Děkujeme za návštěvu webu nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat nejnovější verzi prohlížeče (nebo vypnout režim kompatibility v prohlížeči Internet Explorer). Aby byla zajištěna trvalá podpora, tento web nebude obsahovat styly ani JavaScript.
Prašné bouře představují vážnou hrozbu pro mnoho zemí světa kvůli jejich ničivému dopadu na zemědělství, lidské zdraví, dopravní sítě a infrastrukturu. V důsledku toho je větrná eroze považována za globální problém. Jedním z ekologicky šetrných přístupů k omezení větrné eroze je použití mikrobiálně indukované uhličitanové srážení (MICP). Vedlejší produkty MICP na bázi degradace močoviny, jako je amoniak, však nejsou ideální, pokud jsou vyráběny ve velkém množství. Tato studie představuje dvě formulace bakterií obsahujících mravenčan vápenatý pro degradaci MICP bez produkce močoviny a komplexně porovnává jejich výkonnost se dvěma formulacemi bakterií obsahujících octan vápenatý, které neprodukují amoniak. Uvažovanými bakteriemi jsou Bacillus subtilis a Bacillus amyloliquefaciens. Nejprve byly stanoveny optimalizované hodnoty faktorů řídících tvorbu CaCO3. Poté byly provedeny testy v aerodynamickém tunelu na vzorcích písečných dun ošetřených optimalizovanými formulacemi a byla změřena odolnost vůči větrné erozi, prahová rychlost odlupování a odolnost vůči bombardování pískem. Alomorfy uhličitanu vápenatého (CaCO3) byly hodnoceny pomocí optické mikroskopie, rastrovací elektronové mikroskopie (SEM) a rentgenové difrakční analýzy. Formulace na bázi mravenčanu vápenatého si vedly výrazně lépe než formulace na bázi octanu, pokud jde o tvorbu uhličitanu vápenatého. Kromě toho B. subtilis produkoval více uhličitanu vápenatého než B. amyloliquefaciens. SEM mikrofotografie jasně ukázaly vazbu a otisk aktivních a neaktivních bakterií na uhličitan vápenatý v důsledku sedimentace. Všechny formulace významně snížily větrnou erozi.
Větrná eroze je již dlouho považována za hlavní problém, kterému čelí suché a polosuché oblasti, jako je jihozápad Spojených států, západní Čína, saharská Afrika a velká část Blízkého východu1. Nízké srážky v suchém a hypersuchém podnebí proměnily velké části těchto oblastí v pouště, písečné duny a neobdělávanou půdu. Pokračující větrná eroze představuje environmentální hrozbu pro infrastrukturu, jako jsou dopravní sítě, zemědělská půda a průmyslové pozemky, což vede ke špatným životním podmínkám a vysokým nákladům na rozvoj měst v těchto regionech2,3,4. Důležité je, že větrná eroze nejen ovlivňuje místo, kde se vyskytuje, ale také způsobuje zdravotní a ekonomické problémy v odlehlých komunitách, protože větrem přenáší částice do oblastí daleko od zdroje5,6.
Kontrola větrné eroze zůstává globálním problémem. K regulaci větrné eroze se používají různé metody stabilizace půdy. Mezi tyto metody patří materiály, jako je aplikace vody7, olejové mulče8, biopolymery5, mikrobiálně indukovaná uhličitanová srážecí látka (MICP)9,10,11,12 a enzymaticky indukovaná uhličitanová srážecí látka (EICP)1. Smáčení půdy je standardní metodou potlačování prašnosti v terénu. Jeho rychlé odpařování však činí tuto metodu omezenou účinností v suchých a polosuchých oblastech1. Aplikace olejových mulčovacích směsí zvyšuje soudržnost písku a tření mezi částicemi. Jejich kohezní vlastnost váže zrna písku dohromady; olejové mulče však představují i ​​další problémy; jejich tmavá barva zvyšuje absorpci tepla a vede k úhynu rostlin a mikroorganismů. Jejich zápach a výpary mohou způsobit dýchací potíže a další překážkou je především jejich vysoká cena. Biopolymery jsou jednou z nedávno navržených ekologických metod pro zmírnění větrné eroze; extrahují se z přírodních zdrojů, jako jsou rostliny, zvířata a bakterie. Xanthanová guma, guarová guma, chitosan a gelanová guma jsou nejčastěji používanými biopolymery v inženýrských aplikacích5. Ve vodě rozpustné biopolymery však mohou při vystavení vodě ztrácet pevnost a vyplavovat se z půdy13,14. Ukázalo se, že EICP je účinnou metodou potlačování prašnosti pro řadu aplikací, včetně nezpevněných silnic, odkališť a stavenišť. Ačkoli jsou výsledky povzbudivé, je třeba zvážit některé potenciální nevýhody, jako jsou náklady a nedostatek nukleačních míst (což urychluje tvorbu a srážení krystalů CaCO315,16).
MICP byl poprvé popsán koncem 19. století Murrayem a Irwinem (1890) a Steinmannem (1901) ve své studii degradace močoviny mořskými mikroorganismy17. MICP je přirozeně se vyskytující biologický proces zahrnující řadu mikrobiálních aktivit a chemických procesů, při kterých se uhličitan vápenatý sráží reakcí uhličitanových iontů z mikrobiálních metabolitů s ionty vápníku v prostředí18,19. MICP zahrnující cyklus dusíku degradujícího močovinu (MICP degradující močovinu) je nejběžnějším typem mikrobiálně indukované srážení uhličitanu, při kterém ureáza produkovaná bakteriemi katalyzuje hydrolýzu močoviny20,21,22,23,24,25,26,27 takto:
V MICP zahrnujícím uhlíkový cyklus oxidace organických solí (typ MICP bez degradace močoviny) používají heterotrofní bakterie organické soli, jako je acetát, laktát, citrát, sukcinát, oxalát, malát a glyoxylát, jako zdroje energie k produkci uhličitanových minerálů28. V přítomnosti laktátu vápenatého jako zdroje uhlíku a vápenatých iontů je chemická reakce tvorby uhličitanu vápenatého znázorněna v rovnici (5).
V procesu MICP poskytují bakteriální buňky nukleační místa, která jsou obzvláště důležitá pro srážení uhličitanu vápenatého; povrch bakteriální buňky je negativně nabitý a může působit jako adsorbent pro dvojmocné kationty, jako jsou ionty vápníku. Adsorpcí iontů vápníku na bakteriální buňky, když je koncentrace uhličitanových iontů dostatečná, reagují kationty vápníku a uhličitanové anionty a uhličitan vápenatý se sráží na povrchu bakterií29,30. Proces lze shrnout následovně31,32:
Biogenerované krystaly uhličitanu vápenatého lze rozdělit do tří typů: kalcit, vaterit a aragonit. Mezi nimi jsou kalcit a vaterit nejběžnějšími bakteriálně indukovanými alomorfy uhličitanu vápenatého33,34. Kalcit je termodynamicky nejstabilnější alomorf uhličitanu vápenatého35. Ačkoli bylo vaterit popsáno jako metastabilní, nakonec se transformuje na kalcit36,37. Vaterit je z těchto krystalů nejhustší. Je to hexagonální krystal, který má díky své větší velikosti lepší schopnost vyplňovat póry než jiné krystaly uhličitanu vápenatého38. MICP degradovaný močovinou i nedegradovaný močovinou může vést ke srážení vateritu13,39,40,41.
Ačkoli MICP prokázal slibný potenciál při stabilizaci problematických půd a půd náchylných k větrné erozi42,43,44,45,46,47,48, jedním z vedlejších produktů hydrolýzy močoviny je amoniak, který může v závislosti na úrovni expozice způsobit mírné až závažné zdravotní problémy49. Tento vedlejší účinek činí použití této konkrétní technologie kontroverzním, zejména pokud je třeba ošetřit velké plochy, například k potlačení prašnosti. Kromě toho je zápach amoniaku nesnesitelný, pokud se proces provádí s vysokými aplikačními dávkami a velkými objemy, což může ovlivnit jeho praktickou použitelnost. Ačkoli nedávné studie ukázaly, že amonné ionty lze snížit jejich přeměnou na jiné produkty, jako je struvit, tyto metody amonné ionty zcela neodstraňují50. Proto je stále třeba zkoumat alternativní řešení, která negenerují amonné ionty. Použití nemočovinových degradačních cest pro MICP může poskytnout potenciální řešení, které bylo v kontextu zmírňování větrné eroze dosud málo prozkoumáno. Fattahi a kol. zkoumali degradaci MICP bez močoviny za použití octanu vápenatého a Bacillus megaterium41, zatímco Mohebbi a kol. použili octan vápenatý a Bacillus amyloliquefaciens9. Jejich studie však nebyla srovnávána s jinými zdroji vápníku a heterotrofními bakteriemi, které by mohly v konečném důsledku zlepšit odolnost proti větrné erozi. Chybí také literatura porovnávající cesty degradace bez močoviny s cestami degradace močoviny při zmírňování větrné eroze.
Kromě toho byla většina studií větrné eroze a kontroly prachu provedena na vzorcích půdy s rovným povrchem.1,51,52,53 Rovné povrchy jsou však v přírodě méně běžné než kopce a prohlubně. Proto jsou písečné duny nejběžnějším krajinným prvkem v pouštních oblastech.
Aby se překonaly výše uvedené nedostatky, cílem této studie bylo zavést novou sadu bakteriálních činidel neprodukujících amoniak. Za tímto účelem jsme zvažovali dráhy MICP nedegradující močovinu. Byla zkoumána účinnost dvou zdrojů vápníku (mravenčan vápenatý a octan vápenatý). Podle znalostí autorů nebyla srážení uhličitanem s použitím kombinací dvou zdrojů vápníku a bakterií (tj. mravenčan vápenatý-Bacillus subtilis a mravenčan vápenatý-Bacillus amyloliquefaciens) v předchozích studiích zkoumána. Volba těchto bakterií byla založena na enzymech, které produkují a které katalyzují oxidaci mravenčanu vápenatého a octanu vápenatého za vzniku mikrobiálního srážení uhličitanu. Navrhli jsme důkladnou experimentální studii s cílem najít optimální faktory, jako je pH, typy bakterií a zdrojů vápníku a jejich koncentrace, poměr bakterií k roztoku zdroje vápníku a doba vytvrzování. Účinnost této sady bakteriálních látek při potlačování větrné eroze srážením uhličitanu vápenatého byla nakonec zkoumána provedením série testů v aerodynamickém tunelu na písečných dunách za účelem stanovení velikosti větrné eroze, prahové rychlosti odtržení a odolnosti písku vůči bombardování větrem. Byla také provedena měření penetrometrem a mikrostrukturální studie (např. analýza rentgenové difrakce (XRD) a rastrovací elektronová mikroskopie (SEM)).
Výroba uhličitanu vápenatého vyžaduje ionty vápníku a uhličitanové ionty. Ionty vápníku lze získat z různých zdrojů vápníku, jako je chlorid vápenatý, hydroxid vápenatý a sušené odstředěné mléko54,55. Uhličitanové ionty lze vyrobit různými mikrobiálními metodami, jako je hydrolýza močoviny a aerobní nebo anaerobní oxidace organické hmoty56. V této studii byly uhličitanové ionty získány oxidační reakcí mravenčanu a octanu. Kromě toho jsme k výrobě čistého uhličitanu vápenatého použili vápenaté soli mravenčanu a octanu, takže jako vedlejší produkty byly získány pouze CO2 a H2O. V tomto procesu slouží pouze jedna látka jako zdroj vápníku a zdroj uhličitanu a nevznikají žádné amoniaky. Díky těmto vlastnostem je metoda výroby zdroje vápníku a uhličitanu, kterou jsme považovali za velmi slibnou.
Odpovídající reakce mravenčanu vápenatého a octanu vápenatého za vzniku uhličitanu vápenatého jsou znázorněny ve vzorcích (7)-(14). Vzorce (7)-(11) ukazují, že mravenčan vápenatý se rozpouští ve vodě za vzniku kyseliny mravenčí nebo mravenčanu. Roztok je tedy zdrojem volného vápníku a hydroxidových iontů (vzorce 8 a 9). V důsledku oxidace kyseliny mravenčí se atomy uhlíku v kyselině mravenčí přeměňují na oxid uhličitý (vzorec 10). Nakonec vzniká uhličitan vápenatý (vzorce 11 a 12).
Podobně se uhličitan vápenatý tvoří z octanu vápenatého (rovnice 13–15), s tím rozdílem, že místo kyseliny mravenčí se tvoří kyselina octová nebo octan.
Bez přítomnosti enzymů nemohou být acetát a mravenčan oxidovány při pokojové teplotě. FDH (formiátdehydrogenáza) a CoA (koenzym A) katalyzují oxidaci mravenčanu a acetátu za vzniku oxidu uhličitého (rovnice 16, 17) 57, 58, 59. Různé bakterie jsou schopny tyto enzymy produkovat a v této studii byly použity heterotrofní bakterie, konkrétně Bacillus subtilis (PTCC #1204 (Persian Type Culture Collection), známá také jako NCIMB #13061 (International Collection of Bacteria, Yeast, Phage, Plasmids, Plant Seeds and Plant Cell Tissue Cultures)) a Bacillus amyloliquefaciens (PTCC #1732, NCIMB #12077). Tyto bakterie byly kultivovány v médiu obsahujícím masový pepton (5 g/l) a masový extrakt (3 g/l), nazývaném živný vývar (NBR) (105443 Merck).
Byly tedy připraveny čtyři formulace pro indukci srážení uhličitanu vápenatého za použití dvou zdrojů vápníku a dvou bakterií: mravenčanu vápenatého a Bacillus subtilis (FS), mravenčanu vápenatého a Bacillus amyloliquefaciens (FA), octanu vápenatého a Bacillus subtilis (AS) a octanu vápenatého a Bacillus amyloliquefaciens (AA).
V první části experimentálního návrhu byly provedeny testy za účelem určení optimální kombinace, která by dosáhla maximální produkce uhličitanu vápenatého. Vzhledem k tomu, že vzorky půdy obsahovaly uhličitan vápenatý, byla navržena sada předběžných hodnotících testů pro přesné měření CaCO3 produkovaného různými kombinacemi a byly vyhodnoceny směsi kultivačního média a roztoků zdroje vápníku. Pro každou výše definovanou kombinaci zdroje vápníku a bakteriálního roztoku (FS, FA, AS a AA) byly odvozeny optimalizační faktory (koncentrace zdroje vápníku, doba vytvrzování, koncentrace bakteriálního roztoku měřená optickou hustotou roztoku (OD), poměr zdroje vápníku k bakteriálnímu roztoku a pH) a použity v testech v aerodynamickém tunelu pro úpravu písečných dun popsaných v následujících částech.
Pro každou kombinaci bylo provedeno 150 experimentů ke studiu vlivu srážení CaCO3 a vyhodnocení různých faktorů, konkrétně koncentrace zdroje vápníku, doby vytvrzování, hodnoty bakteriální optické hustoty (OD), poměru zdroje vápníku k bakteriálnímu roztoku a pH během aerobní oxidace organické hmoty (tabulka 1). Rozsah pH pro optimalizovaný proces byl zvolen na základě růstových křivek Bacillus subtilis a Bacillus amyloliquefaciens za účelem dosažení rychlejšího růstu. Toto je podrobněji vysvětleno v části Výsledky.
Pro přípravu vzorků pro optimalizační fázi byly použity následující kroky. Roztok MICP byl nejprve připraven úpravou počátečního pH kultivačního média a poté autoklávován při 121 °C po dobu 15 minut. Kmen byl poté inokulován v laminárním proudění vzduchu a udržován v třepacím inkubátoru při 30 °C a 180 ot/min. Jakmile optická hustota (OD) bakterií dosáhla požadované úrovně, byl smíchán s roztokem zdroje vápníku v požadovaném poměru (obrázek 1a). Roztok MICP byl ponechán reagovat a ztuhnout v třepacím inkubátoru při 220 ot/min a 30 °C po dobu dosažení cílové hodnoty. Vysrážený CaCO3 byl oddělen po centrifugaci při 6000 g po dobu 5 minut a poté sušen při 40 °C, aby se vzorky připravily pro kalcimetrický test (obrázek 1b). Srážení CaCO3 bylo poté měřeno pomocí Bernardova kalcimetru, kde prášek CaCO3 reaguje s 1,0 N HCl (ASTM-D4373-02) za vzniku CO2 a objem tohoto plynu je měřítkem obsahu CaCO3 (obrázek 1c). Pro převod objemu CO2 na obsah CaCO3 byla vytvořena kalibrační křivka promytím čistého prášku CaCO3 1 N HCl a jeho vynesením do grafu proti uvolněnému CO2. Morfologie a čistota sráženého prášku CaCO3 byly zkoumány pomocí SEM zobrazování a XRD analýzy. Pro studium tvorby uhličitanu vápenatého kolem bakterií, fáze vzniklého uhličitanu vápenatého a aktivity bakterií byl použit optický mikroskop s 1000násobným zvětšením.
Dejeghská pánev je známá, silně erodovaná oblast v jihozápadní íránské provincii Fars a vědci z této oblasti shromáždili vzorky půdy erodované větrem. Vzorky byly pro studii odebrány z povrchu půdy. Indikátorové testy vzorků půdy ukázaly, že se jedná o špatně tříděnou písčitou půdu s bahnem a byla podle Jednotného systému klasifikace půd (USC) klasifikována jako SP-SM (obrázek 2a). XRD analýza ukázala, že půda Dejegh se skládala převážně z kalcitu a křemene (obrázek 2b). EDX analýza navíc ukázala, že v menších podílech byly přítomny i další prvky, jako je Al, K a Fe.
Pro přípravu laboratorních dun pro testování větrné eroze byla zemina drcena z výšky 170 mm pomocí trychtýře o průměru 10 mm na pevný povrch, čímž vznikla typická duna o výšce 60 mm a průměru 210 mm. V přírodě vznikají písečné duny s nejnižší hustotou eolickými procesy. Podobně vzorek připravený výše uvedeným postupem měl nejnižší relativní hustotu, γ = 14,14 kN/m³, a vytvořil tak pískový kužel usazený na vodorovném povrchu s úhlem náklonu přibližně 29,7°.
Optimální roztok MICP získaný v předchozí části byl nastříkán na svah duny v dávkách 1, 2 a 3 lm-2 a poté byly vzorky uloženy v inkubátoru při 30 °C (obr. 3) po dobu 9 dnů (tj. optimální doba vytvrzování) a následně odvezeny k testování v aerodynamickém tunelu.
Pro každé ošetření byly připraveny čtyři vzorky, jeden pro měření obsahu uhličitanu vápenatého a povrchové pevnosti pomocí penetrometru a zbývající tři vzorky byly použity pro erozi při třech různých rychlostech. V testech v aerodynamickém tunelu bylo množství eroze stanoveno při různých rychlostech větru a poté byla prahová rychlost odtržení pro každý ošetřený vzorek stanovena pomocí grafu množství eroze v závislosti na rychlosti větru. Kromě testů větrné eroze byly ošetřené vzorky podrobeny bombardování pískem (tj. skokovým experimentům). Pro tento účel byly připraveny další dva vzorky s aplikačními dávkami 2 a 3 L m−2. Test bombardování pískem trval 15 minut s tokem 120 gm−1, což je v rozsahu hodnot zvolených v předchozích studiích60,61,62. Horizontální vzdálenost mezi abrazivní tryskou a základnou duny byla 800 mm, umístěna 100 mm nad dnem tunelu. Tato poloha byla nastavena tak, aby téměř všechny skokové částice písku dopadaly na dunu.
Zkouška v aerodynamickém tunelu byla provedena v otevřeném aerodynamickém tunelu o délce 8 m, šířce 0,4 m a výšce 1 m (obrázek 4a). Aerodynamický tunel je vyroben z pozinkovaných ocelových plechů a dokáže generovat rychlost větru až 25 m/s. Kromě toho se používá frekvenční měnič k nastavení frekvence ventilátoru a postupnému zvyšování frekvence pro dosažení cílové rychlosti větru. Obrázek 4b znázorňuje schematický diagram písečných dun erodovaných větrem a profil rychlosti větru měřený v aerodynamickém tunelu.
Nakonec, pro porovnání výsledků neurealytické formulace MICP navržené v této studii s výsledky kontrolního testu MICP s urealytickou kyselinou byly připraveny také vzorky dun a ošetřeny biologickým roztokem obsahujícím močovinu, chlorid vápenatý a Sporosarcina pasteurii (protože Sporosarcina pasteurii má významnou schopnost produkovat ureázu63). Optická hustota bakteriálního roztoku byla 1,5 a koncentrace močoviny a chloridu vápenatého byly 1 M (zvoleny na základě hodnot doporučených v předchozích studiích36,64,65). Kultivační médium se skládalo z živného bujónu (8 g/l) a močoviny (20 g/l). Bakteriální roztok byl nastříkán na povrch duny a ponechán 24 hodin pro uchycení bakterií. Po 24 hodinách uchycení byl nastříkán cementovací roztok (chlorid vápenatý a močovina). Kontrolní test MICP s urealytickou kyselinou se dále označuje jako UMC. Obsah uhličitanu vápenatého ve vzorcích půdy upravených urealyticky a neuralyticky byl stanoven promytím podle postupu navrženého Choi et al.66
Obrázek 5 ukazuje růstové křivky Bacillus amyloliquefaciens a Bacillus subtilis v kultivačním médiu (živném roztoku) s počátečním rozsahem pH 5 až 10. Jak je znázorněno na obrázku, Bacillus amyloliquefaciens a Bacillus subtilis rostly rychleji při pH 6-8, respektive 7-9. Proto byl tento rozsah pH použit ve fázi optimalizace.
Růstové křivky (a) Bacillus amyloliquefaciens a (b) Bacillus subtilis při různých počátečních hodnotách pH živného média.
Obrázek 6 ukazuje množství oxidu uhličitého produkovaného v Bernardově vápenaté sondě, které představuje sražený uhličitan vápenatý (CaCO3). Protože v každé kombinaci byl jeden faktor fixní a ostatní faktory se měnily, každý bod na těchto grafech odpovídá maximálnímu objemu oxidu uhličitého v dané sadě experimentů. Jak je znázorněno na obrázku, s rostoucí koncentrací zdroje vápníku se zvyšovala produkce uhličitanu vápenatého. Koncentrace zdroje vápníku tedy přímo ovlivňuje produkci uhličitanu vápenatého. Vzhledem k tomu, že zdroj vápníku a zdroj uhlíku jsou stejné (tj. mravenčan vápenatý a octan vápenatý), čím více iontů vápníku se uvolňuje, tím více uhličitanu vápenatého se tvoří (obrázek 6a). V recepturách AS a AA se produkce uhličitanu vápenatého s prodlužující se dobou vytvrzování dále zvyšovala, dokud se množství sraženiny po 9 dnech téměř nezměnilo. V receptuře FA se rychlost tvorby uhličitanu vápenatého snížila, když doba vytvrzování překročila 6 dní. Ve srovnání s jinými recepturami vykazovala receptura FS relativně nízkou rychlost tvorby uhličitanu vápenatého po 3 dnech (obrázek 6b). U receptur FA a FS bylo po třech dnech dosaženo 70 % a 87 % celkové produkce uhličitanu vápenatého, zatímco u receptur AA a AS byl tento podíl pouze asi 46 %, respektive 45 %. To naznačuje, že receptura na bázi kyseliny mravenčí má v počáteční fázi vyšší rychlost tvorby CaCO3 ve srovnání s recepturou na bázi acetátu. Rychlost tvorby se však s rostoucí dobou vytvrzování zpomaluje. Z obrázku 6c lze usoudit, že ani při koncentracích bakterií nad OD1 nedochází k významnému přispění k tvorbě uhličitanu vápenatého.
Změna objemu CO2 (a odpovídajícího obsahu CaCO3) měřená Bernardovým kalcimetrem jako funkce (a) koncentrace zdroje vápníku, (b) doby tuhnutí, (c) optické hustoty (OD), (d) počátečního pH, (e) poměru zdroje vápníku k bakteriálnímu roztoku (pro každou formulaci); a (f) maximálního množství uhličitanu vápenatého vyrobeného pro každou kombinaci zdroje vápníku a bakterií.
Pokud jde o vliv počátečního pH média, obrázek 6d ukazuje, že u FA a FS dosáhla produkce CaCO3 maximální hodnoty při pH 7. Toto pozorování je v souladu s předchozími studiemi, které ukázaly, že enzymy FDH jsou nejstabilnější při pH 7–6,7. U AA a AS se však srážení CaCO3 zvýšilo, když pH překročilo 7. Předchozí studie také ukázaly, že optimální rozsah pH pro aktivitu enzymu CoA je od 8 do 9,2–6,8. Vzhledem k tomu, že optimální rozsahy pH pro aktivitu enzymu CoA a růst B. amyloliquefaciens jsou (8–9,2) a (6–8) (obrázek 5a), očekává se, že optimální pH formulace AA bude 8 a obě rozsahy pH se překrývají. Tato skutečnost byla potvrzena experimenty, jak je znázorněno na obrázku 6d. Vzhledem k tomu, že optimální pH pro růst B. subtilis je 7–9 (obrázek 5b) a optimální pH pro aktivitu enzymu CoA je 8–9,2, očekává se maximální výtěžek srážení CaCO3 v rozmezí pH 8–9, což potvrzuje obrázek 6d (tj. optimální pH srážení je 9). Výsledky uvedené na obrázku 6e naznačují, že optimální poměr roztoku zdroje vápníku k bakteriálnímu roztoku je 1 pro acetátový i mravenčanový roztok. Pro srovnání byl výkon různých formulací (tj. AA, AS, FA a FS) vyhodnocen na základě maximální produkce CaCO3 za různých podmínek (tj. koncentrace zdroje vápníku, doba vytvrzování, optická hustota (OD), poměr zdroje vápníku k bakteriálnímu roztoku a počáteční pH). Mezi studovanými formulacemi měla formulace FS nejvyšší produkci CaCO3, která byla přibližně třikrát vyšší než u formulace AA (obrázek 6f). Pro oba zdroje vápníku byly provedeny čtyři kontrolní experimenty bez bakterií a po 30 dnech nebyla pozorována žádná srážení CaCO3.
Snímky z optické mikroskopie všech formulací ukázaly, že vaterit byl hlavní fází, ve které se tvořil uhličitan vápenatý (obrázek 7). Krystaly vateritu měly kulovitý tvar69,70,71. Bylo zjištěno, že uhličitan vápenatý se na bakteriálních buňkách srážel, protože povrch bakteriálních buněk byl negativně nabitý a mohl působit jako adsorbent pro dvojmocné kationty. Vezměme-li v této studii jako příklad formulaci FS, po 24 hodinách se na některých bakteriálních buňkách začal tvořit uhličitan vápenatý (obrázek 7a) a po 48 hodinách se počet bakteriálních buněk potažených uhličitanem vápenatým výrazně zvýšil. Kromě toho, jak je znázorněno na obrázku 7b, bylo možné detekovat i částice vateritu. Nakonec, po 72 hodinách se zdálo, že velké množství bakterií je vázáno na krystaly vateritu a počet částic vateritu se výrazně zvýšil (obrázek 7c).
Pozorování srážení CaCO3 ve složení FS pomocí optické mikroskopie v čase: (a) 24, (b) 48 a (c) 72 hodin.
Pro další zkoumání morfologie precipitované fáze byly provedeny analýzy prášků pomocí rentgenové difrakce (XRD) a SEM. Spektra XRD (obr. 8a) a SEM mikrofotografie (obr. 8b, c) potvrdily přítomnost krystalů vateritu, jelikož měly hlávkový salátový tvar a byla pozorována shoda mezi píky vateritu a píky precipitátu.
(a) Porovnání rentgenových difrakčních spekter vzniklého CaCO3 a vateritu. SEM mikrofotografie vateritu při (b) zvětšení 1 kHz a (c) 5,27 kHz.
Výsledky testů v aerodynamickém tunelu jsou znázorněny na obrázku 9a, b. Z obrázku 9a je patrné, že prahová rychlost eroze (TDV) neošetřeného písku je přibližně 4,32 m/s. Při aplikačním množství 1 l/m² (obrázek 9a) jsou sklony čar rychlosti úbytku půdy pro frakce FA, FS, AA a UMC přibližně stejné jako u neošetřené duny. To naznačuje, že ošetření při tomto aplikačním množství je neúčinné a jakmile rychlost větru překročí TDV, tenká půdní kůra mizí a rychlost eroze duny je stejná jako u neošetřené duny. Sklon eroze frakce AS je také nižší než u ostatních frakcí s nižšími úsečkami (tj. TDV) (obrázek 9a). Šipky na obrázku 9b ukazují, že při maximální rychlosti větru 25 m/s nedošlo v ošetřených dunách k žádné erozi při aplikačních dávkách 2 a 3 l/m². Jinými slovy, u FS, FA, AS a UMC byly duny odolnější vůči větrné erozi způsobené ukládáním CaCO³ při aplikačních dávkách 2 a 3 l/m² než při maximální rychlosti větru (tj. 25 m/s). Hodnota TDV 25 m/s získaná v těchto testech je tedy spodní hranicí pro aplikační dávky uvedené na obrázku 9b, s výjimkou případu AA, kde je TDV téměř rovna maximální rychlosti v aerodynamickém tunelu.
Zkouška eroze větrem (a) Úbytek hmotnosti v závislosti na rychlosti větru (aplikační dávka 1 l/m2), (b) Prahová rychlost odtržení v závislosti na aplikační dávce a složení (CA pro octan vápenatý, CF pro mravenčan vápenatý).
Obrázek 10 ukazuje povrchovou erozi písečných dun ošetřených různými formulacemi a aplikačními dávkami po testu bombardování pískem a kvantitativní výsledky jsou uvedeny na obrázku 11. Neošetřený případ není zobrazen, protože nevykazoval žádnou odolnost a během testu bombardování pískem byl zcela erodován (celková ztráta hmotnosti). Z obrázku 11 je zřejmé, že vzorek ošetřený biokompozicí AA ztratil při aplikační dávce 2 l/m2 83,5 % své hmotnosti, zatímco všechny ostatní vzorky vykazovaly během procesu bombardování pískem erozi menší než 30 %. Když byla aplikační dávka zvýšena na 3 l/m2, všechny ošetřené vzorky ztratily méně než 25 % své hmotnosti. Při obou aplikačních dávkách vykazovala směs FS nejlepší odolnost vůči bombardování pískem. Maximální a minimální odolnost vůči bombardování u vzorků ošetřených FS a AA lze připsat jejich maximálnímu a minimálnímu srážení CaCO3 (obrázek 6f).
Výsledky bombardování písečných dun různého složení při průtocích 2 a 3 l/m2 (šipky označují směr větru, křížky označují směr větru kolmý k rovině výkresu).
Jak je znázorněno na obrázku 12, obsah uhličitanu vápenatého ve všech směsích se zvyšoval se zvyšující se aplikační dávkou z 1 l/m² na 3 l/m². Kromě toho měla při všech aplikačních dávkách směs s nejvyšším obsahem uhličitanu vápenatého směs FS, následovaná směsí FA a UMC. To naznačuje, že tyto směsi mohou mít vyšší povrchovou odolnost.
Obrázek 13a ukazuje změnu povrchového odporu neošetřených, kontrolních a ošetřených vzorků půdy měřenou permeametrem. Z tohoto obrázku je zřejmé, že povrchový odpor formulací UMC, AS, FA a FS se významně zvýšil se zvyšujícím se aplikačním množstvím. Zvýšení povrchové pevnosti však bylo u formulace AA relativně malé. Jak je znázorněno na obrázku, formulace FA a FS MICP nedegradovaného močovinou mají lepší povrchovou propustnost ve srovnání s MICP degradovaným močovinou. Obrázek 13b ukazuje změnu TDV s odporem povrchu půdy. Z tohoto obrázku je jasně patrné, že u dun s povrchovým odporem větším než 100 kPa bude prahová rychlost odlupování vyšší než 25 m/s. Vzhledem k tomu, že povrchový odpor in situ lze snadno měřit permeametrem, může tato znalost pomoci odhadnout TDV bez testování v aerodynamickém tunelu, a tím sloužit jako indikátor kontroly kvality pro terénní aplikace.
Výsledky SEM jsou znázorněny na obrázku 14. Obrázky 14a-b ukazují zvětšené částice neošetřeného vzorku půdy, což jasně ukazuje, že je soudržný a nemá žádné přirozené vazby ani cementaci. Obrázek 14c ukazuje SEM mikrofotografii kontrolního vzorku ošetřeného MICP degradovaným močovinou. Tento snímek ukazuje přítomnost sraženin CaCO3 jako polymorfů kalcitu. Jak je znázorněno na obrázcích 14d-o, sražený CaCO3 váže částice dohromady; na SEM mikrofotografiích lze také identifikovat sférické krystaly vateritu. Výsledky této studie a předchozích studií naznačují, že vazby CaCO3 vytvořené jako polymorfy vateritu mohou také poskytovat rozumnou mechanickou pevnost; naše výsledky ukazují, že povrchový odpor se zvyšuje na 350 kPa a prahová separační rychlost se zvyšuje z 4,32 na více než 25 m/s. Tento výsledek je v souladu s výsledky předchozích studií, které ukázaly, že matricí CaCO3 vysráženého MICP je vaterit, který má rozumnou mechanickou pevnost a odolnost vůči větrné erozi13,40 a dokáže si udržet rozumnou odolnost vůči větrné erozi i po 180 dnech vystavení polním podmínkám13.
(a, b) SEM mikrofotografie neošetřené půdy, (c) kontrola degradace močoviny MICP, (df) vzorky ošetřené AA, (gi) vzorky ošetřené AS, (jl) vzorky ošetřené FA a (mo) vzorky ošetřené FS při aplikační dávce 3 l/m2 při různých zvětšeních.
Obrázek 14d-f ukazuje, že po ošetření sloučeninami AA se na povrchu a mezi zrny písku vysrážel uhličitan vápenatý, přičemž byla pozorována i některá nepotažená zrna písku. U složek AS se sice množství vytvořeného CaCO3 významně nezvýšilo (obr. 6f), ale množství kontaktů mezi zrny písku způsobených CaCO3 se ve srovnání se sloučeninami AA významně zvýšilo (obr. 14g-i).
Z obrázků 14j-l a 14m-o je zřejmé, že použití mravenčanu vápenatého jako zdroje vápníku vede k dalšímu zvýšení srážení CaCO3 ve srovnání se sloučeninou AS, což je v souladu s měřeními vápníku na obrázku 6f. Zdá se, že tento dodatečný CaCO3 se usazuje hlavně na částicích písku a nemusí nutně zlepšovat kvalitu kontaktu. To potvrzuje dříve pozorované chování: navzdory rozdílům v množství srážení CaCO3 (obrázek 6f) se tři složení (AS, FA a FS) významně neliší, pokud jde o odolnost proti větru (obrázek 11) a povrchový odpor (obrázek 13a).
Pro lepší vizualizaci bakteriálních buněk potažených CaCO3 a bakteriálního otisku na vysrážených krystalech byly pořízeny SEM mikrofotografie s vysokým zvětšením a výsledky jsou uvedeny na obrázku 15. Jak je znázorněno, uhličitan vápenatý se vysráží na bakteriálních buňkách a poskytuje jádra potřebná pro vysrážení. Obrázek také znázorňuje aktivní a neaktivní vazby indukované CaCO3. Lze usoudit, že jakékoli zvýšení neaktivních vazeb nemusí nutně vést k dalšímu zlepšení mechanického chování. Zvýšení srážení CaCO3 proto nemusí nutně vést k vyšší mechanické pevnosti a důležitou roli hraje vzorec srážení. Tento bod byl také studován v pracích Terzise a Lalouiho72 a Soghiho a Al-Kabaniho45,73. Pro další zkoumání vztahu mezi vzorem srážení a mechanickou pevností se doporučují studie MICP s využitím µCT zobrazování, což přesahuje rámec této studie (tj. zavedení různých kombinací zdroje vápníku a bakterií pro MICP bez amoniaku).
CaCO3 indukoval aktivní a neaktivní vazby ve vzorcích ošetřených (a) složením AS a (b) složením FS a zanechal otisk bakteriálních buněk na sedimentu.
Jak je znázorněno na obrázcích 14j-o a 15b, je zde patrný film CaCO3 (podle EDX analýzy je procentuální složení každého prvku ve filmu uhlík 11 %, kyslík 46,62 % a vápník 42,39 %, což je velmi blízké procentuálnímu zastoupení CaCO3 na obrázku 16). Tento film pokrývá krystaly vateritu a půdní částice, čímž pomáhá udržovat integritu systému půda-sediment. Přítomnost tohoto filmu byla pozorována pouze u vzorků ošetřených přípravkem na bázi formiátu.
Tabulka 2 porovnává pevnost povrchu, prahovou rychlost odtržení a bioindukovaný obsah CaCO3 v půdách ošetřených dráhami MICP degradujícími a nedegradujícími močovinu v předchozích studiích a v této studii. Studie odolnosti vzorků dun ošetřených MICP vůči větrné erozi jsou omezené. Meng a kol. zkoumali odolnost vzorků dun degradujících močovinu ošetřených MICP vůči větrné erozi pomocí fukaru na listí,13 zatímco v této studii byly vzorky dun nedegradující močovinu (stejně jako kontrolní vzorky degradující močovinu) testovány v aerodynamickém tunelu a ošetřeny čtyřmi různými kombinacemi bakterií a látek.
Jak je vidět, některé předchozí studie uvažovaly vysoké aplikační dávky přesahující 4 l/m213,41,74. Stojí za zmínku, že vysoké aplikační dávky nemusí být z ekonomického hlediska snadno použitelné v terénu kvůli nákladům spojeným s dodávkou vody, dopravou a aplikací velkých objemů vody. Nižší aplikační dávky, jako například 1,62–2 l/m2, také dosáhly poměrně dobrých povrchových pevností až do 190 kPa a TDV přesahující 25 m/s. V této studii dosáhly duny ošetřené MICP na bázi mravenčanu bez degradace močoviny vysokých povrchových pevností, které byly srovnatelné s pevnostmi získanými cestou degradace močoviny ve stejném rozsahu aplikačních dávek (tj. vzorky ošetřené MICP na bázi mravenčanu bez degradace močoviny byly také schopny dosáhnout stejného rozsahu hodnot povrchové pevnosti, jak uvádějí Meng a kol., 13, obrázek 13a) při vyšších aplikačních dávkách. Je také patrné, že při aplikačním množství 2 l/m2 byl výtěžek uhličitanu vápenatého pro zmírnění větrné eroze při rychlosti větru 25 m/s 2,25 % u MICP na bázi mravenčanu bez degradace močoviny, což je velmi blízké požadovanému množství CaCO3 (tj. 2,41 %) ve srovnání s dunami ošetřenými kontrolním MICP s degradací močoviny při stejném aplikačním množství a stejné rychlosti větru (25 m/s).
Z této tabulky lze tedy vyvodit závěr, že jak cesta degradace močoviny, tak cesta degradace bez močoviny mohou poskytnout poměrně přijatelný výkon z hlediska povrchového odporu a TDV. Hlavní rozdíl spočívá v tom, že cesta degradace bez močoviny neobsahuje amoniak, a proto má menší dopad na životní prostředí. Kromě toho se zdá, že metoda MICP na bázi mravenčanu bez degradace močoviny navržená v této studii má lepší výsledky než metoda MICP na bázi acetátu bez degradace močoviny. Ačkoli Mohebbi a kol. studovali metodu MICP na bázi acetátu bez degradace močoviny, jejich studie zahrnovala vzorky na plochých površích9. Vzhledem k vyššímu stupni eroze způsobené tvorbou vírů kolem vzorků z dun a výsledným smykem, který má za následek nižší TDV, se očekává, že větrná eroze vzorků z dun bude zřetelnější než eroze plochých povrchů při stejné rychlosti.