).
Morfologie různých dehydratovaných nanočástic inzulínu skladovaných po dobu tří měsíců: (a) SEM snímek lyofilizovaných nanočástic inzulínu s mannitolem; (b) SEM snímek sušených nanočástic inzulínu bez manitolu; (c) bez manitolu. SEM snímky sušených nanočástic inzulínu bez manitolu.
Dále byly v rekonstituovaných inzulinových nanočásticích sušených rozprašováním s mannitolem a lyofilizovaných (obr. S2) pozorovány sraženiny. To může být způsobeno tím, že velké částice se ve vodě správně nesuspendují. Všechny výše uvedené výsledky ukazují, že technika rozprašovacího sušení může chránit inzulinové nanočástice před dehydratací a že lze dosáhnout vysokého množství inzulinových nanočástic bez jakýchkoli plniv nebo kryoprotektantů.
Retence inzulínu byla testována v médiu s pH = 2,5 s pepsinem, trypsinem a α-chymotrypsinem, aby se prokázala ochranná schopnost nanočástic proti enzymatickému štěpení po dehydrataci. Retence inzulínu u dehydratovaných nanočástic byla porovnána s retencí inzulínu u čerstvě připravených nanočástic a volný inzulín byl použit jako negativní kontrola. V této studii vykazoval volný inzulín rychlou eliminaci inzulínu během 4 hodin ve všech třech enzymatických ošetřeních (obr. 5a–c). Naproti tomu testování eliminace inzulínu u nanočástic lyofilizovaných s mannitolem a nanočástic sušených rozprašováním s mannitolem nebo bez manitolu ukázalo významně vyšší ochranu těchto nanočástic proti enzymatickému štěpení, která byla podobná ochraně čerstvě připravených inzulínových nanočástic (obrázek 1).5a-c). S pomocí nanočástic v pepsinu, trypsinu a α-chymotrypsinu mohlo být do 4 hodin chráněno více než 50 %, 60 % a 75 % inzulínu (obr. 5a–c). Tato schopnost chránit inzulín před inzulínem může zvýšit pravděpodobnost vyšší absorpce inzulínu do krevního oběhu25. Tyto výsledky naznačují, že sprej... Sušení s mannitolem nebo bez něj a lyofilizace s mannitolem může po dehydrataci zachovat schopnost NP chránit před inzulínem.
Chování dehydratovaných nanočástic inzulínu při uvolňování a ochraně: (a) ochrana inzulínu v roztoku pepsinu; (b) ochrana inzulínu v roztoku trypsinu; (c) ochrana inzulínu roztokem α-chymotrypsinu; (d) Chování dehydratovaných nanočástic při uvolňování v roztoku s pH = 2,5; (e) Chování dehydratovaných nanočástic při uvolňování v roztoku s pH = 6,6; (f) Chování dehydratovaných nanočástic při uvolňování v roztoku s pH = 7,0.
Čerstvě připravené a rekonstituované suché inzulinové nanočástice byly inkubovány v různých pufrech (pH = 2,5, 6,6, 7,0) při teplotě 37 °C, simulujících pH prostředí žaludku, dvanáctníku a horní části tenkého střeva, za účelem zkoumání vlivu inzulinu na inzulinovou rezistenci. Chování uvolňování v různých prostředích. Fragment gastrointestinálního traktu. Při pH = 2,5 vykazovaly nanočástice s obsahem inzulínu a resolubilizované suché nanočástice inzulínu počáteční prudké uvolňování během první hodiny, následované pomalým uvolňováním během následujících 5 hodin (obr. 5d). Toto rychlé uvolňování na začátku je s největší pravděpodobností výsledkem rychlé povrchové desorpce proteinových molekul, které nejsou plně imobilizovány ve vnitřní struktuře částice. Při pH = 6,5 vykazovaly nanočástice s obsahem inzulínu a rekonstituované suché nanočástice inzulínu plynulé a pomalé uvolňování během 6 hodin, protože pH testovaného roztoku bylo podobné pH roztoku připraveného s nanočásticemi (obr. 5e). Při pH = 7 byly nanočástice nestabilní a téměř úplně se rozložily během prvních dvou hodin (obr. 5f). Je to proto, že k deprotonaci chitosanu dochází při vyšším pH, což vede k méně kompaktní polymerní síti a uvolňování naloženého inzulínu.
Navíc inzulínové NP sušené rozprašováním bez mannitolu vykazovaly rychlejší profil uvolňování než ostatní dehydratované NP (obr. 5d–f). Jak bylo popsáno dříve, rekonstituované inzulínové NP sušené bez mannitolu vykazovaly nejmenší velikost částic. Malé částice poskytují větší povrch, takže většina relevantního léčiva bude na povrchu částic nebo v jeho blízkosti, což vede k rychlému uvolňování léčiva26.
Cytotoxicita NP byla zkoumána MTT testem. Jak je znázorněno na obrázku S4, všechny dehydratované NP neměly významný vliv na životaschopnost buněk při koncentracích 50–500 μg/ml, což naznačuje, že všechny dehydratované NP lze bezpečně použít k dosažení terapeutického okna.
Játra jsou hlavním orgánem, jehož prostřednictvím inzulín vykonává své fyziologické funkce. Buňky HepG2 jsou lidskou buněčnou linií hepatomu běžně používanou jako in vitro model absorpce hepatocyty. V tomto případě byly buňky HepG2 použity k posouzení buněčné absorpce nanočástic dehydratovaných lyofilizací a sprejovým sušením. Buněčná absorpce byla měřena konfokálním laserovým skenováním pomocí průtokové cytometrie a vizuální analýzy po několika hodinách inkubace s volným FITC inzulínem v koncentraci 25 μg/ml, čerstvě připravenými nanočásticemi s obsahem FITC inzulínu a dehydratovanými nanočásticemi s obsahem FITC inzulínu při stejných koncentracích inzulínu. Byla provedena kvantitativní mikroskopická (CLSM) pozorování. Lyofilizované nanočástice bez manitolu byly během dehydratace zničeny a nebyly v tomto testu hodnoceny. Intenzity intracelulární fluorescence čerstvě připravených nanočástic s obsahem inzulínu, lyofilizovaných nanočástic s mannitolem a sprejově sušených nanočástic s mannitolem a bez manitolu (obr. 6a) byly 4,3krát, 2,6krát, 2,4krát a 4,1krát vyšší než u volných nanočástic. Skupina FITC-inzulín. (Obr. 6b). Tyto výsledky naznačují, že zapouzdřený inzulin je v buněčném vychytávání účinnější než volný inzulin, a to především kvůli menší velikosti nanočástic s obsahem inzulinu, které vznikly ve studii.
Absorpce buňkami HepG2 po 4 hodinách inkubace s čerstvě připravenými nanočásticemi a dehydratovanými nanočásticemi: (a) Distribuce absorpce FITC-inzulínu buňkami HepG2. (b) Geometrický průměr intenzit fluorescence analyzovaných průtokovou cytometrií (n = 3), *P < 0,05 ve srovnání s volným inzulínem.
Stejně tak snímky CLSM ukázaly, že intenzity fluorescence FITC čerstvě připravených nanočástic s obsahem FITC a inzulinu a nanočástic sušených rozprašováním s obsahem FITC (bez mannitolu) byly mnohem silnější než u ostatních vzorků (obr. 6a). Navíc s přidáním mannitolu vyšší viskozita roztoku zvýšila odolnost vůči buněčnému vychytávání, což vedlo ke snížené proliferaci inzulínu. Tyto výsledky naznačují, že nanočástice sušené rozprašováním bez mannitolu vykazovaly nejvyšší účinnost buněčného vychytávání, protože velikost jejich částic byla po opětovném rozpuštění menší než u lyofilizovaných nanočástic.
Chitosan (průměrná molekulová hmotnost 100 KDa, 75–85 % deacetylovaný) byl zakoupen od společnosti Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Tripolyfosfát sodný (TPP) byl zakoupen od společnosti VWR (Radnor, Pensylvánie, USA). Rekombinantní lidský inzulin použitý v této studii byl od společnosti Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Lidský inzulin značený fluorescein isothiokyanátem (FITC) a 4',6-diamidino-2-fenylindol dihydrochlorid (DAPI) byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Buněčná linie HepG2 byla získána od společnosti ATCC (Manassas, Virginie, USA). Všechny ostatní činidla byly analytické nebo chromatografické kvality.
Roztok CS o koncentraci 1 mg/ml se připraví rozpuštěním v dvojnásobně destilované vodě (DD voda) obsahující 0,1 % kyseliny octové. Roztoky TPP a inzulinu o koncentraci 1 mg/ml se připraví rozpuštěním v DD vodě a 0,1 % kyselině octové. Předemulze se připraví pomocí vysokorychlostního homogenizátoru Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Postup přípravy je následující: nejprve se 2 ml roztoku TPP přidají ke 4 ml roztoku inzulinu a směs se míchá 30 minut a důkladně se promíchá. Poté se směsný roztok po kapkách přidá k roztoku CS pomocí stříkačky za míchání vysokou rychlostí (10 000 ot/min). Směsi se 30 minut míchají vysokorychlostně (15 000 ot/min) v ledové lázni a poté se upraví na určité pH, aby se získaly zesítěné inzulinové nanočástice. Pro další homogenizaci a zmenšení velikosti částic inzulinových nanočástic se sonikují dalších 30 minut v... ledová lázeň s použitím sonikátoru se sondou (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Německo).
Inzulínové NPS byly testovány na Z-průměrný průměr, index polydisperzity (PDI) a zeta potenciál pomocí měření dynamického rozptylu světla (DLS) s použitím Litesizeru 500 (Anton Paar, Graz, Rakousko) jejich zředěním v DD vodě při 25 °C. Morfologie a distribuce velikostí byly charakterizovány transmisním elektronovým mikroskopem (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokio, Japonsko) a snímky byly následně analyzovány pomocí zobrazovacího softwaru Hitachi (Hitachi, Tokio, Japonsko). Pro posouzení účinnosti zapouzdření (EE) a nosnosti (LC) inzulínových NP byly NP pipetovány do ultrafiltračních zkumavek s mezní molekulovou hmotností 100 kDa a centrifugovány při 500 xg po dobu 30 minut. Nezapouzdřený inzulín ve filtrátu byl kvantifikován pomocí HPLC systému Agilent 1100 Series (Agilent, Santa Clara, Kalifornie, USA), který sestával z kvartérní pumpy, automatického vzorkovače, ohřívače kolony a DAD detektoru. Inzulín byl analyzován. na koloně C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) a detekováno při 214 nm. Mobilní fází byl acetonitril a voda s obsahem 0,1 % TFA, gradientní poměry od 10/90 do 100/0, a průtok byl 10 minut. Mobilní fáze byla čerpána průtokem 1,0 ml/min. Teplota kolony byla nastavena na 20 °C. Vypočítejte procenta EE a LC pomocí rovnic (1) a (2).
Pro optimalizaci nanočástic inzulínu byly testovány různé poměry CS/inzulín v rozmezí od 2,0 do 4,0. Během přípravy byla přidána různá množství roztoku CS, přičemž směs inzulínu/TPP byla udržována konstantní. Nanočástice inzulínu byly připraveny v rozmezí pH 4,0 až 6,5 pečlivou kontrolou pH směsi po přidání všech roztoků (inzulínu, TPP a CS). EE a velikost částic nanočástic inzulínu byly hodnoceny při různých hodnotách pH a hmotnostních poměrech CS/inzulínu pro optimalizaci tvorby nanočástic inzulínu.
Optimalizované inzulinové nanočástice byly umístěny na hliníkovou nádobu a zakryty tkaninou, která byla utažena páskou. Následně byly zašroubované nádoby umístěny do lyofilizátoru Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) vybaveného táckovým sušičem. Teplota a podtlak byly nastaveny na -10 °C, 0,350 Torr po dobu prvních 2 hodin a na 0 °C a 0,120 Torr po dobu zbývajících 22 hodin z 24 hodin, aby se získaly suché inzulinové nanočástice.
Pro výrobu enkapsulovaného inzulínu byl použit rozprašovací sušárna Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Švýcarsko). Zvolené parametry sušení byly: teplota 100 °C, průtok vstupního plynu 3 l/min a průtok plynu 4 l/min.
Nanočástice inzulínu před a po dehydrataci byly charakterizovány pomocí FTIR-ATR spektroskopie. Dehydratované nanočástice, stejně jako volný inzulín a chitosan, byly analyzovány pomocí FTIR spektrofotometru Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) vybaveného univerzálním ATR vzorkovacím příslušenstvím (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Průměry signálu byly získány ze 16 skenů s rozlišením 4 cm2 ve frekvenčním rozsahu 4000-600 cm2.
Morfologie suchých inzulinových nanočástic byla hodnocena pomocí SEM snímků lyofilizovaných a sprejově sušených inzulinových nanočástic, pořízených pomocí Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). Hlavním použitým parametrem bylo napětí 5 keV a proud 30 mA.
Všechny dehydratované inzulínové NP byly znovu rozpuštěny v dehydratované vodě. Velikost částic, PDI, EE a LC byly znovu testovány stejnou metodou, která byla zmíněna dříve, aby se posoudila jejich kvalita po dehydrataci. Stabilita anhydroinzulínových NP byla také měřena testováním vlastností NP po delším skladování. V této studii byly všechny NP po dehydrataci skladovány v chladničce po dobu tří měsíců. Po třech měsících skladování byly NP testovány na morfologickou velikost částic, PDI, EE a LC.
Pro vyhodnocení účinnosti inzulinu v ochraně NP po dehydrataci rozpusťte 5 ml rekonstituovaných NP ve 45 ml roztoku obsahujícího simulovanou žaludeční tekutinu (pH 1,2, obsahující 1 % pepsinu), střevní tekutinu (pH 6,8, obsahující 1 % trypsinu) nebo roztok chymotrypsinu (100 g/ml, ve fosfátovém pufru, pH 7,8). Inkubace probíhaly při 37 °C s rychlostí míchání 100 ot/min. V různých časových bodech bylo odebráno 500 μl roztoku a koncentrace inzulinu byla stanovena pomocí HPLC.
Chování uvolňování čerstvě připravených a dehydratovaných nanočástic inzulínu in vitro bylo testováno metodou dialyzačního vaku (hraniční molekulová hmotnost 100 kDa, Spectra Por Inc.). Čerstvě připravené a rekonstituované suché nanočástice byly dialyzovány v tekutinách o pH 2,5, pH 6,6 a pH 7,0 (0,1 M fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, PBS) pro simulaci pH prostředí žaludku, dvanáctníku a horní části tenkého střeva. Všechny vzorky byly inkubovány při 37 °C za stálého třepání při 200 ot/min. Tekutinu vně 5ml dialyzačního vaku odsávejte v následujících časech: 0,5, 1, 2, 3, 4 a 6 hodin a objem ihned doplňte čerstvým dialyzátem. Kontaminace tekutiny inzulínem byla analyzována pomocí HPLC a rychlost uvolňování inzulínu z nanočástic byla vypočtena z poměru uvolněného volného inzulínu k celkovému inzulínu zapouzdřenému v nanočásticích (rovnice 3).
Buňky lidské buněčné linie hepatocelulárního karcinomu HepG2 byly pěstovány v miskách o průměru 60 mm za použití Dulbeccova modifikovaného Eagleova média (DMEM) obsahujícího 10 % fetálního bovinního séra, 100 IU/ml penicilinu a 100 μg/ml streptomycinu29. Kultury byly udržovány při teplotě 37 °C, 95% relativní vlhkosti a 5 % CO2. Pro testy absorpce byly buňky HepG2 naočkovány v koncentraci 1 × 10⁶ buněk/ml na 8jamkový systém komorových sklíček Nunc Lab-Tek (Thermo Fisher, NY, USA). Pro testy cytotoxicity byly naočkovány do 96jamkových destiček (Corning, NY, USA) v hustotě 5 × 10⁶ buněk/ml.
MTT test byl použit k vyhodnocení cytotoxicity čerstvě připravených a dehydratovaných inzulínových NP30. Buňky HepG2 byly nasety do 96jamkových destiček v hustotě 5 × 10⁴ buněk/ml a kultivovány 7 dní před testováním. Inzulínové NP byly zředěny na různé koncentrace (50 až 500 μg/ml) v kultivačním médiu a poté podány buňkám. Po 24 hodinách inkubace byly buňky třikrát promyty PBS a inkubovány s médiem obsahujícím 0,5 mg/ml MTT po dobu dalších 4 hodin. Cytotoxicita byla hodnocena měřením enzymatické redukce žlutého tetrazoliového MTT na fialový formazan při 570 nm za použití spektrofotometru Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Švýcarsko).
Účinnost buněčného vychytávání nanočástic byla testována konfokální laserovou skenovací mikroskopií a analýzou průtokovou cytometrií. Každá jamka systému Nunc Lab-Tek s komorovými sklíčky byla ošetřena volným FITC-inzulinem, nanočásticemi s obsahem FITC-inzulinu a rekonstituovanými 25 μg/ml dehydratovanými nanočásticemi FITC-inzulinu ve stejné koncentraci a inkubována po dobu 4 hodin. Buňky byly třikrát promyty PBS a fixovány 4% paraformaldehydem. Jádra byla obarvena 4',6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI). Lokalizace inzulínu byla pozorována pomocí laserového skenovacího/dvoufotonového konfokálního mikroskopu Olympus FV1000 (Olympus, Šindžuku, Tokio, Japonsko). Pro analýzu průtokovou cytometrií byly stejné koncentrace 10 μg/ml volného FITC-inzulinu, nanočástic s obsahem FITC-inzulinu a resolubilizovaných dehydratovaných nanočástic FITC-inzulinu přidány do 96jamkových destiček naočkovaných buňkami HepG2 a inkubovány po dobu 4 hodin. Po 4 hodinách inkubace byly buňky odstraněny a třikrát promyty FBS. 5 × 10⁴ buněk na vzorek bylo analyzováno průtokovým cytometrem BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Spojené státy).
Všechny hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± směrodatná odchylka. Srovnání mezi všemi skupinami bylo provedeno pomocí jednofaktorové ANOVA nebo t-testu v programu IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, New York, USA) a hodnota p < 0,05 byla považována za statisticky významnou.
Tato studie demonstruje flexibilitu a schopnost sušení rozprašováním dehydratovat zesítěné nanočástice chitosanu/TPP/inzulínu s lepší rekonstitucí ve srovnání se standardními metodami lyofilizace s použitím plnidel nebo kryoprotektantů a vyšší nosností. Optimalizované nanočástice inzulínu dosáhly průměrné velikosti částic 318 nm a účinnosti zapouzdření 99,4 %. Výsledky SEM a FTIR po dehydrataci ukázaly, že sférická struktura byla zachována pouze u nanočástic sušených rozprašováním s mannitolem a bez něj a lyofilizovaných s mannitolem, ale lyofilizované nanočástice bez manitolu se během dehydratace rozložily. V testu rekonstituční schopnosti vykazovaly nanočástice inzulínu sušené rozprašováním bez manitolu nejmenší průměrnou velikost částic a nejvyšší zatížení po rekonstituci. Chování uvolňování všech těchto dehydratovaných nanočástic ukázalo, že se rychle uvolňovaly v roztocích s pH = 2,5 a pH = 7 a velmi stabilní v roztoku s pH = 6,5. Ve srovnání s jinými znovu rozpuštěnými dehydratovanými nanočásticemi vykazovaly nanočástice sušené rozprašováním bez manitolu nejrychlejší... uvolňování. Tento výsledek je v souladu s výsledkem pozorovaným v testu buněčného vychytávání, protože nanočástice sušené rozprašováním bez mannitolu si téměř úplně zachovaly účinnost buněčného vychytávání čerstvě připravených nanočástic. Tyto výsledky naznačují, že suché nanočástice inzulínu připravené sušením rozprašováním bez mannitolu jsou nejvhodnější pro další zpracování na jiné bezvodé lékové formy, jako jsou perorální tablety nebo bioadhezivní filmy.
Vzhledem k problémům s duševním vlastnictvím nejsou soubory dat generované a/nebo analyzované během aktuální studie veřejně dostupné, ale jsou k dispozici u příslušných autorů na základě přiměřené žádosti.
Kagan, A. Diabetes 2. typu: sociální a vědecký původ, lékařské komplikace a důsledky pro pacienty i další osoby. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. a Jiang, P. Vývoj zapouzdření inzulinu: je nyní možné perorální podávání? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. a Dass, CR. Nedávný pokrok v perorálních liposomových systémech s obsahem inzulínu pro léčbu diabetu. Interpretace. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).