Různé teorie obrany rostlin poskytují důležité teoretické vodítko pro vysvětlení vzorců specializovaného metabolismu rostlin, ale jejich klíčové predikce je stále třeba otestovat. V této studii jsme použili nestrannou tandemovou hmotnostní spektrometrii (MS/MS) k systematickému zkoumání metabolomu atenuovaných kmenů tabáku od jednotlivých rostlin po populace a blízce příbuzné druhy a zpracovali jsme velké množství teorií hmotnostní spektrometrie založených na složených spektrech v informacích. Rámec pro testování klíčových predikcí teorií optimální obrany (OD) a teorií pohyblivého cíle (MT). Informační složka metabolomiky rostlin je v souladu s teorií OD, ale je v rozporu s hlavní predikcí teorie MT o dynamice metabolomiky způsobené býložravci. Od mikro až po makro evoluční měřítko byl jasmonátový signál identifikován jako hlavní determinant OD, zatímco ethylenový signál poskytoval jemné doladění specifické odpovědi býložravce anotované molekulární sítí MS/MS.
Speciální metabolity s rozmanitými strukturami jsou hlavními účastníky adaptace rostlin na prostředí, zejména při obraně před nepřáteli (1). Úžasná diverzifikace speciálního metabolismu, který se nachází v rostlinách, stimulovala desetiletí hloubkového výzkumu jeho mnoha aspektů ekologických funkcí a vytvořila dlouhý seznam teorií obrany rostlin, které představují evoluční a ekologický vývoj interakcí mezi rostlinami a hmyzem. Empirický výzkum poskytuje důležité vodítko (2). Tyto teorie obrany rostlin však nesledovaly normativní cestu hypotetického deduktivního uvažování, v němž byly klíčové predikce na stejné úrovni analýzy (3) a byly experimentálně testovány, aby se posunul další cyklus teoretického vývoje (4). Technická omezení omezují sběr dat na specifické metabolické kategorie a vylučují komplexní analýzu specializovaných metabolitů, čímž brání mezikategorickému srovnání, které je nezbytné pro teoretický rozvoj (5). Nedostatek komplexních metabolomických dat a společné měny pro porovnání pracovního postupu zpracování metabolického prostoru mezi různými skupinami rostlin brání vědecké vyspělosti oboru.
Nejnovější vývoj v oblasti metabolomiky tandemové hmotnostní spektrometrie (MS/MS) dokáže komplexně charakterizovat metabolické změny v rámci druhů daného systémového kladu a mezi nimi a lze jej kombinovat s výpočetními metodami pro výpočet strukturní podobnosti mezi těmito komplexními směsmi. Předchozí znalosti chemie (5). Kombinace pokročilých technologií v analýze a výpočetní technice poskytuje nezbytný rámec pro dlouhodobé testování mnoha předpovědí učiněných ekologickými a evolučními teoriemi metabolické diverzity. Shannon (6) poprvé představil teorii informace ve svém zásadním článku v roce 1948 a položil tak základy pro matematickou analýzu informace, která byla použita v mnoha jiných oblastech než ve své původní aplikaci. V genomice byla teorie informace úspěšně aplikována ke kvantifikaci konzervativní informace o sekvencích (7). V transkriptomickém výzkumu analyzuje teorie informace celkové změny v transkriptomu (8). V předchozím výzkumu jsme aplikovali statistický rámec teorie informace na metabolomiku k popisu metabolické expertízy na úrovni tkání u rostlin (9). Zde kombinujeme pracovní postup založený na MS/MS se statistickým rámcem informační teorie, charakterizované metabolickou diverzitou ve společné měně, abychom porovnali klíčové predikce teorie obrany rostlin metabolomu indukovaného býložravci.
Teoretické rámce obrany rostlin jsou obvykle vzájemně inkluzivní a lze je rozdělit do dvou kategorií: ty, které se snaží vysvětlit distribuci metabolitů specifických pro rostliny na základě obranných funkcí, jako je optimální obrana (OD) (10), teorie pohyblivého cíle (MT) (11) a teorie vzhledu (12), zatímco jiné hledají mechanická vysvětlení toho, jak změny v dostupnosti zdrojů ovlivňují růst rostlin a akumulaci specializovaných metabolitů, jako je hypotéza uhlíku: živinové bilance (13), hypotéza rychlosti růstu (14) a hypotéza rovnováhy růstu a diferenciace (15). Tyto dvě sady teorií jsou na různých úrovních analýzy (4). Dvě teorie zahrnující obranné funkce na funkční úrovni však dominují diskusi o konstitutivní a indukovatelné obraně rostlin: teorie OD, která předpokládá, že rostliny investují do své drahé chemické obrany pouze tehdy, když je to potřeba, například když jsou pozřeny. Když napadne travní zvíře, je tedy podle možnosti budoucího útoku přiřazena sloučenina s obrannou funkcí (10); Hypotéza MT předpokládá, že neexistuje osa směrové změny metabolitů, ale metabolit se mění náhodně, což vytváří možnost bránit metabolickému „cíli pohybu“ útočících býložravců. Jinými slovy, tyto dvě teorie předpovídají metabolickou remodelaci, ke které dochází po útoku býložravců: vztah mezi jednosměrnou akumulací metabolitů s obrannou funkcí (OD) a neřízenými metabolickými změnami (MT) (11).
Hypotézy OD a MT zahrnují nejen indukované změny v metabolomu, ale také ekologické a evoluční důsledky akumulace těchto metabolitů, jako jsou adaptivní náklady a přínosy těchto metabolických změn ve specifickém ekologickém prostředí (16). Ačkoli obě hypotézy uznávají obrannou funkci specializovaných metabolitů, která může, ale nemusí být nákladná, klíčová predikce, která odlišuje hypotézy OD a MT, spočívá ve směrovosti indukovaných metabolických změn. Predikce teorie OD se dosud těšila největší experimentální pozornosti. Tyto testy zahrnují studium přímých nebo nepřímých obranných funkcí různých tkání specifických sloučenin ve sklenících a přírodních podmínkách, stejně jako změny ve stádiu vývoje rostlin (17-19). Vzhledem k nedostatku pracovního postupu a statistického rámce pro globální komplexní analýzu metabolické diverzity jakéhokoli organismu však dosud zbývá otestovat hlavní rozdílovou predikci mezi těmito dvěma teoriemi (tj. směr metabolických změn). Zde uvádíme takovou analýzu.
Jednou z nejvýznamnějších charakteristik rostlinně specifických metabolitů je jejich extrémní strukturní rozmanitost na všech úrovních, od jednotlivých rostlin, populací až po podobné druhy (20). Na úrovni populace lze pozorovat mnoho kvantitativních změn ve specializovaných metabolitech, zatímco na úrovni druhů se obvykle zachovávají silné kvalitativní rozdíly (20). Metabolická rozmanitost rostlin je proto hlavním aspektem funkční rozmanitosti, který odráží adaptabilitu na různé niky, zejména ty s různými možnostmi invaze specifického hmyzu a běžných býložravců (21). Od Fraenkelova (22) průlomového článku o důvodech existence rostlinně specifických metabolitů jsou interakce s různými druhy hmyzu považovány za důležité selekční tlaky a předpokládá se, že tyto interakce formovaly rostliny během evoluce. Metabolická dráha (23). Mezidruhové rozdíly v rozmanitosti specializovaných metabolitů mohou také odrážet fyziologickou rovnováhu spojenou s konstitutivní a indukovatelnou obranou rostlin proti býložravým strategiím, protože tyto dva druhy spolu často negativně korelují (24). Ačkoli může být prospěšné udržovat dobrou obranu za všech okolností, včasné metabolické změny spojené s obranou poskytují jasné výhody v tom, že rostlinám umožňují alokovat cenné zdroje na jiné fyziologické investice (19, 24) a vyhnout se nutnosti symbiózy. Vedlejší škody (25). Kromě toho mohou tyto reorganizace specializovaných metabolitů způsobené hmyzími býložravci vést k destruktivnímu rozšíření v populaci (26) a mohou odrážet přímé odečty podstatných přirozených změn v signálu kyseliny jasmonové (JA), který může být v populaci zachován. Vysoké a nízké signály JA jsou kompromisem mezi obranou proti býložravcům a konkurencí se specifickými druhy (27). Kromě toho specializované biosyntetické dráhy metabolitů během evoluce procházejí rychlou ztrátou a transformací, což vede k nerovnoměrnému metabolickému rozšíření mezi blízce příbuznými druhy (28). Tyto polymorfismy lze rychle vytvořit v reakci na měnící se vzorce býložravců (29), což znamená, že fluktuace společenstev býložravců je klíčovým faktorem ovlivňujícím metabolickou heterogenitu.
Zde jsme konkrétně řešili následující problémy. (I) Jak býložravý hmyz rekonfiguruje metabolom rostliny? (Ii) Jaké jsou hlavní informační složky metabolické plasticity, které lze kvantifikovat pro testování predikcí teorie dlouhodobé obrany? (Iii) Zda přeprogramovat metabolom rostliny způsobem jedinečným pro útočníka, pokud ano, jakou roli hraje rostlinný hormon při přizpůsobení specifické metabolické odpovědi a které metabolity přispívají k druhové specifičnosti obrany? (Iv) Vzhledem k tomu, že predikce mnoha obranných teorií lze rozšířit na všechny úrovně biologických tkání, ptali jsme se, jak konzistentní je způsobená metabolická odpověď od vnitřního srovnání až po mezidruhové srovnání? Za tímto účelem jsme systematicky studovali listový metabolom nikotinu v tabáku, což je ekologická modelová rostlina s bohatým specializovaným metabolismem, která je účinná proti larvám dvou původních býložravců, Lepidoptera Datura (Ms) (velmi agresivní, převážně konzumovaný). Na čeledi Solanaceae a Spodoptera littoralis (Sl) tvoří bavlníkové listy jakýsi „rod“ s hostitelskými rostlinami Solanaceae a dalšími hostiteli jiných rodů a čeledí. Rostlinná potrava. Analyzovali jsme MS/MS metabolomické spektrum a extrahovali statistické deskriptory informační teorie pro porovnání teorií OD a MT. Vytvořili jsme mapy specificity pro odhalení identity klíčových metabolitů. Analýza byla rozšířena na původní populaci N. nasi a blízce příbuzných druhů tabáku, abychom dále analyzovali kovarianci mezi signalizací rostlinných hormonů a indukcí OD.
Abychom získali celkovou mapu plasticity a struktury listového metabolomu býložravého tabáku, použili jsme dříve vyvinutý analytický a výpočetní postup pro komplexní sběr a dekonvoluci MS/MS spekter s vysokým rozlišením nezávislých na datech z rostlinných extraktů (9). Tato nediferencovaná metoda (nazývaná MS/MS) dokáže konstruovat neredundantní spektra sloučenin, která pak lze použít pro všechny zde popsané analýzy na úrovni sloučenin. Tyto dekonvoluované rostlinné metabolity jsou různých typů a sestávají ze stovek až tisíců metabolitů (zde asi 500-1000 s/MS/MS). Zde uvažujeme metabolickou plasticitu v rámci teorie informace a kvantifikujeme diverzitu a profesionalitu metabolomu na základě Shannonovy entropie metabolického frekvenčního rozdělení. Pomocí dříve implementovaného vzorce (8) jsme vypočítali sadu indikátorů, které lze použít ke kvantifikaci diverzity metabolomu (indikátor Hj), specializace metabolického profilu (indikátor δj) a metabolické specificity jediného metabolitu (indikátor Si). Dále jsme aplikovali index relativní plasticity vzdálenosti (RDPI) ke kvantifikaci indukovatelnosti metabolomu u býložravců (obrázek 1A) (30). V rámci tohoto statistického rámce považujeme spektrum MS/MS za základní informační jednotku a zpracováváme relativní početnost MS/MS do mapy distribuce frekvencí. Poté použijeme Shannonovu entropii k odhadu diverzity metabolomu z ní. Specializace metabolomu se měří průměrnou specificitou jednoho spektra MS/MS. Zvýšení početnosti některých tříd MS/MS po indukci u býložravců se proto transformuje na spektrální indukovatelnost, RDPI a specializaci, tj. zvýšení indexu δj, protože se produkuje specializovanější metabolity a produkuje se vysoký index Si. Snížení indexu diverzity Hj odráží, že buď se snižuje počet generovaných MS/MS, nebo se distribuce frekvencí profilu mění méně rovnoměrným směrem, přičemž se snižuje její celková nejistota. Výpočtem Si indexu je možné zvýraznit, které MS/MS jsou indukovány určitými býložravci, a naopak, které MS/MS na indukci nereagují, což je klíčový ukazatel pro rozlišení predikce MT a OD.
(A) Statistické deskriptory používané pro indukovatelnost dat (RDPI), diverzitu (index Hj), specializaci (index δj) a specificitu metabolitů (index Si) u býložravců (H1 až Hx). Zvýšení stupně specializace (δj) naznačuje, že v průměru bude produkováno více metabolitů specifických pro býložravce, zatímco snížení diverzity (Hj) naznačuje pokles produkce metabolitů nebo nerovnoměrné rozložení metabolitů v distribuční mapě. Hodnota Si hodnotí, zda je metabolit specifický pro daný stav (zde býložravce), nebo zda je naopak udržován na stejné úrovni. (B) Koncepční diagram predikce teorie obrany s využitím osy teorie informace. Teorie OD předpovídá, že útok býložravců zvýší počet obranných metabolitů, a tím zvýší δj. Současně se Hj snižuje, protože profil je reorganizován směrem ke snížené nejistotě metabolických informací. Teorie MT předpovídá, že útok býložravců způsobí nesměrové změny v metabolomu, a tím zvýší Hj jako indikátor zvýšené nejistoty metabolických informací a způsobí náhodné rozložení Si. Navrhli jsme také smíšený model, nejlepší MT, ve kterém některé metabolity s vyššími obrannými hodnotami budou obzvláště zvýšené (vysoká hodnota Si), zatímco jiné vykazují náhodné reakce (nižší hodnota Si).
Pomocí deskriptorů teorie informace interpretujeme teorii OD tak, že předpovídáme, že změny speciálních metabolitů vyvolané býložravci v neindukovaném konstitutivním stavu povedou k (i) zvýšení metabolické specificity (index Si) pohánějící metabonomickou specificitu (index δj) (zvýšení) určitých skupin speciálních metabolitů s vyšší obrannou hodnotou a (ii) snížení diverzity metabolomu (index Hj) v důsledku změny distribuce metabolické frekvence směrem k distribuci leptinových tělísek. Na úrovni jediného metabolitu se očekává uspořádaná distribuce Si, kde metabolit zvýší hodnotu Si podle své obranné hodnoty (obrázek 1B). V tomto duchu vysvětlujeme teorii MT, která předpovídá, že excitace povede k (i) nesměrovým změnám v metabolitech, což má za následek snížení indexu δj, a (ii) zvýšení indexu Hj v důsledku zvýšení metabolické nejistoty neboli náhodnosti, kterou lze kvantifikovat Shannonovou entropií ve formě zobecněné diverzity. Pokud jde o metabolické složení, teorie MT předpovídá náhodnou distribuci Si. Vzhledem k tomu, že některé metabolity jsou za specifických podmínek a za specifických podmínek a jiné podmínky za specifických podmínek nejsou a jejich obranná hodnota závisí na prostředí, navrhli jsme také model smíšené obrany, ve kterém jsou δj a Hj rozděleny do dvou směrů podél Si. S rostoucím množstvím Si ve všech směrech se zvýší pouze určité skupiny metabolitů, které mají vyšší obranné hodnoty, a to zejména u některých skupin metabolitů, zatímco jiné budou mít náhodné rozdělení (obrázek 1B).
Abychom otestovali predikci redefinované obranné teorie na ose deskriptoru informační teorie, získali jsme expertní (Ms) nebo generalistické (Sl) larvy býložravců na listech Nepenthes pallens (obrázek 2A). Pomocí MS/MS analýzy jsme získali 599 neredundantních MS/MS spekter (datový soubor S1) z methanolových extraktů listové tkáně odebrané po krmení housenek. Použití indexů RDPI, Hj a δj k vizualizaci rekonfigurace informačního obsahu v konfiguračních souborech MS/MS odhaluje zajímavé vzorce (obrázek 2B). Celkový trend je takový, že jak je popsáno v informačním deskriptoru, jak housenky pokračují v konzumaci listů, stupeň veškeré metabolické reorganizace se v průběhu času zvyšuje: 72 hodin poté, co býložravec konzumuje jídlo, se RDPI významně zvyšuje. Ve srovnání s nepoškozenou kontrolou byl Hj významně snížen, což bylo způsobeno zvýšeným stupněm specializace metabolického profilu, který byl kvantifikován indexem δj. Tento zjevný trend je v souladu s predikcemi teorie OD, ale je v rozporu s hlavními predikcemi teorie MT, která se domnívá, že náhodné (nesměrové) změny v hladinách metabolitů se používají jako obranná kamufláž (obrázek 1B). Ačkoli se obsah elicitorů orální sekrece (OS) a krmné chování těchto dvou býložravců liší, jejich přímé krmení vedlo k podobným změnám ve směrech Hj a δj během 24hodinového a 72hodinového období sklizně. Jediný rozdíl se objevil po 72 hodinách RDPI. Ve srovnání s metabolismem způsobeným krmením Ms byl celkový metabolismus indukovaný krmením Sl vyšší.
(A) Experimentální design: býložravci z řad prasat obecných (S1) nebo expertů (Ms) jsou krmeni odsolenými listy džbánků, zatímco pro simulovanou býložravost se k manipulaci s propíchnutím standardizovaných listových pozic používá OS Ms (W + OSMs). Larvy S1 (W + OSSl) nebo voda (W + W). Kontrola (C) je nepoškozený list. (B) Index indukovatelnosti (RDPI ve srovnání s kontrolní mapou), diverzity (Hj index) a specializace (δj index) vypočítaný pro mapu speciálních metabolitů (599 MS/MS; datový soubor S1). Hvězdičky označují významné rozdíly mezi přímým krmením býložravci a kontrolní skupinou (Studentův t-test s párovým t-testem, *P<0,05 a ***P<0,001). ns, není důležité. (C) Index časového rozlišení hlavního (modrý rámeček, aminokyselina, organická kyselina a cukr; datový soubor S2) a spektra speciálních metabolitů (červený rámeček 443 MS/MS; datový soubor S1) po simulovaném ošetření bylinožravci. Barevný proužek označuje 95% interval spolehlivosti. Hvězdička označuje statisticky významný rozdíl mezi ošetřenou a kontrolní skupinou [kvadratická analýza rozptylu (ANOVA), následovaná Tukeyho hodnotou statisticky významného rozdílu (HSD) pro post hoc vícenásobná srovnání, *P<0,05, **P<0,01 a *** P <0,001]. (D) Specializace bodových grafů a profilů speciálních metabolitů (opakované vzorky s různými ošetřeními).
Abychom zjistili, zda se remodelace vyvolaná býložravci na úrovni metabolomu odráží ve změnách hladiny jednotlivých metabolitů, zaměřili jsme se nejprve na metabolity dříve studované v listech rostliny Nepenthes pallens s prokázanou rezistencí vůči býložravcům. Fenolové amidy jsou konjugáty hydroxycinnamamid-polyamin, které se hromadí během býložravého procesu hmyzu a je známo, že snižují jeho výkonnost (32). Prohledali jsme prekurzory odpovídajících MS/MS a vynesli jsme jejich kumulativní kinetické křivky (obrázek S1). Není překvapením, že deriváty fenolu, které se přímo nepodílejí na obraně proti býložravcům, jako je kyselina chlorogenová (CGA) a rutin, jsou po býložravci downregulovány. Naproti tomu býložravci mohou vytvořit vysoce účinné fenolamidy. Neustálé krmení obou býložravců vedlo k téměř stejnému excitačnímu spektru fenolamidů a tento vzorec byl obzvláště zřejmý při de novo syntéze fenolamidů. Stejný jev bude pozorován při zkoumání dráhy 17-hydroxygeranylnonandiol diterpenových glykosidů (17-HGL-DTG), která produkuje velké množství acyklických diterpenů s účinnými anti-herbivorními funkcemi (33), z nichž krmení Ms pomocí Sl spustilo podobný expresní profil (obrázek S1).
Možnou nevýhodou experimentů s přímým krmením býložravci je rozdíl v rychlosti konzumace listů a době krmení býložravců, což ztěžuje eliminaci specifických účinků býložravců způsobených zraněními a býložravci. Abychom lépe vyřešili druhovou specifičnost indukované metabolické reakce listů u býložravců, simulovali jsme krmení larev Ms a Sl okamžitou aplikací čerstvě odebraného OS (OSM a OSS1) na standardní punkci W v konzistentních polohách listů. Tento postup se nazývá ošetření W + OS a standardizuje indukci přesným načasováním nástupu reakce vyvolané býložravcem, aniž by způsoboval matoucí účinky rozdílů v rychlosti nebo množství ztráty tkáně (obrázek 2A) (34). Pomocí MS/MS analýzy a výpočtového postupu jsme získali 443 MS/MS spekter (datový soubor S1), která se překrývala se spektry dříve sestavenými z experimentů s přímým krmením. Analýza informační teorie této MS/MS datové sady ukázala, že přeprogramování metabolomů specializovaných na listy simulací býložravců vykazovalo specifické indukce OS (obrázek 2C). Zejména ve srovnání s léčbou OSS1 způsobil OSM zvýšení specializace metabolomu po 4 hodinách. Za zmínku stojí, že ve srovnání s experimentálním souborem dat o přímém krmení býložravci se metabolická kinetika vizualizovaná ve dvourozměrném prostoru s použitím souřadnic Hj a δj a směrovost specializace metabolomu v reakci na simulovanou léčbu býložravcem v průběhu času konzistentně zvyšovaly (obrázek 2D). Zároveň jsme kvantifikovali obsah aminokyselin, organických kyselin a cukrů (datový soubor S2), abychom zjistili, zda je toto cílené zvýšení odbornosti metabolomu způsobeno rekonfigurací centrálního metabolismu uhlíku v reakci na simulované býložravce (obrázek S2). Pro lepší vysvětlení tohoto vzorce jsme dále sledovali kinetiku metabolické akumulace dříve diskutovaných drah fenolamidu a 17-HGL-DTG. Indukce býložravců specifická pro OS se transformuje do diferenciálního přesmykového vzorce v rámci metabolismu fenolamidu (obrázek S3). Fenolické amidy obsahující kumarinové a kofeoylové skupiny jsou přednostně indukovány proteinem OSS1, zatímco OSM spouští specifickou indukci ferulylových konjugátů. U signální dráhy 17-HGL-DTG byla detekována diferenciální indukce OS produkty malonylace a dimalonylace (obrázek S3).
Dále jsme studovali OS-indukovanou plasticitu transkriptomu s využitím datové sady microarray s časovým průběhem, která simuluje použití OSM k ošetření listů růžicových rostlin u býložravců. Kinetika vzorkování se v podstatě překrývá s kinetikou použitou v této metabolomické studii (35). Ve srovnání s rekonfigurací metabolomu, ve které je metabolická plasticita v průběhu času obzvláště zvýšená, pozorujeme přechodné transkripční vzplanutí v listech indukované Ms, kde indukovatelnost transkriptomu (RDPI) a specializace (δj) jsou na hodnotě 1. V tomto časovém bodě došlo k významnému zvýšení hodin a diverzity (Hj), exprese BMP1 byla významně snížena, následovaná relaxací specializace transkriptomu (obrázek S4). Rodiny metabolických genů (jako je P450, glykosyltransferáza a BAHD acyltransferáza) se podílejí na procesu sestavování speciálních metabolitů ze strukturních jednotek odvozených z primárního metabolismu, a to podle výše zmíněného raného modelu vysoké specializace. Jako případová studie byla analyzována fenylalaninová dráha. Analýza potvrdila, že klíčové geny v metabolismu fenolamidu jsou u býložravců ve srovnání s rostlinami, které nejsou indukovány, vysoce indukovány OS a jejich expresní vzorce jsou si úzce srovnatelné. Transkripční faktor MYB8 a strukturní geny PAL1, PAL2, C4H a 4CL v předřazeném řetězci této dráhy vykazovaly časnou iniciaci transkripce. Acyltransferázy, které hrají roli v konečném sestavení fenolamidu, jako jsou AT1, DH29 a CV86, vykazují prodloužený vzorec upregulace (obrázek S4). Výše ​​uvedená pozorování naznačují, že časná iniciace specializace transkriptomu a pozdější zesílení metabolomické specializace jsou spřažený režim, což může být způsobeno synchronním regulačním systémem, který iniciuje silnou obrannou reakci.
Rekonfigurace v signalizaci rostlinných hormonů funguje jako regulační vrstva, která integruje informace o býložravcích za účelem přeprogramování fyziologie rostlin. Po simulaci býložravců jsme změřili kumulativní dynamiku klíčových kategorií rostlinných hormonů a vizualizovali časovou koexpresi mezi nimi [Pearsonův korelační koeficient (PCC) > 0,4] (obrázek 3A). Jak se očekávalo, rostlinné hormony související s biosyntézou jsou propojeny v rámci sítě koexprese rostlinných hormonů. Kromě toho je do této sítě mapována metabolická specificita (Si index), aby se zvýraznily rostlinné hormony indukované různými ošetřeními. Jsou vyznačeny dvě hlavní oblasti specifické odpovědi býložravců: jedna je v klastru JA, kde JA (jeho biologicky aktivní forma JA-Ile) a další deriváty JA vykazují nejvyšší skóre Si; druhou je ethylen (ET). Giberelin vykazoval pouze mírné zvýšení specificity u býložravců, zatímco jiné rostlinné hormony, jako je cytokinin, auxin a kyselina abscisová, měly nízkou indukční specificitu pro býložravce. Ve srovnání s použitím samotného W + W lze amplifikaci vrcholové hodnoty derivátů JA aplikací OS (W + OS) v podstatě transformovat na silný specifický indikátor JA. Neočekávaně je známo, že OSM a OSS1 s různým obsahem elicitorů způsobují podobnou akumulaci JA a JA-Ile. Na rozdíl od OSS1 je OSM specificky a silně indukován OSM, zatímco OSS1 neamplifikuje reakci bazálních ran (obrázek 3B).
(A) Analýza koexpresní sítě založená na výpočtu PCC pro simulaci kinetiky akumulace rostlinných hormonů indukované býložravci. Uzel představuje jeden rostlinný hormon a velikost uzlu představuje index Si specifický pro rostlinný hormon mezi jednotlivými ošetřeními. (B) Akumulace JA, JA-Ile a ET v listech způsobená různými ošetřeními, které jsou indikovány různými barvami: meruňková, W + OSM; modrá, W + OSSl; černá, W + W; šedá, C (kontrola). Hvězdičky označují významné rozdíly mezi ošetřením a kontrolou (dvoucestná ANOVA následovaná Tukey HSD post hoc vícenásobným srovnáním, *** P <0,001). Analýza informační teorie (C)697 MS/MS (datový soubor S1) v biosyntéze JA a spektru zhoršené percepce (irAOC a irCOI1) a (D)585 MS/MS (datový soubor S1) v ETR1 se zhoršeným ET signálem. Dvě simulované ošetření býložravci spustily rostlinné linky a kontrolní rostliny s prázdným vehikulem (EV). Hvězdičky označují významné rozdíly mezi ošetřením W+OS a nepoškozenou kontrolou (dvoucestná ANOVA následovaná Tukey HSD post hoc vícenásobným srovnáním, *P<0,05, **P<0,01 a ***P<0,001). (E) Rozptýlené grafy rozptýlené opozice vůči specializaci. Barvy představují různé geneticky modifikované kmeny; symboly představují různé metody ošetření: trojúhelník, W + OSS1; obdélník, W + OSM; kruh C
Dále jsme použili geneticky modifikovaný kmen atenuovaných Nepenthes (irCOI1 a sETR1) v klíčových krocích biosyntézy JA a ET (irAOC a irACO) a vnímání (irCOI1 a sETR1) k analýze metabolismu těchto dvou rostlinných hormonů u býložravců. Relativní příspěvek reprogramování. V souladu s předchozími experimenty jsme potvrdili indukci býložravého OS u rostlin s prázdnými nosiči (EV) (obrázek 3, C až D) a celkový pokles indexu Hj způsobený OSM, zatímco index δj se zvýšil. Reakce je výraznější než reakce vyvolaná OSS1. Dvouřádkový graf s Hj a δj jako souřadnicemi ukazuje specifickou deregulaci (obrázek 3E). Nejzřetelnějším trendem je, že u kmenů bez JA signálu jsou změny diverzity a specializace metabolomu způsobené býložravci téměř zcela eliminovány (obrázek 3C). Naproti tomu tiché vnímání ET u rostlin sETR1, ačkoli celkový vliv na změny v metabolismu býložravců je mnohem nižší než vliv JA signalizace, zmírňuje rozdíl v indexech Hj a δj mezi excitacemi OSM a OSS1 (obrázek 3D a obrázek S5). To naznačuje, že kromě základní funkce transdukce JA signálu slouží transdukce ET signálu také k jemnému doladění druhově specifické metabolické odpovědi býložravců. V souladu s touto funkcí jemného doladění nedošlo u rostlin sETR1 k žádné změně v celkové indukovatelnosti metabolomu. Na druhou stranu, ve srovnání s rostlinami sETR1, rostliny irACO indukovaly podobné celkové amplitudy metabolických změn způsobených býložravci, ale vykazovaly významně odlišné skóre Hj a δj mezi expozicí OSM a OSS1 (obrázek S5).
Abychom identifikovali specializované metabolity, které mají důležitý podíl na druhově specifické reakci býložravců, a doladili jejich produkci prostřednictvím ET signálů, použili jsme dříve vyvinutou strukturní MS/MS metodu. Tato metoda se opírá o metodu bi-klastrování k opětovnému odvození metabolické rodiny z MS/MS fragmentů [normalizovaný skalární součin (NDP)] a skóre podobnosti na základě neutrální ztráty (NL). Datová sada MS/MS vytvořená analýzou ET transgenních linií produkovala 585 MS/MS (datový soubor S1), které byly rozděleny jejich shlukováním do sedmi hlavních MS/MS modulů (M) (obrázek 4A). Některé z těchto modulů jsou hustě zabaleny dříve charakterizovanými speciálními metabolity: například M1, M2, M3, M4 a M7 jsou bohaté na různé fenolové deriváty (M1), flavonoidní glykosidy (M2), acylové cukry (M3 a M4) a 17-HGL-DTG (M7). Kromě toho se vypočítá metabolicky specifická informace (Si index) jednoho metabolitu v každém modulu a jeho distribuce Si je možné intuitivně vidět. Stručně řečeno, MS/MS spektra vykazující vysokou herbivorní a genotypovou specificitu jsou charakterizována vysokými hodnotami Si a statistiky kurtosy naznačují distribuci srsti v pravém rohu ocasu. Jedna taková distribuce chudého koloidu byla detekována v M1, ve kterém fenolamid vykazoval nejvyšší podíl Si (obrázek 4B). Dříve zmíněný herbivorní indukovatelný 17-HGL-DTG v M7 vykazoval střední skóre Si, což naznačuje střední stupeň diferenciální regulace mezi oběma typy OS. Naproti tomu většina konstitutivně produkovaných specializovaných metabolitů, jako je rutin, CGA a acylové cukry, patří k nejnižším skóre Si. Aby bylo možné lépe prozkoumat strukturní složitost a distribuci Si mezi speciálními metabolity, byla pro každý modul vytvořena molekulární síť (obrázek 4B). Důležitou predikcí teorie OD (shrnutou na obrázku 1B) je, že reorganizace speciálních metabolitů po býložravosti by měla vést k jednosměrným změnám u metabolitů s vysokou obrannou hodnotou, zejména zvýšením jejich specificity (na rozdíl od náhodného rozdělení). Režim) Obranný metabolit předpovězený teorií MT. Většina fenolových derivátů akumulovaných v M1 funkčně souvisí s poklesem výkonnosti hmyzu (32). Při porovnání hodnot Si v metabolitech M1 mezi indukovanými listy a listy kontrolních rostlin EV po 24 hodinách jsme pozorovali, že metabolická specificita mnoha metabolitů po býložravém hmyzu má významný rostoucí trend (obrázek 4C). Specifické zvýšení hodnoty Si bylo detekováno pouze u obranných fenolamidů, ale u jiných fenolů a neznámých metabolitů, které v tomto modulu koexistují, nebylo detekováno žádné zvýšení hodnoty Si. Jedná se o specializovaný model, který souvisí s teorií OD. Hlavní predikce metabolických změn způsobených býložravci jsou konzistentní. Abychom otestovali, zda tato zvláštnost fenolamidového spektra byla indukována OS-specifickým ET, vynesli jsme index metabolitu Si a způsobili rozdílnou hodnotu exprese mezi OSM a OSS1 u genotypů EV a sETR1 (obrázek 4D). V sETR1 byl rozdíl mezi OSM a OSS1 indukovaný fenamidem výrazně snížen. Metoda bi-clusteringu byla také aplikována na data MS/MS shromážděná u kmenů s nedostatečným JA k odvození hlavních MS/MS modulů souvisejících s JA-regulovanou metabolickou specializací (obrázek S6).
(A) Výsledky shlukování 585 MS/MS na základě sdílených fragmentů (podobnost NDP) a sdílených ztrát neutrálních buněk (podobnost NL) vedou k tomu, že modul (M) je konzistentní se známou rodinou sloučenin nebo s neznámým či špatně metabolizovaným složením metabolitů. Vedle každého modulu je zobrazeno specifické (Si) rozdělení metabolitů (MS/MS). (B) Modulární molekulární síť: Uzly představují MS/MS a hrany, NDP (červeně) a NL (modře) skóre MS/MS (hraniční hodnota > 0,6). Stupňovitý index specificity metabolitů (Si) je zbarvený na základě modulu (vlevo) a namapovaný na molekulární síť (vpravo). (C) Modul M1 rostliny EV v konstitutivním (kontrola) a indukovaném stavu (simulovaný býložravec) po 24 hodinách: diagram molekulární sítě (hodnota Si je velikost uzlu, obranný fenolamid je zvýrazněn modře). (D) Diagram molekulární sítě M1 spektrální linie sETR1 se zhoršeným vnímáním EV a ET: fenolová sloučenina reprezentovaná zeleným kruhovým uzlem a významný rozdíl (hodnota P) mezi ošetřeními W + OSM a W + OSS1 jako velikost uzlu. CP, N-kafeoyl-tyrosin; CS, N-kafeoyl-spermidin; FP, ester N-ferulové kyseliny s kyselinou močovou; FS, N-ferulyl-spermidin; CoP, N', N “-kumarolyl-tyrosin; DCS, N', N”-dikafeoyl-spermidin; CFS, N', N”-kafeoyl, feruloyl-spermidin; Lycium barbarum v kustovnici čínské; Nick. O-AS, O-acylový cukr.
Analýzu jsme dále rozšířili z jediného atenuovaného genotypu Nepenthes na přirozené populace, kde byly dříve popsány silné vnitrodruhové změny v hladinách JA u býložravců a specifických metabolitů v přirozených populacích (26). Tuto datovou sadu použijte k pokrytí 43 zárodečných plazmat. Tyto zárodečné plazmaty se skládají ze 123 druhů rostlin z N. pallens. Tyto rostliny byly odebrány ze semen sebraných v různých původních stanovištích v Utahu, Nevadě, Arizoně a Kalifornii (obrázek S7), vypočítali jsme diverzitu metabolomu (zde nazývanou populační úroveň) (β diverzitu) a specializaci způsobenou OSM. V souladu s předchozími studiemi jsme pozorovali širokou škálu metabolických změn podél os Hj a δj, což naznačuje, že zárodečné plazmaty mají významné rozdíly v plasticitě svých metabolických reakcí na býložravce (obrázek S7). Tato organizace připomíná předchozí pozorování o dynamickém rozsahu změn JA způsobených býložravci a udržela si velmi vysokou hodnotu v jedné populaci (26, 36). Pomocí JA a JA-Ile k testování celkové korelace úrovní mezi Hj a δj jsme zjistili, že existuje významná pozitivní korelace mezi JA a indexem diverzity a specializace metabolomu β (obrázek S7). To naznačuje, že heterogenita v indukci JA indukovaná býložravci, detekovaná na úrovni populace, může být způsobena klíčovými metabolickými polymorfismy způsobenými selekcí z hmyzích býložravců.
Předchozí studie ukázaly, že se druhy tabáku značně liší typem a relativní závislostí na indukované a konstitutivní metabolické obraně. Předpokládá se, že tyto změny v přenosu signálu proti býložravcům a obranných schopnostech jsou regulovány populačním tlakem hmyzu, životním cyklem rostlin a náklady na produkci obrany ve niku, kde daný druh roste. Studovali jsme konzistenci remodelace metabolomu listů indukované býložravci šesti druhů Nicotiana pocházejících ze Severní a Jižní Ameriky. Tyto druhy jsou blízce příbuzné severoamerickým druhům Nepenthes, konkrétně Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. atenuated grass, Nicotiana tabacum, lineární tabák, tabák (Nicotiana spegazzinii) a tabák z tabákových listů (Nicotiana obtusifolia) (obrázek 5A) (37). Šest z těchto druhů, včetně dobře charakterizovaného druhu N. please, jsou jednoleté rostliny kladu petúnie a obtusifolia N. jsou trvalky sesterského kladu Trigonophyllae (38). Následně byla u těchto sedmi druhů provedena indukce W + W, W + OSM a W + OSS1 za účelem studia metabolické přeskupení hmyzí stravy na úrovni druhů.
(A) Bootstrapový fylogenetický strom založený na maximální věrohodnosti [pro syntézu jaderného glutaminu (38)] a geografickém rozšíření sedmi blízce příbuzných druhů Nicotiana (různé barvy) (37). (B) Bodový graf specializované diverzity pro metabolické profily sedmi druhů Nicotiana (939 MS/MS; datový soubor S1). Na úrovni druhů je diverzita metabolomu negativně korelována se stupněm specializace. Analýza korelace na úrovni druhů mezi metabolickou diverzitou a specializací a akumulací JA je znázorněna na obrázku 2. S9. Barva, různé typy; trojúhelník, W + OSS1; obdélník, W + OSM; (C) Dynamika JA a JA-Ile u Nicotiana je seřazena podle amplitudy excitace OS (dvoucestná ANOVA a Tukey HSD po vícenásobném srovnání, * P <0,05, ** P <0,01 a * ** Pro srovnání W + OS a W + W, P <0,001). Krabicový graf (D) diverzity a (E) specializace každého druhu po simulaci býložravé a methyl JA (MeJA). Hvězdička označuje statisticky významný rozdíl mezi W + OS a W + W nebo lanolinem plus W (Lan + W) nebo Lan plus MeJA (Lan + MeJa) a kontrolou Lan (dvoucestná analýza rozptylu, následovaná Tukeyho HSD post hoc vícenásobným srovnáním, *P<0,05, **P<0,01 a ***P<0,001).
Pomocí metody duálních shluků jsme identifikovali 9 modulů s 939 MS/MS (datový soubor S1). Složení MS/MS rekonfigurovaných různými způsoby se mezi různými moduly a druhy značně liší (obrázek S8). Vizualizace Hj (zde označované jako druhová γ-diverzita) a δj ukazuje, že různé druhy se v metabolickém prostoru agregují do velmi odlišných skupin, kde je druhové dělení obvykle výraznější než excitace. S výjimkou N. linear a N. obliquus vykazují široký dynamický rozsah indukčních účinků (obrázek 5B). Naproti tomu druhy jako N. purpurea a N. obtusifolia mají méně zřetelnou metabolickou odpověď na léčbu, ale metabolom je rozmanitější. Druhově specifická distribuce indukované metabolické odpovědi vedla k významné negativní korelaci mezi specializací a gama diverzitou (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Změny hladin JAs vyvolané OS pozitivně korelují se specializací metabolomu a negativně korelují s metabolickou gama diverzitou, kterou každý druh vykazuje (obrázek 5B a obrázek S9). Za zmínku stojí, že druhy hovorově označované jako druhy „reagující na signál“ na obrázku 5C, jako například hlístice Nepenthes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute a Nepenthes attenated, způsobily významné příznaky po 30 minutách. Nedávná ohniska JA a JA-Ile specifická pro OS, zatímco jiné bakterie nazývané „nereagující na signál“, jako například Nepenthes mills, Nepenthes powdery a N. obtusifolia, vykazují pouze indukci JA-Ile Edge bez jakékoli specificity pro OS (obrázek 5C). Na metabolické úrovni, jak je uvedeno výše, u atenuovaných Nepenthes vykazovaly látky reagující na signál specificitu pro OS a významně zvýšily δj, zatímco snížily Hj. Tento primingový efekt specifický pro OS nebyl detekován u druhů klasifikovaných jako druhy nereagující na signál (obrázek 5, D a E). Metabolity specifické pro OS jsou častěji sdíleny mezi druhy reagujícími na signál a tyto signální shluky se shlukují s druhy se slabšími signálními odpověďmi, zatímco druhy se slabšími signálními odpověďmi vykazují menší vzájemnou závislost (obrázek S8). Tento výsledek naznačuje, že indukce JA specifická pro OS a rekonfigurace downstream metabolomu specifická pro OS jsou na druhové úrovni propojeny.
Dále jsme k ošetření rostlin použili lanolinovou pastu obsahující methylJA (MeJA), abychom zjistili, zda jsou tyto vazebné režimy omezeny dostupností JA aplikovaného exogenním JA, který bude v cytoplazmě rostlin. Rychlá deesterifikace je JA. Zjistili jsme stejný trend postupné změny od druhů reagujících na signál k druhům nereagujícím na signál, což je způsobeno nepřetržitým přísunem JA (obrázek 5, D a E). Stručně řečeno, ošetření MeJA silně přeprogramovalo metabolomy lineárních hlístic, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens a N. mikimotoi, což vedlo k významnému zvýšení δj a snížení Hj. Pouze N. purpurea vykázala zvýšení δj, ale nikoli Hj. N. obtusifolia, u kterého bylo dříve prokázáno, že akumuluje extrémně nízké hladiny JA, také špatně reaguje na ošetření MeJA, pokud jde o rekonfiguraci metabolomu. Tyto výsledky naznačují, že produkce JA nebo signální transdukce je fyziologicky omezena u druhů nereagujících na signál. Abychom tuto hypotézu ověřili, studovali jsme čtyři druhy (N. pallens, N. mills, N. pink a N. microphylla) indukované transkriptomy W + W, W + OSM a W + OSS1 (39). V souladu se vzorem remodelace metabolomu jsou druhy v transkriptomovém prostoru dobře odděleny, přičemž N. attenated vykazoval nejvyšší RDPI indukovaný OS, zatímco N. gracilis měl nejnižší (obrázek 6A). Bylo však zjištěno, že diverzita transkriptomu indukovaná N. oblonga byla nejnižší ze čtyř druhů, na rozdíl od nejvyšší metabonomické diverzity N. oblonga, která byla dříve prokázána u sedmi druhů. Předchozí studie ukázaly, že soubor genů souvisejících s časnými obrannými signály, včetně JA signálů, vysvětluje specifičnost časných obranných reakcí indukovaných elicitory souvisejícími s býložravci u druhů Nicotiana (39). Porovnání JA signálních drah mezi těmito čtyřmi druhy odhalilo zajímavý vzorec (obrázek 6B). Většina genů v této signální dráze, jako například AOC, OPR3, ACX a COI1, vykazovala u těchto čtyř druhů relativně vysoké úrovně indukce. Klíčový gen JAR4 však přeměňuje JA na jeho biologicky aktivní formu akumulovaných transkriptů JA-Ile a jeho úroveň transkripce je velmi nízká, zejména u N. mills, Nepenthes pieris a N. microphylla. Kromě toho nebyl u N. bifidum detekován pouze transkript jiného genu AOS. Tyto změny v genové expresi mohou být zodpovědné za extrémní fenotypy vyvolané nízkou produkcí JA u signálně anergních druhů a indukcí u N. gracilis.
(A) Analýza informační teorie reprogramování časných transkripčních odpovědí čtyř blízce příbuzných druhů tabáku odebraných 30 minut po indukci herbivorní kulturou. RDPI se vypočítá porovnáním listů indukovaných OS u herbivorů s kontrolní skupinou s ranou. Barvy označují různé druhy a symboly označují různé metody ošetření. (B) Analýza genové exprese v signálních drahách JA u čtyř druhů. Zjednodušená dráha JA je zobrazena vedle krabicového grafu. Různé barvy označují různé metody zpracování. Hvězdička označuje významný rozdíl mezi ošetřením W + OS a kontrolou W + W (pro Studentův t-test pro párové rozdíly, *P<0,05, **P<0,01 a ***P<0,001). OPDA, kyselina 12-oxofytodienová; OPC-8: kyselina 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenyl)-cyklopentan-1-oktanová.
V poslední části jsme studovali, jak může být druhově specifická remodelace metabolomu různých rostlinných druhů u hmyzu rezistentní vůči býložravcům. Předchozí výzkum se zaměřil na rod Nicotiana. Jejich rezistence vůči Ms a larvám se značně liší (40). Zde jsme studovali souvislost mezi tímto modelem a jejich metabolickou plasticitou. Pomocí výše uvedených čtyř druhů tabáku a testováním korelace mezi diverzitou a specializací metabolomu způsobenou býložravci a rezistencí rostlin vůči Ms a Sl jsme zjistili, že rezistence, diverzita a specializace vůči generalistickému Sl pozitivně korelují, zatímco korelace mezi rezistencí vůči expertním druhům a specializací je slabá a korelace s diverzitou není významná (obrázek S10). Pokud jde o rezistenci vůči S1, atenuovaný N. chinensis i N. gracilis, u kterých bylo dříve prokázáno, že vykazují jak hladiny JA signální transdukce, tak plasticitu metabolomu, měly značně odlišné reakce na indukci býložravci a také vykazovaly podobně vysokou rezistenci. Pohlaví.
V posledních šedesáti letech poskytla teorie obrany rostlin teoretický rámec, na jehož základě vědci předpověděli značný počet vývojových a funkčních jevů specializovaných metabolitů rostlin. Většina těchto teorií se nedodržuje běžný postup silných inferencí (41). Navrhují klíčové predikce (3) na stejné úrovni analýzy. Když testování klíčových predikcí umožní analýzu specifických teorií, bude to znamenat, že pole se posouvá vpřed. Může být podpořeno, ale jiné odmítnuto (42). Nová teorie místo toho vytváří predikce na různých úrovních analýzy a přidává novou vrstvu popisných úvah (42). Dvě teorie navržené na funkční úrovni, MT a OD, však lze snadno vysvětlit jako důležité predikce specializovaných metabolických změn způsobených býložravci: Teorie OD se domnívá, že změny ve specializovaném metabolickém „prostoru“ jsou vysoce směrové. Teorie MT se domnívá, že tyto změny budou nesměrové a náhodně umístěné v metabolickém prostoru a mívají tendenci mít metabolity s vysokou obrannou hodnotou. Předchozí zkoumání predikcí OD a MT byla testována s použitím úzkého souboru apriorních „obranných“ sloučenin. Tyto testy zaměřené na metabolity vylučují schopnost analyzovat rozsah a trajektorii rekonfigurace metabolomu během herbivorie a neumožňují testování v konzistentním statistickém rámci, které by vyžadovalo klíčové predikce, jež lze považovat za celek. Kvantifikace změn v metabolomu rostlin. Zde jsme použili inovativní technologii v metabolomice založenou na výpočetní MS a provedli dekonvoluční MS analýzu v obecné měnové relaci deskriptorů informační teorie k otestování rozdílu mezi těmito dvěma teoriemi navrženými na globální metabolomické úrovni. Klíčová predikce této teorie. Informační teorie byla aplikována v mnoha oblastech, zejména v kontextu výzkumu biodiverzity a toku živin (43). Pokud je nám však známo, jedná se o první aplikaci použitou k popisu metabolického informačního prostoru rostlin a k řešení ekologických problémů souvisejících s dočasnými metabolickými změnami v reakci na podněty z prostředí. Schopnost této metody spočívá zejména v její schopnosti porovnávat vzorce v rámci rostlinných druhů a mezi nimi a zkoumat, jak se býložravci vyvinuli z různých druhů do mezidruhových makroevolučních vzorců na různých úrovních evoluce. Metabolismus.
Analýza hlavních komponent (PCA) převádí vícerozměrný datový soubor do prostoru redukce dimenzionality, aby bylo možné vysvětlit hlavní trend dat, proto se obvykle používá jako explorativní technika k analýze datového souboru, jako je dekonvoluční metabolom. Redukce dimenzionality však ztratí část informačního obsahu v datovém souboru a PCA nemůže poskytnout kvantitativní informace o charakteristikách, které jsou obzvláště relevantní pro ekologickou teorii, jako například: jak býložravci rekonfigurují diverzitu ve specializovaných oblastech (například bohatost, distribuce) a hojnost) metabolity? Které metabolity jsou prediktory indukovaného stavu daného býložravce? Z hlediska specifičnosti, diverzity a inducibility je informační obsah profilu metabolitů specifických pro listy rozložen a je zjištěno, že konzumace býložravců může aktivovat specifický metabolismus. Neočekávaně jsme pozorovali, že jak je popsáno v implementovaných indikátorech informační teorie, výsledná metabolická situace se po útocích dvou býložravců (nočně krmeného generalisty Sl) a experta na lilkovité Ms. Do značné míry překrývá. Iniciátor konjugátu mastných kyselin a aminokyselin (FAC) v OS (31). Použitím býložravého OS k léčbě standardizovaných bodných ran vykazovala simulovaná léčba býložravci podobný trend. Tento standardizovaný postup pro simulaci reakce rostlin na útoky býložravců eliminuje matoucí faktory způsobené změnami v stravovacím chování býložravců, které vedou k různým stupňům poškození v různých časech (34). FAC, o kterém je známo, že je hlavní příčinou OSM, snižuje reakce JAS a dalších rostlinných hormonů v OSS1, zatímco OSS1 snižuje stokrát (31). OSS1 však způsobil podobné úrovně akumulace JA ve srovnání s OSM. Dříve bylo prokázáno, že reakce JA u atenuovaných Nepenthes je velmi citlivá na OSM, kde FAC si může udržet svou aktivitu i při zředění vodou v poměru 1:1000 (44). Proto je ve srovnání s OSM, ačkoli je FAC v OSS1 velmi nízký, dostatečný k vyvolání dostatečného propuknutí JA. Předchozí studie ukázaly, že proteiny podobné porinům (45) a oligosacharidy (46) mohou být použity jako molekulární vodítka pro spuštění obranných reakcí rostlin v OSS1. Stále však není jasné, zda jsou tyto elicitory v OSS1 zodpovědné za akumulaci JA pozorovanou v současné studii.
Ačkoli existuje jen málo studií popisujících rozdílné metabolické otisky prstů způsobené aplikací různých býložravců nebo exogenní JA či SA (kyselina salicylová) (47), nikdo nenarušil druhově specifickou poruchu v rostlinné travní síti býložravců a její vliv na specifické osobní informace. Celkový dopad metabolismu je systematicky studován. Tato analýza dále potvrdila, že propojení vnitřní hormonální sítě s jinými rostlinnými hormony než JA formuje specifičnost metabolické reorganizace způsobené býložravci. Zejména jsme zjistili, že ET způsobený OSM byl významně větší než způsobený OSS1. Tento režim je v souladu s vyšším obsahem FAC v OSM, což je nezbytná a postačující podmínka pro spuštění ET vzplanutí (48). V kontextu interakce mezi rostlinami a býložravci je signální funkce ET na dynamiku metabolitů specifických pro rostliny stále sporadická a cílí pouze na jednu skupinu sloučenin. Kromě toho většina studií použila exogenní aplikaci ET nebo jeho prekurzorů či různých inhibitorů ke studiu regulace ET, z nichž tyto exogenní chemické aplikace budou mít mnoho nespecifických vedlejších účinků. Podle našich znalostí představuje tato studie první rozsáhlé systematické zkoumání role ET ve využití ET k produkci a vnímání poškozených transgenních rostlin za účelem koordinace dynamiky metabolomu rostlin. Indukce ET specifická pro býložravce může v konečném důsledku modulovat metabolomovou odpověď. Nejvýznamnější je transgenní manipulace genů biosyntézy (ACO) a vnímání (ETR1) ET, která odhalila specifickou de novo akumulaci fenolamidů pro býložravce. Dříve bylo prokázáno, že ET může jemně doladit akumulaci nikotinu indukovanou JA regulací putrescin-N-methyltransferázy (49). Z mechanického hlediska však není jasné, jak ET jemně dolaďuje indukci fenamidu. Kromě signální transdukční funkce ET může být metabolický tok také přesměrován na S-adenosyl-1-methionin za účelem regulace investice do polyaminofenolamidů. S-adenosyl-1-methionin je ET a běžný meziprodukt biosyntetické dráhy polyaminu. Mechanismus, kterým signál ET reguluje hladinu fenolamidu, vyžaduje další studium.
Po dlouhou dobu, vzhledem k velkému počtu speciálních metabolitů s neznámou strukturou, nebyla intenzivní pozornost věnovaná specifickým metabolickým kategoriím schopna striktně posoudit časové změny metabolické diverzity po biologických interakcích. V současné době je na základě analýzy teorie informace hlavním výsledkem MS/MS spektrální akvizice založené na nezkreslených metabolitech to, že býložravci, kteří jedí nebo simulují býložravce, nadále snižují celkovou metabolickou diverzitu listového metabolomu a zároveň zvyšují stupeň jeho specializace. Toto dočasné zvýšení specificity metabolomu způsobené býložravci je spojeno se synergickým zvýšením specificity transkriptomu. Vlastností, která nejvíce přispívá k této větší specializaci metabolomu (s vyšší hodnotou Si), je speciální metabolit s dříve charakterizovanou býložravou funkcí. Tento model je v souladu s predikcí teorie OD, ale predikce MT související s náhodností přeprogramování metabolomu není konzistentní. Tato data jsou však také v souladu s predikcí smíšeného modelu (nejlepší MT; obrázek 1B), protože jiné necharakterizované metabolity s neznámými obrannými funkcemi mohou stále sledovat náhodné rozložení Si.
Pozoruhodný vzorec, který tento výzkum dále zachytil, je, že od úrovně mikroevoluce (jedna rostlina a populace tabáku) až po větší evoluční měřítko (blízce příbuzné druhy tabáku) jsou různé úrovně evoluční organizace v „nejlepší obraně“. Existují významné rozdíly ve schopnostech býložravců. Moore a kol. (20) a Kessler a Kalske (1) nezávisle na sobě navrhli převést tři funkční úrovně biodiverzity, které původně rozlišil Whittaker (50), na konstitutivní a indukované časové změny chemické diverzity; ani tito autoři neshrnuli postupy pro sběr dat metabolomu ve velkém měřítku. Postupy pro sběr dat metabolomu ve velkém měřítku také nenastiňují, jak z těchto dat vypočítat metabolickou diverzitu. V této studii budou drobné úpravy Whittakerovy funkční klasifikace zohledňovat α-metabolickou diverzitu jako diverzitu MS/MS spekter v dané rostlině a β-metabolickou diverzitu jako základní vnitrodruhový metabolismus skupiny populací a γ-metabolická diverzita bude rozšířením analýzy podobných druhů.
Signál JA je nezbytný pro širokou škálu metabolických reakcí býložravců. Chybí však rigorózní kvantitativní testování příspěvku intraspecifické regulace biosyntézy JA k diverzitě metabolomu a to, zda je signál JA obecným místem pro stresem indukovanou metabolickou diverzifikaci na vyšším makroevolučním měřítku, je stále nejasné. Pozorovali jsme, že býložravá povaha býložravého druhu Nepenthes indukuje specializaci metabolomu a že variace specializace metabolomu v rámci populace druhů Nicotiana a mezi blízce příbuznými druhy Nicotiana systematicky pozitivně korelují se signalizací JA. Kromě toho, když je signál JA narušen, metabolická specificita indukovaná býložravcem jednoho genotypu se zruší (obrázek 3, C a E). Vzhledem k tomu, že změny metabolického spektra přirozeně atenuovaných populací Nepenthes jsou většinou kvantitativní, změny v metabolické β diverzitě a specificitě v této analýze mohou být do značné míry způsobeny silnou excitací kategorií sloučenin bohatých na metabolity. Tyto třídy sloučenin dominují části profilu metabolomu a vedou k pozitivní korelaci se signály JA.
Protože biochemické mechanismy druhů tabáku, které jsou s ním blízce příbuzné, jsou velmi odlišné, metabolity jsou specificky identifikovány v kvalitativním aspektu, takže je to analytičtější. Zpracování zachyceného metabolického profilu informační teorií odhaluje, že indukce u býložravců zhoršuje kompromis mezi metabolickou gama diverzitou a specializací. Signál JA hraje v tomto kompromisu ústřední roli. Zvýšení specializace metabolomu je v souladu s hlavní predikcí OD a pozitivně koreluje se signálem JA, zatímco signál JA negativně koreluje s metabolickou gama diverzitou. Tyto modely naznačují, že kapacita OD rostlin je určena hlavně plasticitou JA, ať už v mikroevolučním měřítku nebo ve větším evolučním měřítku. Experimenty s aplikací exogenní JA, které obcházejí defekty biosyntézy JA, dále ukazují, že blízce příbuzné druhy tabáku lze rozlišit na druhy reagující na signál a druhy nereagující na signál, stejně jako jejich způsob JA a plasticita metabolomu indukovaná býložravci. Druhy nereagující na signál nemohou reagovat kvůli své neschopnosti produkovat endogenní JA, a proto podléhají fyziologickým omezením. To může být způsobeno mutacemi v některých klíčových genech v signální dráze JA (AOS a JAR4 u N. crescens). Tento výsledek zdůrazňuje, že tyto mezidruhové makroevoluční vzorce mohou být řízeny především změnami ve vnímání a reaktivitě vnitřních hormonů.
Kromě interakce mezi rostlinami a býložravci je zkoumání metabolické diverzity spojeno se všemi důležitými teoretickými pokroky ve výzkumu biologické adaptace na prostředí a evoluce komplexních fenotypových znaků. S nárůstem množství dat získaných moderními MS přístroji může testování hypotéz o metabolické diverzitě nyní překonat individuální/kategoriální rozdíly v metabolitech a provést globální analýzu, která odhalí neočekávané vzorce. V procesu rozsáhlé analýzy je důležitou metaforou myšlenka vytvoření smysluplných map, které lze použít k prozkoumání dat. Důležitým výsledkem současné kombinace nezaujaté MS/MS metabolomiky a teorie informace je proto to, že poskytuje jednoduchou metriku, kterou lze použít k vytvoření map pro procházení metabolické diverzity v různých taxonomických měřítkách. To je základní požadavek této metody. Studium mikro/makro evoluce a ekologie společenstev.
Na makroevoluční úrovni je jádrem teorie koevoluce rostlin a hmyzu Ehrlicha a Ravena (51) předpověď, že variabilita mezidruhové metabolické diverzity je příčinou diverzifikace rostlinných linií. V padesáti letech od publikace této zásadní práce však byla tato hypotéza jen zřídka testována (52). To je z velké části způsobeno fylogenetickými charakteristikami srovnatelných metabolických charakteristik napříč dlouhodobými rostlinnými liniemi. Tato vzácnost může být použita k ukotvení metod cílové analýzy. Současný pracovní postup MS/MS zpracovaný informační teorií kvantifikuje strukturní podobnost neznámých metabolitů MS/MS (bez předchozího výběru metabolitů) a převádí tyto MS/MS do sady MS/MS, takže v profesionálním metabolismu jsou tyto makroevoluční modely porovnávány v klasifikační škále. Jednoduché statistické ukazatele. Proces je podobný fylogenetické analýze, která může použít zarovnání sekvencí ke kvantifikaci míry diverzifikace nebo evoluce znaků bez předchozí predikce.
Na biochemické úrovni ukazuje screeningová hypotéza Firna a Jonese (53), že metabolická diverzita je udržována na různých úrovních, aby poskytovala suroviny pro vyvíjení biologických aktivit dříve nesouvisejících nebo substituovaných metabolitů. Metody informační teorie poskytují rámec, ve kterém lze tyto metabolitově specifické evoluční přechody, ke kterým dochází během specializace metabolitů, kvantifikovat jako součást navrhovaného evolučního screeningového procesu: biologicky aktivní adaptace z nízké specificity na vysokou specificitu. Inhibované metabolity daného prostředí.
Celkově vzato, v raných dobách molekulární biologie byly vyvinuty důležité teorie obranyschopnosti rostlin a deduktivní metody založené na hypotézách jsou všeobecně považovány za jediný prostředek vědeckého pokroku. To je do značné míry způsobeno technickými omezeními měření celého metabolomu. Ačkoli jsou metody založené na hypotézách obzvláště užitečné při výběru jiných kauzálních mechanismů, jejich schopnost prohloubit naše chápání biochemických sítí je omezenější než výpočetní metody, které jsou v současné době k dispozici v datově náročné vědě. Teorie, které nelze předvídat, proto daleko přesahují rozsah dostupných dat, takže hypotetický vzorec/testovací cyklus pokroku ve výzkumné oblasti nelze zrušit (4). Předpokládáme, že výpočetní pracovní postup metabolomiky zde představený může znovu vzbudit zájem o nedávné (jak) a konečné (proč) otázky metabolické diverzity a přispět k nové éře teoreticky řízené datové vědy. Tato éra znovu prozkoumala důležité teorie, které inspirovaly předchozí generace.
Přímé krmení býložravců se provádí odchovem larvy druhého instaru nebo larvy Sl na jednom listu bledě zbarvené láhve jediné kvetoucí růže, s 10 replikacemi na rostlinu. Larvy hmyzu byly sevřeny svorkami a zbývající listová tkáň byla odebrána 24 a 72 hodin po infekci a hluboce zmrazena a metabolity byly extrahovány.
Simulujte ošetření býložravci vysoce synchronizovaným způsobem. Metoda spočívá v použití kotoučů s látkovým vzorem k propíchnutí tří řad trnů na každé straně středního žebra tří plně rozvinutých listů rostliny během fáze růstu látkového girlandu a okamžité aplikaci Ms zředěného v poměru 1:5. Nebo použijte rukavice k vpravení S1 OS do bodné rány. Sklizeň a zpracování listu proveďte výše popsaným způsobem. Použijte dříve popsanou metodu k extrakci primárních metabolitů a rostlinných hormonů (54).
Pro exogenní aplikace JA se tři řapíkaté listy každé ze šesti kvetoucích růží každého druhu ošetří 20 μl lanolinové pasty obsahující 150 μg MeJA (Lan + MeJA) a 20 μl lanolinu plus ošetření ran (Lan + W), nebo se jako kontrola použije 20 μl čistého lanolinu. Listy se sklidí 72 hodin po ošetření, rychle zmrazí v tekutém dusíku a skladují při teplotě -80 °C do použití.
V naší výzkumné skupině byly identifikovány čtyři transgenní linie JA a ET, a to irAOC (36), irCOI1 (55), irACO a sETR1 (48). IrAOC vykazovala silný pokles hladin JA a JA-Ile, zatímco irCOI1 nebyla citlivá na JA. Ve srovnání s EV se akumulace JA-Ile zvýšila. Podobně irACO snižuje produkci ET a ve srovnání s EV sETR1, který je necitlivý na ET, zvyšuje produkci ET.
Pro neinvazivní měření ET se používá fotoakustický laserový spektrometr (senzor ET v reálném čase Sensor Sense ETD-300). Ihned po ošetření byla polovina listů naříznuta a přenesena do 4ml uzavřené skleněné lahvičky a prostor nad lahvičkou se nechal akumulovat během 5 hodin. Během měření byla každá lahvička proplachována proudem 2 litry/hodinu čistého vzduchu po dobu 8 minut, který předtím prošel katalyzátorem poskytnutým společností Sensor Sense k odstranění CO2 a vody.
Data z mikročipů byla původně publikována v (35) a uložena v komplexní databázi genové exprese Národního centra pro biotechnologické informace (NCBI) (přístupové číslo GSE30287). Pro tuto studii byla extrahována data odpovídající listům způsobeným ošetřením W + OSM a nepoškozené kontrole. Hrubá intenzita je log2. Před statistickou analýzou byla základní linie převedena a normalizována na 75. percentil pomocí softwarového balíčku R.
Původní data sekvenování RNA (RNA-seq) druhů Nicotiana byla získána z archivu krátkých čtení NCBI (SRA), číslo projektu PRJNA301787, který publikovali Zhou a kol. (39), a postupovalo se dle popisu v (56). Pro analýzu v této studii byla vybrána nezpracovaná data zpracovaná programy W + W, W + OSM a W + OSS1 odpovídající druhům Nicotiana a zpracována následujícím způsobem: Nejprve byly nezpracované údaje RNA-seq převedeny do formátu FASTQ. HISAT2 převádí FASTQ na SAM a SAMtools převádí soubory SAM do seřazených souborů BAM. Pro výpočet genové exprese se používá StringTie a jeho metoda exprese spočívá v počtu fragmentů na tisíc bází na milion sekvenovaných transkripčních fragmentů.
Chromatografická kolona Acclaim (150 mm x 2,1 mm; velikost částic 2,2 μm) použitá v analýze a předkolona 4 mm x 4 mm jsou vyrobeny ze stejného materiálu. V systému Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) se používá následující binární gradient: 0 až 0,5 minuty, izokraticky 90 % A [deionizovaná voda, 0,1 % (v/v) acetonitril a 0,05 % kyselina mravenčí], 10 % B (acetonitril a 0,05 % kyselina mravenčí); 0,5 až 23,5 minuty, gradientová fáze je 10 % A a 90 % B; 23,5 až 25 minut, izokraticky 10 % A a 90 % B. Průtok je 400 μl/min. Pro všechny MS analýzy se eluent z kolony vstříkne do kvadrupólového a time-of-flight (qTOF) analyzátoru vybaveného elektrosprejovým zdrojem pracujícím v režimu pozitivní ionizace (napětí kapiláry 4500 V; výstup kapiláry 130 V; teplota sušení 200 °C; průtok vzduchu při sušení 10 litrů/min).
Proveďte analýzu fragmentů MS/MS (dále jen MS/MS), které jsou irelevantní nebo nerozeznatelné od dat, abyste získali strukturní informace o celkovém detekovatelném metabolickém profilu. Koncept nediskriminační metody MS/MS se opírá o skutečnost, že kvadrupól má velmi velké okno pro izolaci hmotnosti [proto všechny signály poměru hmotnosti k náboji (m/z) považujte za fragmenty]. Z tohoto důvodu, protože přístroj Impact II nebyl schopen vytvořit náklon CE, bylo provedeno několik nezávislých analýz s použitím zvýšených hodnot energie srážkové disociace (CE). Stručně řečeno, nejprve analyzujte vzorek pomocí UHPLC-elektrosprejové ionizace/qTOF-MS s použitím režimu jedné hmotnostní spektrometrie (podmínky nízké fragmentace generované fragmentací ve zdroji), skenováním od m/z 50 do 1500 při opakovací frekvenci 5 Hz. Pro analýzu MS/MS použijte jako srážkový plyn dusík a proveďte nezávislá měření při následujících čtyřech různých napětích disociace indukované srážkami: 20, 30, 40 a 50 eV. Během celého procesu měření má kvadrupól největší okno izolace hmotnosti, od m/z 50 do 1500. Pokud je experiment s m/z předního tělesa a šířkou izolace nastaven na 200, rozsah hmotnosti se automaticky aktivuje operačním softwarem přístroje a 0 Da. Skenujte fragmenty hmotnosti jako v režimu jedné hmotnosti. Pro kalibraci hmotnosti použijte mravenčan sodný (50 ml isopropanolu, 200 μl kyseliny mravenčí a 1 ml 1M vodného roztoku NaOH). Pomocí vysoce přesného kalibračního algoritmu Bruker se datový soubor kalibruje po spuštění průměrování spektra v daném časovém období. Pro převod souborů surových dat do formátu NetCDF použijte funkci exportu softwaru Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Brémy, Německo). Datová sada MS/MS byla uložena v otevřené metabolomické databázi MetaboLights (www.ebi.ac.uk) s evidenčním číslem MTBLS1471.
Sestavení MS/MS lze realizovat pomocí korelační analýzy mezi signály kvality MS1 a MS/MS pro nízkou a vysokou energii srážky a nově implementovanými pravidly. Pro realizaci korelační analýzy distribuce prekurzoru k produktu se používá skript R a pro implementaci pravidel skript C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline).
Abychom snížili falešně pozitivní chyby způsobené šumem pozadí a falešnou korelací způsobenou detekcí určitých m/z prvků pouze v několika vzorcích, používáme funkci „filled peak“ balíčku R XCMS (pro korekci šumu pozadí). Ta by měla být použita k nahrazení intenzity „NA“ (nedetekovaný peak). I když se použije funkce fill peak, v datové sadě stále existuje mnoho hodnot intenzity „0“, které ovlivní výpočet korelace. Poté porovnáme výsledky zpracování dat získané s použitím funkce fill peak a bez použití funkce fill peak a vypočítáme hodnotu šumu pozadí na základě průměrné korigované odhadované hodnoty a poté nahradíme tyto nulové hodnoty intenzity vypočítanou hodnotou pozadí. Také jsme brali v úvahu pouze prvky, jejichž intenzita trojnásobně překročila hodnotu pozadí, a považovali jsme je za „skutečné píky“. Pro výpočty PCC se berou v úvahu pouze signály m/z datových sad prekurzoru vzorku (MS1) a fragmentů s alespoň osmi skutečnými píky.
Pokud intenzita znaku kvality prekurzoru v celém vzorku významně koreluje se sníženou intenzitou stejného znaku kvality, který je vystaven nízké nebo vysoké energii srážky, a znak není programem CAMERA označen jako izotopový pík, lze jej dále definovat. Poté se provede korelační analýza výpočtem všech možných párů prekurzor-produkt během 3 s (odhadované retenční časové okno pro retenci píku). Pouze když je hodnota m/z nižší než hodnota prekurzoru a k MS/MS fragmentaci dochází na stejném místě vzorku v datové sadě jako prekurzor, ze kterého je odvozen, je považován za fragment.
Na základě těchto dvou jednoduchých pravidel vylučujeme specifikované fragmenty s hodnotami m/z vyššími než m/z identifikovaného prekurzoru a na základě polohy vzorku, kde se prekurzor objevuje, a specifikovaného fragmentu. Je také možné vybrat kvalitativní znaky generované mnoha fragmenty ve zdroji generovanými v režimu MS1 jako kandidátské prekurzory, čímž se generují redundantní sloučeniny MS/MS. Abychom snížili tuto redundanci dat, pokud podobnost NDP spekter přesáhne 0,6 a patří do chromatogramu „pcgroup“ anotovaného programem CAMERA, sloučíme je. Nakonec sloučíme všechny čtyři výsledky CE spojené s prekurzorem a fragmenty do finálního dekonvoluovaného kompozitního spektra výběrem píku s nejvyšší intenzitou ze všech kandidátských píků se stejnou hodnotou m/z při různých srážkových energiích. Následné kroky zpracování jsou založeny na konceptu kompozitního spektra a berou v úvahu různé podmínky CE potřebné k maximalizaci pravděpodobnosti fragmentace, protože některé fragmenty lze detekovat pouze při specifické srážkové energii.
Pro výpočet indukovatelnosti metabolického profilu byl použit RDPI (30). Diverzita metabolického spektra (index Hj) je odvozena z množství prekurzorů MS/MS pomocí Shannonovy entropie frekvenčního rozdělení MS/MS s využitím následující rovnice popsané Martínezem a kol. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), kde Pij odpovídá relativní frekvenci i-té MS/MS v j-tém vzorku (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m)t).
Metabolická specificita (Si index) je definována jako identita exprese daného MS/MS ve vztahu k frekvenci mezi uvažovanými vzorky. Specifičnost MS/MS se vypočítá jako Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Pro měření metabolomově specifického indexu δj každého j-tého vzorku a průměru specificity MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi použijte následující vzorec:
Spektra MS/MS jsou seřazena do dvojic a podobnost se vypočítá na základě těchto dvou skóre. Nejprve se pomocí standardní metody NDP (známé také jako metoda kosinusové korelace) vyhodnotí podobnost segmentů mezi spektry pomocí následující rovnice: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, kde S1 a S2 Odpovídajícím způsobem pro spektrum 1 a spektrum 2, stejně jako pro WS1, i a WS2, i představuje váhu založenou na intenzitě píku, při které je rozdíl i-tého společného píku mezi oběma spektry menší než 0,01 Da. Váha se vypočítá následovně: W = [intenzita píku] m [kvalita] n, m = 0,5, n = 2, jak navrhuje MassBank.
Byla implementována druhá metoda hodnocení, která zahrnovala analýzu sdílené NL mezi MS/MS. Za tímto účelem jsme použili 52 NL seznamů, které se často vyskytují během procesu fragmentace MS, a specifičtější NL (datový soubor S1), který byl dříve anotován pro MS/MS spektrum sekundárních metabolitů oslabeného druhu Nepenthes (9, 26). Pro každou MS/MS vytvořili binární vektor 1 a 0, který odpovídá aktuální a neexistující určité NL. Na základě podobnosti euklidovské vzdálenosti se pro každou dvojici binárních NL vektorů vypočítá skóre podobnosti NL.
Pro provedení duálního shlukování jsme použili balíček R DiffCoEx, který je založen na rozšíření vážené analýzy genové koexprese (WGCNA). Pomocí matic skóre NDP a NL MS/MS spekter jsme k výpočtu komparativní korelační matice použili DiffCoEx. Binární shlukování se provádí nastavením parametru „cutreeDynamic“ na method = „hybrid“, cutHeight = 0,9999, deepSplit = T a minClusterSize = 10. Zdrojový kód DiffCoEx v jazyce R byl stažen z dalšího souboru 1 Tessonem a kol. (57); Potřebný softwarový balíček R WGCNA lze nalézt na adrese https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Abychom provedli MS/MS analýzu molekulárních sítí, vypočítali jsme párovou spektrální konektivitu na základě typů podobnosti NDP a NL a pomocí softwaru Cytoscape jsme vizualizovali topologii sítě s využitím organického rozvržení v aplikaci CyFilescape yFiles layout algorithm extension.
Pro provedení statistické analýzy dat použijte program R verze 3.0.1. Statistická významnost byla posouzena pomocí oboufaktorové analýzy rozptylu (ANOVA) a následně Tukeyho post-hoc testu na skutečný významný rozdíl (HSD). Pro analýzu rozdílu mezi býložravou skupinou a kontrolní skupinou bylo oboustranné rozdělení dvou skupin vzorků se stejným rozptylem analyzováno pomocí Studentova t-testu.
Doplňující materiály k tomuto článku naleznete na adrese http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný za podmínek licence Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, která umožňuje použití, distribuci a reprodukci v jakémkoli médiu, pokud konečné použití není pro komerční zisk a předpokladem je, že původní dílo je správné. Odkaz.
Poznámka: O uvedení vaší e-mailové adresy vás žádáme pouze proto, aby osoba, kterou stránce doporučíte, věděla, že chcete, aby e-mail viděla, a že se nejedná o spam. Nebudeme zaznamenávat žádné e-mailové adresy.
Tato otázka se používá k ověření, zda jste návštěvník, a k zabránění automatickému odesílání spamu.
Teorie informace poskytuje univerzální měnu pro srovnání speciálních metabolomů a predikci teorií testovací obrany.
Teorie informace poskytuje univerzální měnu pro srovnání speciálních metabolomů a predikci teorií testovací obrany.
©2021 American Association for the Advancement of Science. všechna práva vyhrazena. AAAS je partnerem HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.