Článek je součástí výzkumného tématu „Zlepšení odolnosti luštěnin vůči patogenům a škůdcům“, zobrazit všech 5 článků
Původce houbové choroby rostlin zvané nekróza Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary používá k infikování různých hostitelských rostlin vícestupňovou strategii. Tato studie navrhuje použití diaminu L-ornithinu, neproteinové aminokyseliny, která stimuluje syntézu dalších esenciálních aminokyselin, jako alternativní strategii řízení pro posílení molekulárních, fyziologických a biochemických reakcí Phaseolus vulgaris L. na plíseň hnědou (Pseudomonas sclerotiorum). Experimenty in vitro ukázaly, že L-ornithin významně inhiboval růst mycelia S. pyrenoidosa v závislosti na dávce. Navíc mohl významně snížit závažnost plísně hnědé ve skleníkových podmínkách. L-ornithin dále stimuloval růst ošetřených rostlin, což naznačuje, že testované koncentrace L-ornithinu nebyly pro ošetřené rostliny fytotoxické. Kromě toho L-ornithin zvýšil expresi neenzymatických antioxidantů (celkové rozpustné fenoly a flavonoidy) a enzymatických antioxidantů (kataláza (CAT), peroxidáza (POX) a polyfenoloxidáza (PPO)) a zvýšil expresi tří genů souvisejících s antioxidanty (PvCAT1, PvSOD a PvGR). Analýza in silico dále odhalila přítomnost předpokládaného proteinu oxaloacetát acetylhydrolázy (SsOAH) v genomu S. sclerotiorum, který byl z hlediska funkční analýzy, konzervovaných domén a topologie velmi podobný proteinům oxaloacetát acetylhydrolázy (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) a Penicillium sp. (PlOAH). Je zajímavé, že přidání L-ornithinu do média s bramborovou dextrózou (PDB) významně snížilo expresi genu SsOAH v myceliu S. sclerotiorum. Podobně exogenní aplikace L-ornithinu významně snížila expresi genu SsOAH v myceliu hub získaném z ošetřených rostlin. Aplikace L-ornithinu nakonec významně snížila sekreci kyseliny šťavelové jak v PDB médiu, tak v infikovaných listech. Závěrem lze říci, že L-ornithin hraje klíčovou roli v udržování redoxního stavu a také v posilování obranné reakce infikovaných rostlin. Výsledky této studie by mohly pomoci při vývoji inovativních, ekologicky šetrných metod kontroly plísně bílé a zmírnění jejího dopadu na produkci fazolí a dalších plodin.
Bílá plíseň, způsobená nekrotrofní houbou Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, je ničivé onemocnění snižující výnosy, které představuje vážnou hrozbu pro celosvětovou produkci fazolí (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum je jedním z nejobtížněji kontrolovatelných půdních houbových rostlinných patogenů s širokým spektrem hostitelů čítajícím přes 600 rostlinných druhů a schopností rychle macerovat hostitelské tkáně nespecifickým způsobem (Liang a Rollins, 2018). Za nepříznivých podmínek prochází kritickou fází svého životního cyklu, kdy zůstává po dlouhou dobu v dormantním stavu jako černé, tvrdé, semenům podobné struktury zvané „sklerocia“ v půdě nebo jako bílé, nadýchané výrůstky v myceliu nebo dřeni stonku napadených rostlin (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum je schopen vytvářet sklerocia, což mu umožňuje přežít v infikovaných polích po dlouhou dobu a přetrvávat během onemocnění (Schwartz et al., 2005). Sklerotia jsou bohatá na živiny, mohou v půdě přetrvávat po dlouhou dobu a slouží jako primární inokulum pro následné infekce (Schwartz et al., 2005). Za příznivých podmínek sklerotia klíčí a produkují spory přenášené vzduchem, které mohou infikovat všechny nadzemní části rostliny, včetně, ale nikoli výhradně, květů, stonků nebo lusků (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum používá k infikování hostitelských rostlin vícevrstvou strategii, která zahrnuje řadu koordinovaných událostí od klíčení sklerocií až po rozvoj symptomů. Zpočátku S. sclerotiorum produkuje suspendované spory (nazývané askospory) z houbovitých struktur zvaných apothecia, které se dostanou do vzduchu a na infikovaných rostlinných zbytcích se vyvinou v nepohyblivá sklerotia (Bolton et al., 2006). Houba poté vylučuje kyselinu šťavelovou, faktor virulence, ke kontrole pH buněčné stěny rostlin, podpoře enzymatické degradace a invaze do tkání (Hegedus a Rimmer, 2005) a potlačení oxidačního vzplanutí hostitelské rostliny. Tento proces okyselování oslabuje buněčnou stěnu rostliny a vytváří příznivé prostředí pro normální a efektivní fungování enzymů degradujících buněčnou stěnu hub (CWDE), což umožňuje patogenu překonat fyzickou bariéru a proniknout do hostitelských tkání (Marciano et al., 1983). Jakmile S. sclerotiorum pronikne, vylučuje řadu CWDE, jako je polygalakturonáza a celuláza, které usnadňují jeho šíření v infikovaných tkáních a způsobují nekrózu tkání. Progrese lézí a hyfálních rohoží vede k charakteristickým příznakům bílé plísně (Hegedus a Rimmer, 2005). Hostitelské rostliny zároveň rozpoznávají molekulární vzorce asociované s patogeny (PAMP) prostřednictvím receptorů rozpoznávání vzorů (PRR), což spustí řadu signálních událostí, které nakonec aktivují obranné reakce.
Navzdory desetiletím úsilí o kontrolu chorob přetrvává u fazolí, stejně jako u jiných komerčních plodin, nedostatek odpovídající rezistentní zárodečné plazmy kvůli rezistenci, přežití a adaptabilitě patogenu. Zvládání chorob je proto extrémně náročné a vyžaduje integrovanou, mnohostrannou strategii, která zahrnuje kombinaci agrotechniky, biologické kontroly a chemických fungicidů (O'Sullivan et al., 2021). Chemická kontrola bílé plísně je nejúčinnější, protože fungicidy, pokud jsou aplikovány správně a ve správný čas, mohou účinně kontrolovat šíření choroby, snižovat závažnost infekce a minimalizovat ztráty na výnosech. Nadměrné používání a nadměrné spoléhání se na fungicidy však může vést ke vzniku rezistentních kmenů S. sclerotiorum a negativně ovlivnit necílové organismy, zdraví půdy a kvalitu vody (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Proto se hledání ekologicky šetrných alternativ stalo nejvyšší prioritou.
Polyaminy (PA), jako je putrescin, spermidin, spermin a kadaverin, mohou sloužit jako slibné alternativy proti půdním rostlinným patogenům, a tím zcela nebo částečně snižují používání nebezpečných chemických fungicidů (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). U vyšších rostlin se PA podílejí na mnoha fyziologických procesech, včetně, ale nikoli výhradně, buněčného dělení, diferenciace a reakce na abiotický a biotický stres (Killiny a Nehela, 2020). Mohou působit jako antioxidanty, pomáhat vychytávat reaktivní formy kyslíku (ROS), udržovat redoxní homeostázu (Nehela a Killiny, 2023), indukovat geny související s obranou (Romero a kol., 2018), regulovat různé metabolické dráhy (Nehela a Killiny, 2023), modulovat endogenní fytohormony (Nehela a Killiny, 2019), vytvářet systémovou získanou rezistenci (SAR) a regulovat interakce rostlin a patogenů (Nehela a Killiny, 2020; Asija a kol., 2022; Czerwoniec, 2022). Za zmínku stojí, že specifické mechanismy a role PA v obraně rostlin se liší v závislosti na druhu rostliny, patogenech a podmínkách prostředí. Nejhojnější PA v rostlinách je biosyntetizována z esenciálního polyaminu L-ornithinu (Killiny a Nehela, 2020).
L-ornithin hraje v růstu a vývoji rostlin řadu rolí. Například předchozí studie ukázaly, že u rýže (Oryza sativa) může být ornithin spojen s recyklací dusíku (Liu et al., 2018), výnosem, kvalitou a aroma rýže (Lu et al., 2020) a reakcí na vodní stres (Yang et al., 2000). Exogenní aplikace L-ornithinu dále významně zvýšila toleranci sucha u cukrové řepy (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) a zmírnila solný stres u cibule (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu a Çavuşoǧlu, 2021) a rostlin kešu ořechů (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Potenciální role L-ornithinu v obraně proti abiotickému stresu může být způsobena jeho zapojením do akumulace prolinu v ošetřených rostlinách. Například geny související s metabolismem prolinu, jako jsou geny ornithin delta aminotransferázy (delta-OAT) a prolin dehydrogenázy (ProDH1 a ProDH2), byly dříve popsány jako zapojeny do obrany Nicotiana benthamiana a Arabidopsis thaliana proti nehostitelským kmenům Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar a Mysore, 2012). Na druhou stranu, houbová ornithin dekarboxyláza (ODC) je nezbytná pro růst patogenů (Singh et al., 2020). Cílení na ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici pomocí hostitelem indukovaného genového umlčování (HIGS) významně zvýšilo odolnost rostlin rajčat vůči fusariovému vadnutí (Singh et al., 2020). Potenciální role aplikace exogenního ornithinu proti biotickým stresům, jako jsou fytopatogeny, však nebyla dobře prozkoumána. Ještě důležitější je, že účinky ornithinu na odolnost vůči chorobám a související biochemické a fyziologické jevy zůstávají do značné míry neprozkoumané.
Pochopení složitosti infekce luštěnin bakterií S. sclerotiorum je důležité pro vývoj účinných strategií kontroly. V této studii jsme se zaměřili na identifikaci potenciální role diaminu L-ornithinu jako klíčového faktoru pro posílení obranných mechanismů a odolnosti luštěnin vůči infekci Sclerotinia sclerotiorum. Předpokládáme, že kromě posílení obranných reakcí infikovaných rostlin hraje L-ornithin také klíčovou roli v udržování redoxního stavu. Navrhujeme, že potenciální účinky L-ornithinu souvisí s regulací enzymatických a neenzymatických antioxidačních obranných mechanismů a interferencí s faktory patogenity/virulence hub a asociovanými proteiny. Tato dvojí funkce L-ornithinu z něj činí slibného kandidáta pro udržitelnou strategii ke zmírnění dopadu bílé plísně a zvýšení odolnosti běžných luštěnin vůči tomuto silnému houbovému patogenu. Výsledky této studie mohou pomoci při vývoji inovativních, ekologicky šetrných metod kontroly bílé plísně a zmírnění jejího dopadu na produkci luštěnin.
V této studii byla jako experimentální materiál použita náchylná komerční odrůda fazolu obecného Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Zdravá semena laskavě poskytlo oddělení pro výzkum bobovitých plodin, Výzkumný ústav polních plodin (FCRI), Zemědělské výzkumné centrum (ARC) v Egyptě. Pět semen bylo zaseto do plastových květináčů (vnitřní průměr 35 cm, hloubka 50 cm) naplněných zeminou infikovanou S. sclerotiorum za skleníkových podmínek (25 ± 2 °C, relativní vlhkost 75 ± 1 %, 8 h světlo/16 h tma). 7–10 dní po zasetí (DPS) byly sazenice proředěny tak, aby v každém květináči zůstaly pouze dvě sazenice s rovnoměrným růstem a třemi plně rozvinutými listy. Všechny rostliny v květináčích byly zalévány jednou za dva týdny a měsíčně hnojeny doporučeným množstvím pro danou odrůdu.
Pro přípravu L-ornithindiaminu (známého také jako kyselina (+)-(S)-2,5-diaminopentanová; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Německo) o koncentraci 500 mg/l bylo nejprve 50 mg rozpuštěno ve 100 ml sterilní destilované vody. Zásobní roztok byl poté zředěn a použit v následných experimentech. Stručně řečeno, in vitro bylo testováno šest sérií koncentrací L-ornithinu (12,5, 25, 50, 75, 100 a 125 mg/l). Kromě toho byla jako negativní kontrola (mock) použita sterilní destilovaná voda a jako pozitivní kontrola byl použit komerční fungicid „Rizolex-T“ 50% smáčitelný prášek (toklofos-methyl 20 % + thiram 30 %; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, guvernorát Gharbia, Egypt). Komerční fungicid „Rizolex-T“ byl testován in vitro v pěti koncentracích (2, 4, 6, 8 a 10 mg/l).
Vzorky stonků a lusků fazole obecného s typickými příznaky bílé plísně (míra napadení: 10–30 %) byly odebrány z komerčních farem. Ačkoli většina infikovaného rostlinného materiálu byla identifikována podle druhu/odrůdy (náchylná komerční odrůda Giza 3), ostatní, zejména ty získané z místních trhů, byly neznámého druhu. Odebraný infikovaný materiál byl nejprve povrchově dezinfikován 0,5% roztokem chlornanu sodného po dobu 3 minut, poté několikrát opláchnut sterilní destilovanou vodou a otřen dosucha sterilním filtračním papírem, aby se odstranila přebytečná voda. Infikované orgány byly poté nakrájeny na malé kousky ze středního pletiva (mezi zdravým a infikovaným pletivem), kultivovány na bramborovém dextrózovém agaru (PDA) a inkubovány při teplotě 25 ± 2 °C s 12hodinovým cyklem světlo/12hodinová tma po dobu 5 dnů, aby se stimulovala tvorba sklerocií. Metoda myceliální špičky byla také použita k purifikaci izolátů hub ze smíšených nebo kontaminovaných kultur. Purifikovaný izolát hub byl nejprve identifikován na základě jeho kulturních morfologických charakteristik a poté byl na základě mikroskopických znaků potvrzen jako S. sclerotiorum. Nakonec byly všechny purifikované izoláty testovány na patogenitu na citlivém kultivaru fazolu obecného Giza 3, aby splnily Kochovy postuláty.
Kromě toho byl nejinvazivnější izolát S. sclerotiorum (izolát č. 3) dále potvrzen na základě sekvenování interního transkribovaného spaceru (ITS), jak popsali White a kol., 1990; Baturo-Ciesniewska a kol., 2017. Stručně řečeno, izoláty byly kultivovány v bramborovém dextrózovém bujónu (PDB) a inkubovány při teplotě 25 ± 2 °C po dobu 5–7 dnů. Poté bylo odebráno mycelium hub, přefiltrováno přes gázu, dvakrát promyto sterilní vodou a vysušeno sterilním filtračním papírem. Genomová DNA byla izolována pomocí soupravy Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah a kol., 2022, 2024). Oblast ITS rDNA byla následně amplifikována za použití specifického páru primerů ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; očekávaná velikost: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Purifikované PCR produkty byly odeslány k sekvenování (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Sekvence ITS rDNA byly sekvenovány obousměrně pomocí Sangerovy metody sekvenování. Sestavené dotazované sekvence byly následně porovnány s nejnovějšími daty v GenBank a Národním centru pro biotechnologické informace (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) za použití softwaru BLASTn. Dotazovaná sekvence byla porovnána s 20 dalšími kmeny/izoláty S. sclerotiorum získanými z nejnovějších dat v NCBI GenBank (doplňková tabulka S1) pomocí ClustalW v balíčku Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; verze 11) (Kumar et al., 2024). Evoluční analýza byla provedena metodou maximální věrohodnosti a obecným modelem časově reverzibilní nukleotidové substituce (Nei a Kumar, 2000). Je zobrazen strom s nejvyšší logaritmickou pravděpodobností. Počáteční strom pro heuristické vyhledávání je vybrán výběrem stromu s vyšší logaritmickou pravděpodobností mezi stromem typu neighbor-joining (NJ) (Kumar et al., 2024) a stromem maximální šetrnosti (MP). Strom NJ byl konstruován pomocí párové matice vzdáleností vypočítané pomocí obecného modelu časově reverzibilní substituce (Nei a Kumar, 2000).
Antibakteriální aktivita L-ornithinu a baktericidu „Rizolex-T“ byla stanovena in vitro metodou agarové difuze. Metoda: Odeberte příslušné množství zásobního roztoku L-ornithinu (500 mg/l) a důkladně jej smíchejte s 10 ml živného média PDA za účelem přípravy roztoků s konečnými koncentracemi 12,5, 25, 50, 75, 100 a 125 mg/l. Jako kontrola bylo použito pět koncentrací fungicidu „Rizolex-T“ (2, 4, 6, 8 a 10 mg/l) a sterilní destilovaná voda. Po ztuhnutí média byl do středu Petriho misky přenesen čerstvě připravený myceliální záplata kultury Sclerotinia sclerotiorum o průměru 4 mm a kultivován při teplotě 25±2 °C, dokud mycelium nepokrylo celou kontrolní Petriho misku, načež byl zaznamenán růst houby. Vypočítejte procentuální inhibici radiálního růstu S. sclerotiorum pomocí rovnice 1:
Experiment byl dvakrát opakován, se šesti biologickými replikacemi pro každou kontrolní/experimentální skupinu a pěti květináči (dvě rostliny na květináč) pro každou biologickou replikaci. Každá biologická replikace byla analyzována dvakrát (dvě technické replikace), aby byla zajištěna přesnost, spolehlivost a reprodukovatelnost experimentálních výsledků. Kromě toho byla pro výpočet poloviční maximální inhibiční koncentrace (IC50) a IC99 použita probitová regresní analýza (Prentice, 1976).
Pro vyhodnocení potenciálu L-ornithinu ve skleníkových podmínkách byly provedeny dva po sobě jdoucí květináče. Stručně řečeno, květináče byly naplněny sterilizovanou jílovito-pískovou zeminou (3:1) a inokulovány čerstvě připravenou kulturou S. sclerotiorum. Nejprve byl kultivován nejinvazivnější izolát S. sclerotiorum (izolát č. 3) rozříznutím jednoho sklerocia napůl, jeho umístěním lícem dolů na PDA a inkubací při 25 °C v konstantní tmě (24 hodin) po dobu 4 dnů, aby se stimuloval růst mycelia. Poté byly z předního okraje odebrány čtyři agarové zátky o průměru 5 mm a inokulovány 100 g sterilní směsi pšeničných a rýžových otrub (1:1, obj./obj.) a všechny baňky byly inkubovány při 25 ± 2 °C za 12hodinového cyklu světlo/12 hodin tma po dobu 5 dnů, aby se stimulovala tvorba sklerocií. Obsah všech baněk byl před přidáním zeminy důkladně promíchán, aby byla zajištěna homogenita. Poté bylo do každého květináče přidáno 100 g kolonizační směsi otrub, aby byla zajištěna konstantní koncentrace patogenů. Naočkované květináče byly zality pro aktivaci růstu hub a umístěny na 7 dní do skleníkových podmínek.
Do každého květináče bylo poté zaseto pět semen odrůdy Giza 3. V květináčích ošetřených L-ornithinem a fungicidem Rizolex-T byla sterilizovaná semena nejprve na dvě hodiny namočena do vodného roztoku obou sloučenin s konečnou koncentrací IC99 přibližně 250 mg/l, respektive 50 mg/l, a poté před setím jednu hodinu sušena na vzduchu. Na druhou stranu byla semena namočena do sterilní destilované vody jako negativní kontrola. Po 10 dnech, před první zálivkou, byly sazenice proředěny, takže v každém květináči zůstaly pouze dvě čisté sazenice. Aby se zajistila infekce bakterií S. sclerotiorum, byly navíc stonky fazolí ve stejném vývojovém stádiu (10 dní) naříznuty na dvou různých místech pomocí sterilizovaného skalpelu a do každé rány bylo umístěno přibližně 0,5 g kolonizační směsi otrub. Následně byla u všech naočkovaných rostlin zavedena vysoká vlhkost, aby se stimulovala infekce a rozvoj choroby. Kontrolní rostliny byly podobně poškozeny a do rány bylo umístěno stejné množství (0,5 g) sterilní, nekolonizované směsi otrub a udržováno ve vysoké vlhkosti, aby se simulovalo prostředí pro rozvoj choroby a zajistila se konzistence mezi ošetřovanými skupinami.
Způsob ošetření: Sazenice fazolí byly zality 500 ml vodného roztoku L-ornithinu (250 mg/l) nebo fungicidu Rizolex-T (50 mg/l) závlahou půdy, poté bylo ošetření třikrát opakováno v intervalu 10 dnů. Kontrolní skupiny ošetřené placebem byly zavlažovány 500 ml sterilní destilované vody. Všechna ošetření byla provedena ve skleníkových podmínkách (25 ± 2 °C, 75 ± 1 % relativní vlhkost a fotoperioda 8 h světlo / 16 h tma). Všechny květináče byly zalévány každé dva týdny a měsíčně ošetřovány vyváženým hnojivem NPK (20-20-20, s 3,6 % síry a mikroelementy TE; Zain Seeds, Egypt) v koncentraci 3–4 g/l postřikem na list dle doporučení pro danou odrůdu a pokynů výrobce. Pokud není uvedeno jinak, byly z každého biologického replikátu 72 hodin po ošetření (hpt) odebrány plně rozvinuté zralé listy (2. a 3. list odshora), homogenizovány, sloučeny a uloženy při teplotě -80 °C pro další analýzy, včetně, ale nikoli výhradně, in situ histochemické lokalizace indikátorů oxidačního stresu, lipidové peroxidace, enzymatických a neenzymatických antioxidantů a genové exprese.
Intenzita infekce plísní bílou byla hodnocena týdně 21 dní po inokulaci (dpi) s použitím stupnice 1–9 (doplňková tabulka S2) založené na stupnici Petzoldta a Dicksona (1996) upravené Teranem a kol. (2006). Stručně řečeno, stonky a větve fazolí byly zkoumány počínaje místem inokulace, aby se sledoval postup lézí podél internodií a uzlů. Poté byla změřena vzdálenost léze od místa inokulace k nejvzdálenějšímu bodu na stonku nebo větvi a na základě umístění léze bylo přiřazeno skóre 1–9, kde (1) označovalo žádnou viditelnou infekci v blízkosti místa inokulace a (2–9) označovalo postupné zvětšování velikosti léze a postup podél uzlů/internodií (doplňková tabulka S2). Intenzita infekce plísní bílou byla poté převedena na procenta pomocí vzorce 2:
Kromě toho byla plocha pod křivkou progrese onemocnění (AUDPC) vypočtena pomocí vzorce (Shaner a Finney, 1977), který byl nedávno upraven pro bílou hnilobu fazolu obecného (Chauhan a kol., 2020) s použitím rovnice 3:
Kde Yi = závažnost onemocnění v čase ti, Yi+1 = závažnost onemocnění v příštím čase ti+1, ti = čas prvního měření (ve dnech), ti+1 = čas dalšího měření (ve dnech), n = celkový počet časových bodů nebo pozorovacích bodů. Parametry růstu rostlin fazolu, včetně výšky rostliny (cm), počtu větví na rostlinu a počtu listů na rostlinu, byly zaznamenávány týdně po dobu 21 dnů ve všech biologických replikátech.
V každém biologickém opakování byly vzorky listů (druhý a třetí plně vyvinutý list shora) odebrány 45. den po ošetření (15 dní po posledním ošetření). Každý biologický opakování sestával z pěti květináčů (dvě rostliny na květináč). Přibližně 500 mg rozdrcené tkáně bylo použito k extrakci fotosyntetických pigmentů (chlorofyl a, chlorofyl b a karotenoidy) za použití 80% acetonu při 4 °C ve tmě. Po 24 hodinách byly vzorky centrifugovány a supernatant byl odebrán pro kolorimetrické stanovení obsahu chlorofylu a, chlorofylu b a karotenoidů pomocí spektrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonsko) podle metody (Lichtenthaler, 1987) měřením absorbance při třech různých vlnových délkách (A470, A646 a A663 nm). Nakonec byl obsah fotosyntetických pigmentů vypočítán pomocí následujících vzorců 4–6 popsaných Lichtenthalerem (1987).
72 hodin po ošetření (hpt) byly z každého biologického replikátu odebrány listy (druhý a třetí plně vyvinutý list odshora) pro in situ histochemickou lokalizaci peroxidu vodíku (H2O2) a superoxidového aniontu (O2•−). Každý biologický replikát sestával z pěti květináčů (dvě rostliny na květináč). Každý biologický replikát byl analyzován duplicitně (dvě technické replikáty), aby byla zajištěna přesnost, spolehlivost a reprodukovatelnost metody. H2O2 a O2•− byly stanoveny za použití 0,1% 3,3′-diaminobenzidinu (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Německo) nebo nitromodrého tetrazolia (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Německo) podle metod popsaných Romero-Puertasem a kol. (2004) a Adamem a kol. (1989) s drobnými úpravami. Pro histochemickou lokalizaci H2O2 in situ byly lístky vakuově infiltrovány 0,1% DAB v 10 mM Tris pufru (pH 7,8) a poté inkubovány při pokojové teplotě na světle po dobu 60 minut. Lístky byly běleny v 0,15% (v/v) TCA v 4:1 (v/v) ethanolu:chloroformu (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Káhira, Egypt) a poté vystaveny světlu, dokud neztmavly. Podobně byly chlopně vakuově infiltrovány 10 mM pufrem fosforečnanu draselného (pH 7,8) obsahujícím 0,1 hm./v. % HBT pro histochemickou lokalizaci O2•− in situ. Lístky byly inkubovány na světle při pokojové teplotě po dobu 20 minut, poté běleny výše uvedeným způsobem a poté osvětlovány, dokud se neobjevily tmavě modré/fialové skvrny. Intenzita výsledné hnědé (jako indikátor H2O2) nebo modrofialové (jako indikátor O2•−) barvy byla hodnocena pomocí verze programu pro zpracování obrazu ImageJ pro Fiji (http://fiji.sc; přístup 7. března 2024).
Malondialdehyd (MDA; jako marker lipidové peroxidace) byl stanoven podle metody Du a Bramlage (1992) s drobnými úpravami. Listy z každého biologického replikátu (druhý a třetí plně vyvinutý list odshora) byly odebrány 72 hodin po ošetření (hpt). Každý biologický replikát zahrnoval pět květináčů (dvě rostliny na květináč). Každý biologický replikát byl analyzován duplicitně (dvě technické replikáty), aby byla zajištěna přesnost, spolehlivost a reprodukovatelnost metody. Stručně řečeno, 0,5 g rozemleté ​​listové tkáně bylo použito pro extrakci MDA s 20% kyselinou trichloroctovou (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) obsahující 0,01 % butylovaného hydroxytoluenu (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Obsah MDA v supernatantu byl poté stanoven kolorimetricky měřením absorbance při 532 a 600 nm za použití spektrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonsko) a poté vyjádřen jako nmol g−1 FW.
Pro stanovení neenzymatických a enzymatických antioxidantů byly listy (druhý a třetí plně vyvinutý list odshora) odebrány z každého biologického replikátu 72 hodin po ošetření (hpt). Každý biologický replikát sestával z pěti květináčů (dvě rostliny na květináč). Každý biologický vzorek byl analyzován duplicitně (dva technické vzorky). Dva listy byly rozemlety tekutým dusíkem a použity přímo pro stanovení enzymatických a neenzymatických antioxidantů, celkových aminokyselin, obsahu prolinu, genové exprese a kvantifikaci oxalátu.
Celkový obsah rozpustných fenolických látek byl stanoven pomocí Folin-Ciocalteuova činidla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) s mírnými úpravami metody popsané Kahkonenem a kol. (1999). Stručně řečeno, přibližně 0,1 g homogenizované listové tkáně bylo extrahováno 20 ml 80% methanolu ve tmě po dobu 24 hodin a supernatant byl odebrán po centrifugaci. 0,1 ml extraktu vzorku bylo smícháno s 0,5 ml Folin-Ciocalteuova činidla (10 %), protřepáváno po dobu 30 s a ponecháno ve tmě po dobu 5 minut. Poté bylo do každé zkumavky přidáno 0,5 ml 20% roztoku uhličitanu sodného (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Káhira, Egypt), důkladně promícháno a inkubováno při pokojové teplotě ve tmě po dobu 1 hodiny. Po inkubaci byla absorbance reakční směsi měřena při 765 nm pomocí UV-160A spektrofotometru (Shimadzu Corporation, Japonsko). Koncentrace celkových rozpustných fenolů v extraktech vzorků byla stanovena pomocí kalibrační křivky kyseliny gallové (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) a vyjádřena v miligramech ekvivalentu kyseliny gallové na gram čerstvé hmotnosti (mg GAE g-1 čerstvé hmotnosti).
Celkový obsah rozpustných flavonoidů byl stanoven podle metody Djeridane et al. (2006) s drobnými úpravami. Stručně řečeno, 0,3 ml výše uvedeného methanolového extraktu bylo smícháno s 0,3 ml 5% roztoku chloridu hlinitého (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), důkladně promícháno a poté inkubováno při pokojové teplotě po dobu 5 minut, následovalo přidání 0,3 ml 10% roztoku octanu draselného (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Káhira, Egypt), důkladně promícháno a inkubováno při pokojové teplotě po dobu 30 minut ve tmě. Po inkubaci byla absorbance reakční směsi měřena při 430 nm pomocí spektrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonsko). Koncentrace celkových rozpustných flavonoidů v extraktech vzorků byla stanovena pomocí kalibrační křivky rutinu (TCI America, Portland, OR, USA) a poté vyjádřena v miligramech rutinového ekvivalentu na gram čerstvé hmotnosti (mg RE g-1 čerstvé hmotnosti).
Celkový obsah volných aminokyselin v listech fazolí byl stanoven za použití modifikovaného ninhydrinového činidla (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) na základě metody navržené Yokoyamou a Hiramatsu (2003) a modifikované Sunem a kol. (2006). Stručně řečeno, 0,1 g mleté ​​tkáně bylo extrahováno pufrem o pH 5,4 a 200 μl supernatantu reagovalo s 200 μl ninhydrinu (2 %) a 200 μl pyridinu (10 %; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), inkubováno ve vroucí vodní lázni po dobu 30 minut, poté ochlazeno a měřeno při 580 nm za použití spektrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonsko). Na druhou stranu, prolin byl stanoven Batesovou metodou (Bates a kol., 1973). Prolin byl extrahován 3% kyselinou sulfosalicylovou (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) a po centrifugaci bylo 0,5 ml supernatantu smícháno s 1 ml ledové kyseliny octové (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) a ninhydrinovým činidlem, inkubováno při 90 °C po dobu 45 minut, ochlazeno a měřeno při 520 nm za použití stejného spektrofotometru jako výše. Celkové volné aminokyseliny a prolin v extraktech listů byly stanoveny pomocí kalibračních křivek glycinu a prolinu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a vyjádřeny v mg/g čerstvé hmotnosti.
Pro stanovení enzymatické aktivity antioxidačních enzymů bylo přibližně 500 mg homogenizované tkáně extrahováno 3 ml 50 mM Tris pufru (pH 7,8) obsahujícího 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a 7,5% polyvinylpyrrolidon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), centrifugováno při 10 000 × g po dobu 20 minut za chlazení (4 °C) a supernatant (surový enzymový extrakt) byl odebrán (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Kataláza (CAT) byla poté podrobena reakci s 2 ml 0,1 M fosfátového pufru sodného (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a 100 μl roztoku H2O2 o koncentraci 269 mM za účelem stanovení její enzymatické aktivity podle metody Aebiho (1984) s drobnými úpravami (El-Nagar a kol., 2023; Osman a kol., 2023). Enzymatická aktivita guajakol-dependentní peroxidázy (POX) byla stanovena metodou Harracha a kol. (2009). (2008) s drobnými úpravami (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) a enzymatická aktivita polyfenoloxidázy (PPO) byla stanovena po reakci s 2,2 ml 100 mM fosfátového pufru sodného (pH 6,0), 100 μl guajakolu (TCI chemicals, Portland, OR, USA) a 100 μl 12 mM H2O2. Metoda byla mírně upravena oproti (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Stanovení bylo provedeno po reakci s 3 ml roztoku katecholu (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) čerstvě připraveného v 0,1 M fosfátovém pufru (pH 6,0). Aktivita CAT byla měřena monitorováním rozkladu H2O2 při 240 nm (A240), aktivita POX byla měřena monitorováním nárůstu absorbance při 436 nm (A436) a aktivita PPO byla měřena zaznamenáváním fluktuací absorbance při 495 nm (A495) každých 30 s po dobu 3 minut za použití spektrofotometru UV-160A (Shimadzu, Japonsko).
K detekci hladin transkriptů tří genů souvisejících s antioxidanty, včetně peroxizomální katalázy (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxiddismutázy (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1) a glutathionreduktázy (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), v listech fazolí (druhý a třetí plně vyvinutý list odshora) 72 hodin po posledním ošetření byla použita real-time RT-PCR. Stručně řečeno, RNA byla izolována za použití soupravy Simply P Total RNA Extraction Kit (kat. č. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Čína) podle protokolu výrobce. Poté byla cDNA syntetizována za použití soupravy TOP script™ cDNA Synthesis Kit podle pokynů výrobce. Sekvence primerů výše uvedených tří genů jsou uvedeny v doplňkové tabulce S3. Jako housekeeping gen byl použit PvActin-3 (přístupové číslo GenBank: XM_068616709.1) a relativní exprese genu byla vypočtena metodou 2-ΔΔCT (Livak a Schmittgen, 2001). Byla prokázána stabilita aktinu za biotického stresu (nekompatibilní interakce mezi běžnými bobovitými rostlinami a antraknózou Colletotrichum lindemuthianum) a abiotického stresu (sucho, slanost, nízká teplota) (Borges a kol., 2012).
Nejprve jsme provedli celogenomovou in silico analýzu proteinů oxaloacetát acetylhydrolázy (OAH) v S. sclerotiorum pomocí nástroje protein-protein BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Stručně řečeno, použili jsme OAH z Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; přístupové číslo GenBank XP_040799428.1; 342 aminokyselin) a Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; přístupové číslo GenBank XP_056833920.1; 316 aminokyselin) jako dotazovací sekvence pro mapování homologního proteinu v S. sclerotiorum (taxide: 5180). BLASTp byl proveden s využitím nejnovějších dostupných dat genomu S. sclerotiorum v databázi GenBank na webových stránkách Národního centra pro biotechnologické informace (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Kromě toho byl pomocí metody maximální věrohodnosti v MEGA11 (Tamura et al., 2021) a modelu založeného na maticích JTT (Jones et al., 1992) odvozen predikovaný gen OAH z S. sclerotiorum (SsOAH) a evoluční analýza a fylogenetický strom AfOAH z A. fijiensis CBS 313.89 a PlOAH z P. lagena. Fylogenetický strom byl kombinován s analýzou vícenásobného zarovnání proteinových sekvencí všech predikovaných genů OAH (SsOAH) z S. sclerotiorum a dotazované sekvence pomocí nástroje pro zarovnání na základě omezení (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos a Agarwala, 2007). Kromě toho byly nejlépe odpovídající aminokyselinové sekvence SsOAH z S. sclerotiorum zarovnány s dotazovanými sekvencemi (AfOAH a PlOAH) (Larkin et al., 2007) pomocí programu ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) a konzervované oblasti v zarovnání byly vizualizovány pomocí nástroje ESPript (verze 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Předpovězené funkční reprezentativní domény a konzervovaná místa S. sclerotiorum SsOAH byly dále interaktivně klasifikovány do různých rodin pomocí nástroje InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Nakonec bylo provedeno trojrozměrné (3D) modelování struktury predikovaného S. sclerotiorum SsOAH pomocí nástroje Protein Homology/Analogy Recognition Engine (server Phyre2 verze 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) a validováno pomocí serveru SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Předpovězené trojrozměrné struktury (formát PDB) byly interaktivně vizualizovány pomocí balíčku UCSF-Chimera (verze 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen a kol., 2004).
Kvantitativní real-time fluorescenční PCR byla použita pro stanovení transkripční hladiny oxaloacetát acetylhydrolázy (SsOAH; GenBank evidenční číslo: XM_001590428.1) v myceliu Sclerotinia sclerotiorum. Stručně řečeno, S. sclerotiorum byl naočkován do baňky obsahující PDB a umístěn do třepacího inkubátoru (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) při teplotě 25 ± 2 °C po dobu 24 hodin při 150 ot/min a v konstantní tmě (24 hodin) pro stimulaci růstu mycelia. Poté byly buňky ošetřeny L-ornithinem a fungicidem Rizolex-T v konečných koncentracích IC50 (přibližně 40 a 3,2 mg/l) a poté kultivovány dalších 24 hodin za stejných podmínek. Po inkubaci byly kultury centrifugovány při 2500 ot/min po dobu 5 minut a supernatant (mycelium hub) byl odebrán pro analýzu genové exprese. Podobně bylo mycelium hub odebráno 0, 24, 48, 72, 96 a 120 hodin po infekci z infikovaných rostlin, které na povrchu infikovaných tkání vytvořily bílou plíseň a vatovité mycelium. RNA byla extrahována z mycelia hub a poté byla syntetizována cDNA, jak je popsáno výše. Sekvence primerů pro SsOAH jsou uvedeny v doplňkové tabulce S3. Jako housekeeping gen byl použit SsActin (přístupové číslo GenBank: XM_001589919.1) a relativní genová exprese byla vypočtena metodou 2-ΔΔCT (Livak a Schmittgen, 2001).
Kyselina šťavelová byla stanovena v bramborovém dextrózovém bujónu (PDB) a ve vzorcích rostlin obsahujících houbový patogen Sclerotinia sclerotiorum podle metody Xu a Zhanga (2000) s drobnými úpravami. Stručně řečeno, izoláty S. sclerotiorum byly naočkovány do baněk obsahujících PDB a poté kultivovány v třepacím inkubátoru (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) při 150 ot/min a teplotě 25 ± 2 °C po dobu 3–5 dnů v neustálé tmě (24 hodin), aby se stimuloval růst mycelia. Po inkubaci byla houbová kultura nejprve filtrována přes filtrační papír Whatman #1 a poté centrifugována při 2500 ot/min po dobu 5 minut, aby se odstranilo zbytkové mycelium. Supernatant byl odebrán a uložen při 4 °C pro další kvantitativní stanovení oxalátu. Pro přípravu vzorků rostlin bylo přibližně 0,1 g fragmentů rostlinné tkáně třikrát extrahováno destilovanou vodou (pokaždé 2 ml). Vzorky byly poté centrifugovány při 2500 ot/min po dobu 5 minut, supernatant byl suchě přefiltrován přes filtrační papír Whatman č. 1 a shromážděn pro další analýzu.
Pro kvantitativní analýzu kyseliny šťavelové byla reakční směs připravena ve skleněné zkumavce se zátkou v následujícím pořadí: 0,2 ml vzorku (nebo filtrátu kultury PDB nebo standardního roztoku kyseliny šťavelové), 0,11 ml bromfenolové modři (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml 1 M kyseliny sírové (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Káhira, Egypt) a 0,176 ml 100 mM dichromanu draselného (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA). Poté byl roztok zředěn destilovanou vodou na 4,8 ml, důkladně promíchán a ihned umístěn do vodní lázně o teplotě 60 °C. Po 10 minutách byla reakce zastavena přidáním 0,5 ml roztoku hydroxidu sodného (NaOH; 0,75 M). Absorbance (A600) reakční směsi byla měřena při 600 nm pomocí spektrofotometru UV-160 (Shimadzu Corporation, Japonsko). PDB a destilovaná voda byly použity jako kontroly pro kvantifikaci kultivačních filtrátů a rostlinných vzorků. Koncentrace kyseliny šťavelové v kultivačních filtrátech, vyjádřené v mikrogramech kyseliny šťavelové na mililitr média PDB (μg.mL−1), a v extraktech listů, vyjádřené v mikrogramech kyseliny šťavelové na gram čerstvé hmotnosti (μg.g−1 FW), byly stanoveny pomocí kalibrační křivky kyseliny šťavelové (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
V průběhu studie byly všechny experimenty navrženy v kompletně randomizovaném designu (CRD) se šesti biologickými replikacemi na ošetření a pěti květináči na biologickou replikaci (dvě rostliny na květináč), pokud nebylo uvedeno jinak. Biologické replikace byly analyzovány duplicitně (dvě technické replikace). Technické replikace byly použity k ověření reprodukovatelnosti stejného experimentu, ale nebyly použity ve statistické analýze, aby se předešlo falešným replikacím. Data byla statisticky analyzována pomocí analýzy rozptylu (ANOVA) s následným Tukey-Kramerovým testem spolehlivě významné diferenční hodnoty (HSD) (p ≤ 0,05). Pro experimenty in vitro byly hodnoty IC50 a IC99 vypočítány pomocí probitového modelu a byly vypočítány 95% intervaly spolehlivosti.
Celkem čtyři izoláty byly odebrány z různých sójových polí v governorátu El Ghabiya v Egyptě. Na PDA médiu všechny izoláty vytvořily krémově bílé mycelium, které se ve stádiu sklerocia rychle zbarvilo do vatovitě bílé barvy (obrázek 1A) a poté se zbarvilo do béžové nebo hnědé barvy. Sklerotia jsou obvykle hustá, černá, kulovitého nebo nepravidelného tvaru, 5,2 až 7,7 mm dlouhá a 3,4 až 5,3 mm v průměru (obrázek 1B). Ačkoli se u čtyř izolátů po 10–12 dnech inkubace při teplotě 25 ± 2 °C vyvinul okrajový vzor sklerotií na okraji kultivačního média (obr. 1A), počet sklerotií na plotnu se mezi nimi významně lišil (P < 0,001), přičemž izolát 3 měl nejvyšší počet sklerotií (32,33 ± 1,53 sklerotií na plotnu; obr. 1C). Podobně izolát č. 3 produkoval v PDB více kyseliny šťavelové než ostatní izoláty (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; obr. 1D). Izolát č. 3 vykazoval typické morfologické a mikroskopické vlastnosti fytopatogenní houby Sclerotinia sclerotiorum. Například na PDA kolonie izolátu č. 3 rostly rychle, byly krémově bílé (obrázek 1A), reverzně béžové nebo světle lososově žlutohnědé a potřebovaly 6–7 dní při teplotě 25 ± 2 °C, aby zcela pokryly povrch plotny o průměru 9 cm. Na základě výše uvedených morfologických a mikroskopických vlastností byl izolát č. 3 identifikován jako Sclerotinia sclerotiorum.
Obrázek 1. Charakteristika a patogenita izolátů S. sclerotiorum z běžných luštěnin. (A) Myceliální růst čtyř izolátů S. sclerotiorum na médiu PDA, (B) sklerocia čtyř izolátů S. sclerotiorum, (C) počet sklerocií (na misku), (D) sekrece kyseliny šťavelové na médiu PDB (μg.mL−1) a (E) závažnost onemocnění (%) čtyř izolátů S. sclerotiorum na citlivé komerční odrůdě luštěnin Giza 3 za skleníkových podmínek. Hodnoty představují průměr ± SD pěti biologických replikátů (n = 5). Různá písmena označují statisticky významné rozdíly mezi ošetřeními (p < 0,05). (F–H) Typické příznaky bílé plísně se objevily na nadzemních stoncích a silikách 10 dní po inokulaci izolátem č. 3 (dpi). (I) Evoluční analýza oblasti interního transkribovaného spaceru (ITS) izolátu č. 3 S. sclerotiorum byla provedena metodou maximální věrohodnosti a porovnána s 20 referenčními izoláty/kmeny získanými z databáze Národního centra pro biotechnologické informace (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Čísla nad shlukovacími čarami označují pokrytí oblasti (%) a čísla pod shlukovacími čarami označují délku větve.
Dále, pro potvrzení patogenity, byly čtyři získané izoláty S. sclerotiorum použity k inokulaci náchylného komerčního kultivaru fazolí Giza 3 ve skleníkových podmínkách, což je v souladu s Kochovými postuláty (obr. 1E). Přestože všechny získané izoláty hub byly patogenní a mohly infikovat zelené fazole (kultivátor Giza 3), což způsobovalo typické příznaky bílé plísně na všech nadzemních částech (obr. 1F), zejména na stoncích (obr. 1G) a luscích (obr. 1H) 10 dní po inokulaci (dpi), izolát 3 byl nejagresivnějším izolátem ve dvou nezávislých experimentech. Izolát 3 měl nejvyšší závažnost onemocnění (%) na rostlinách fazolí (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 a 76,7 ± 3,1 7, 14 a 21 dní po infekci; obrázek 1F).
Identifikace nejinvazivnějšího izolátu S. sclerotiorum č. 3 byla dále potvrzena na základě sekvenování interního transkribovaného spaceru (ITS) (obr. 1I). Fylogenetická analýza mezi izolátem č. 3 a 20 referenčními izoláty/kmeny ukázala vysokou podobnost (>99 %). Za zmínku stojí, že izolát S. sclerotiorum č. 3 (533 bp) má vysokou podobnost s americkým izolátem S. sclerotiorum LPM36 izolovaným ze suchých semen hrachu (přístupové číslo GenBank MK896659.1; 540 bp) a čínským izolátem S. sclerotiorum YKY211 (přístupové číslo GenBank OR206374.1; 548 bp), který způsobuje hnilobu stonku fialky (Matthiola incana), přičemž všechny jsou seskupeny samostatně v horní části dendrogramu (obrázek 1I). Nová sekvence byla uložena v databázi NCBI a pojmenována „Sclerotinia sclerotiorum – izolát YN-25“ (přístupové číslo GenBank PV202792). Je vidět, že izolát 3 je nejinvazivnějším izolátem; proto byl tento izolát vybrán pro studium ve všech následujících experimentech.
Antibakteriální aktivita diaminu L-ornithinu (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Německo) v různých koncentracích (12,5, 25, 50, 75, 100 a 125 mg/l) proti izolátu 3 S. sclerotiorum byla zkoumána in vitro. Je pozoruhodné, že L-ornithin vykazoval antibakteriální účinek a postupně inhiboval radiální růst hyf S. sclerotiorum v závislosti na dávce (obrázek 2A, B). Při nejvyšší testované koncentraci (125 mg/l) vykazoval L-ornithin nejvyšší míru inhibice růstu mycelia (99,62 ± 0,27 %; obrázek 2B), což bylo ekvivalentní komerčnímu fungicidu Rizolex-T (míra inhibice 99,45 ± 0,39 %; obrázek 2C) při nejvyšší testované koncentraci (10 mg/l), což naznačuje podobnou účinnost.
Obrázek 2. Antibakteriální účinek L-ornithinu proti Sclerotinia sclerotiorum in vitro. (A) Porovnání antibakteriální účinku různých koncentrací L-ornithinu proti S. sclerotiorum s komerčním fungicidem Rizolex-T (10 mg/l). (B, C) Míra inhibice (%) růstu mycelia S. sclerotiorum po ošetření různými koncentracemi L-ornithinu (12,5, 25, 50, 75, 100 a 125 mg/l) nebo Rizolex-T (2, 4, 6, 8 a 10 mg/l). Hodnoty představují průměr ± SD pěti biologických replikátů (n = 5). Různá písmena označují statistické rozdíly mezi ošetřeními (p < 0,05). (D, E) Regresní analýza L-ornithinu a komerčního fungicidu Rizolex-T pomocí Probitového modelu. Regresní přímka probitového modelu je zobrazena jako plná modrá čára a interval spolehlivosti (95 %) je zobrazen jako přerušovaná červená čára.
Dále byla provedena probitová regresní analýza a odpovídající grafy jsou uvedeny v tabulce 1 a na obrázcích 2D,E. Stručně řečeno, přijatelná hodnota sklonu (y = 2,92x − 4,67) a související významné statistiky (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 a p < 0,0001; obrázek 2D) L-ornithinu naznačují zvýšenou antifungální aktivitu proti S. sclerotiorum ve srovnání s komerčním fungicidem Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 a p < 0,0001) (tabulka 1).
Tabulka 1. Hodnoty poloviční maximální inhibiční koncentrace (IC50) a IC99 (mg/l) L-ornithinu a komerčního fungicidu „Rizolex-T“ proti S. sclerotiorum.
Celkově L-ornithin (250 mg/l) významně snížil vývoj a závažnost plísně bílé na ošetřených rostlinách fazolu obecného ve srovnání s neošetřenými rostlinami infikovanými S. sclerotiorum (kontrola; obrázek 3A). Stručně řečeno, ačkoli závažnost onemocnění u neošetřených infikovaných kontrolních rostlin postupně rostla (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 a 92,33 ± 3,06 %), L-ornithin významně snížil závažnost onemocnění (%) v průběhu celého experimentu (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 a 26,36 ± 3,07) 7, 14 a 21 dní po ošetření (dpt) (obrázek 3A). Podobně, když byly rostliny fazolu infikované S. sclerotiorum ošetřeny 250 mg/l L-ornithinu, plocha pod křivkou progrese onemocnění (AUDPC) se snížila z 1274,33 ± 33,13 u neošetřené kontroly na 281,03 ± 7,95, což bylo mírně méně než u pozitivní kontroly s fungicidem Rizolex-T 50 mg/l (183,61 ± 7,71; obr. 3B). Stejný trend byl pozorován i ve druhém experimentu.
Obr. 3. Vliv exogenní aplikace L-ornithinu na vývoj bílé hniloby fazolu obecného způsobené Sclerotinia sclerotiorum za skleníkových podmínek. (A) Křivka progrese onemocnění bílé plísně fazolu obecného po ošetření 250 mg/l L-ornithinu. (B) Plocha pod křivkou progrese onemocnění (AUDPC) bílé plísně fazolu obecného po ošetření L-ornithinem. Hodnoty představují průměr ± SD pěti biologických replikátů (n = 5). Různá písmena označují statisticky významné rozdíly mezi ošetřeními (p < 0,05).
Exogenní aplikace 250 mg/l L-ornithinu postupně zvyšovala po 42 dnech výšku rostlin (obr. 4A), počet větví na rostlinu (obr. 4B) a počet listů na rostlinu (obr. 4C). Zatímco komerční fungicid Rizolex-T (50 mg/l) měl největší vliv na všechny studované nutriční parametry, exogenní aplikace 250 mg/l L-ornithinu měla druhý největší účinek ve srovnání s neošetřenými kontrolami (obr. 4A–C). Na druhou stranu, ošetření L-ornithinem nemělo významný vliv na obsah fotosyntetických pigmentů chlorofylu a (obr. 4D) a chlorofylu b (obr. 4E), ale mírně zvýšilo celkový obsah karotenoidů (0,56 ± 0,03 mg/g suché hmotnosti) ve srovnání s negativní kontrolou (0,44 ± 0,02 mg/g suché hmotnosti) a pozitivní kontrolou (0,46 ± 0,02 mg/g suché hmotnosti; obr. 4F). Celkově tyto výsledky naznačují, že L-ornithin není fytotoxický pro ošetřené luštěniny a může dokonce stimulovat jejich růst.
Obr. 4. Vliv aplikace exogenního L-ornithinu na růstové charakteristiky a fotosyntetické pigmenty listů fazolí infikovaných Sclerotinia sclerotiorum za skleníkových podmínek. (A) Výška rostliny (cm), (B) Počet větví na rostlinu, (C) Počet listů na rostlinu, (D) Obsah chlorofylu a (mg g-1 suché hmotnosti), (E) Obsah chlorofylu b (mg g-1 suché hmotnosti), (F) Celkový obsah karotenoidů (mg g-1 suché hmotnosti). Hodnoty jsou průměr ± SD z pěti biologických replikátů (n = 5). Různá písmena označují statisticky významné rozdíly mezi ošetřeními (p < 0,05).
Histochemická lokalizace reaktivních forem kyslíku (ROS; vyjádřeno jako peroxid vodíku [H2O2]) a volných radikálů (vyjádřeno jako superoxidové anionty [O2•−]) in situ ukázala, že exogenní aplikace L-ornithinu (250 mg/l) významně snížila akumulaci H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; obr. 5A) a O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; obr. 5B) ve srovnání s akumulací u neošetřených infikovaných rostlin (173,31 ± 12,06 a 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) a rostlin ošetřených 50 mg/l komerčního fungicidu Rizolex-T (170,12 ± 9,50 a 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) po 72 hodinách. Vysoké hladiny H2O2 a O2•− se akumulovaly za hpt (obr. 5A, B). Podobně test s malondialdehydem (MDA) na bázi TCA ukázal, že rostliny fazole infikované S. sclerotiorum akumulovaly ve svých listech vyšší hladiny MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr. wt) (obr. 5C). Exogenní aplikace L-ornithinu však významně snížila lipidovou peroxidaci, o čemž svědčí snížení obsahu MDA v ošetřených rostlinách (33,08 ± 4,00 nmol.g fr. wt).
Obr. 5. Vliv aplikace exogenního L-ornithinu na hlavní markery oxidačního stresu a neenzymatické antioxidační obranné mechanismy v listech fazolí infikovaných S. sclerotiorum 72 hodin po infekci za skleníkových podmínek. (A) Peroxid vodíku (H2O2; nmol g−1 FW) při 72 hpt, (B) superoxidový anion (O2•−; nmol g−1 FW) při 72 hpt, (C) malondialdehyd (MDA; nmol g−1 FW) při 72 hpt, (D) celkové rozpustné fenoly (mg GAE g−1 FW) při 72 hpt, (E) celkové rozpustné flavonoidy (mg RE g−1 FW) při 72 hpt, (F) celkové volné aminokyseliny (mg g−1 FW) při 72 hpt a (G) obsah prolinu (mg g−1 FW) při 72 hpt. Hodnoty představují průměr ± směrodatnou odchylku (průměr ± SD) 5 biologických replikátů (n = 5). Různá písmena označují statisticky významné rozdíly mezi jednotlivými léčbami (p < 0,05).