Dříve jsme informovali o tom, že sérové ​​hladiny tryptofanového metabolitu indol-3-propionové kyseliny (IPA) pocházejícího ze střev jsou nižší u pacientů s jaterní fibrózou. V této studii jsme zkoumali transkriptom a DNA methylom v obézních játrech ve vztahu k sérovým hladinám IPA, stejně jako roli IPA v indukci fenotypové inaktivace jaterních stelátových buněk (HSC) in vitro.
Studie zahrnovala 116 obézních pacientů bez diabetu mellitus 2. typu (DM2) (věk 46,8 ± 9,3 let; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²), kteří podstoupili bariatrickou operaci v centru bariatrické chirurgie v Kuopiu (KOBS). Hladiny IPA v oběhu byly měřeny pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC-MS), analýza jaterních transkriptomů byla provedena sekvenováním celkové RNA a analýza methylace DNA byla provedena pomocí čipu Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Pro experimenty in vitro byly použity lidské jaterní stelátové buňky (LX-2).
Hladiny IPA v séru korelovaly s expresí genů zapojených do apoptotických, mitofagických a dlouhověkých metabolických drah v játrech. Gen AKT serin/threonin kináza 1 (AKT1) byl nejhojnějším a dominantním interagujícím genem v profilech jaterních transkriptů a metylace DNA. Léčba IPA indukovala apoptózu, snížila mitochondriální dýchání a změnila buněčnou morfologii a mitochondriální dynamiku modulací exprese genů, o nichž je známo, že regulují fibrózu, apoptózu a přežití buněk LX-2.
Tato data dohromady podporují názor, že IPA má potenciální terapeutické účinky a může indukovat apoptózu a posunout fenotyp HSC směrem k neaktivnímu stavu, čímž rozšiřuje možnost inhibice jaterní fibrózy interferencí s aktivací HSC a mitochondriálním metabolismem.
Prevalence obezity a metabolického syndromu je spojována s rostoucím výskytem metabolicky asociovaného ztučnění jater (MASLD); toto onemocnění postihuje 25 % až 30 % běžné populace [1]. Hlavním důsledkem etiologie MASLD je jaterní fibróza, dynamický proces charakterizovaný neustálou akumulací fibrózní extracelulární matrix (ECM) [2]. Hlavními buňkami zapojenými do jaterní fibrózy jsou jaterní stelátové buňky (HSC), které vykazují čtyři známé fenotypy: klidové, aktivované, inaktivované a senescentní [3, 4]. HSC se mohou aktivovat a transdiferencovat z klidové formy na proliferativní buňky podobné fibroblastům s vysokými energetickými nároky, se zvýšenou expresí α-aktinu hladkého svalstva (α-SMA) a kolagenu typu I (Col-I) [5, 6]. Během zvrácení jaterní fibrózy jsou aktivované HSC eliminovány apoptózou nebo inaktivací. Mezi tyto procesy patří downregulace fibrogenních genů a modulace genů pro přežití (jako jsou signální dráhy NF-κB a PI3K/Akt) [7, 8], stejně jako změny v dynamice a funkci mitochondrií [9].
Bylo zjištěno, že sérové ​​hladiny metabolitu tryptofanu, kyseliny indol-3-propionové (IPA), produkované ve střevě, jsou sníženy u lidských metabolických onemocnění včetně MASLD [10–13]. IPA je spojen s příjmem vlákniny, je známý svými antioxidačními a protizánětlivými účinky a zmírňuje fenotyp nealkoholické steatohepatitidy (NASH) indukované stravou in vivo a in vitro [11–14]. Některé důkazy pocházejí z naší předchozí studie, která prokázala, že sérové ​​hladiny IPA byly nižší u pacientů s jaterní fibrózou než u obézních pacientů bez jaterní fibrózy v rámci studie Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Dále jsme ukázali, že léčba IPA může snížit expresi genů, které jsou klasickými markery buněčné adheze, buněčné migrace a aktivace hematopoetických kmenových buněk v modelu lidských jaterních stelátových buněk (LX-2), a je potenciálním hepatoprotektivním metabolitem [15]. Zůstává však nejasné, jak IPA indukuje regresi jaterní fibrózy aktivací apoptózy HSC a mitochondriální bioenergetiky.
Zde demonstrujeme, že sérový IPA je spojen s expresí genů obohacených o dráhy apoptózy, mitofagie a dlouhověkosti v játrech obézních jedinců bez diabetu 2. typu (KOBS). Dále jsme zjistili, že IPA může indukovat clearance a degradaci aktivovaných hematopoetických kmenových buněk (HSC) prostřednictvím inaktivační dráhy. Tyto výsledky odhalují novou roli IPA, což z něj činí potenciální terapeutický cíl pro podporu regrese jaterní fibrózy.
Předchozí studie v kohortě KOBS ukázala, že pacienti s jaterní fibrózou měli nižší hladiny IPA v oběhu ve srovnání s pacienty bez jaterní fibrózy [15]. Abychom vyloučili potenciální matoucí vliv diabetu 2. typu, zařadili jsme do studie 116 obézních pacientů bez diabetu 2. typu (průměrný věk ± SD: 46,8 ± 9,3 let; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (tabulka 1) z probíhající studie KOBS jako studijní populaci [16]. Všichni účastníci poskytli písemný informovaný souhlas a protokol studie byl schválen etickou komisí nemocnice North Savo County Hospital v souladu s Helsinskou deklarací (54/2005, 104/2008 a 27/2010).
Vzorky biopsie jater byly odebrány během bariatrické operace a histologicky vyšetřeny zkušenými patology podle dříve popsaných kritérií [17, 18]. Kritéria hodnocení jsou shrnuta v doplňkové tabulce S1 a byla popsána dříve [19].
Vzorky séra nalačno byly analyzovány metodou necílené kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) pro metabolomickou analýzu (n = 116). Vzorky byly analyzovány za použití systému UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Německo), jak bylo popsáno dříve19. Identifikace isopropylalkoholu (IPA) byla založena na retenčním čase a porovnání MS/MS spektra s čistými standardy. Intenzita signálu IPA (plocha píku) byla brána v úvahu ve všech dalších analýzách [20].
Sekvenování celé jaterní RNA bylo provedeno pomocí Illumina HiSeq 2500 a data byla předzpracována dle dříve popsaného postupu [19, 21, 22]. Provedli jsme cílenou analýzu diferenciální exprese transkriptů ovlivňujících mitochondriální funkci/biogenezi s použitím 1957 genů vybraných z databáze MitoMiner 4.0 [23]. Analýza methylace jaterní DNA byla provedena pomocí Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) s použitím stejné metodologie, jaká byla popsána dříve [24, 25].
Lidské jaterní stelátové buňky (LX-2) byly laskavě poskytnuty prof. Stefanem Romeem a byly kultivovány a udržovány v médiu DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Pro výběr pracovní dávky IPA byly buňky LX-2 ošetřeny různými koncentracemi IPA (10 μM, 100 μM a 1 mM; Sigma, 220027) v médiu DMEM/F12 po dobu 24 hodin. Dále, pro zkoumání schopnosti IPA inaktivovat HSC, byly buňky LX-2 současně ošetřeny 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) a 1 mM IPA v médiu bez séra po dobu 24 hodin. Pro odpovídající kontroly s vehikulem byl pro ošetření TGF-β1 použit 4 nM HCl s obsahem 0,1 % BSA a pro ošetření IPA 0,05 % DMSO a obě látky byly použity společně pro kombinovanou léčbu.
Apoptóza byla hodnocena pomocí soupravy FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit s 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, kat. č. 640922) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, LX-2 (1 × 105 buněk/jamku) byly kultivovány přes noc na 12jamkových destičkách a poté ošetřeny opakovanými dávkami IPA nebo IPA a TGF-β1. Následující den byly plovoucí a adherentní buňky odebrány, trypsinizovány, promyty PBS, resuspendovány v pufru vázajícím Annexin V a inkubovány s FITC-Annexin V a 7-AAD po dobu 15 minut.
Mitochondrie v živých buňkách byly obarveny na oxidační aktivitu pomocí Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Pro MTR testy byly buňky LX-2 inkubovány ve stejné hustotě s IPA a TGF-β1. Po 24 hodinách byly živé buňky trypsinizovány, promyty PBS a poté inkubovány se 100 μM MTR v bezsérovém médiu při 37 °C po dobu 20 minut, jak bylo popsáno dříve [26]. Pro analýzu morfologie živých buněk byla velikost buněk a cytoplazmatická komplexita analyzována pomocí parametrů dopředného rozptylu (FSC) a bočního rozptylu (SSC).
Všechna data (30 000 událostí) byla získána pomocí systému NovoCyte Quanteon (Agilent) a analyzována pomocí softwaru NovoExpress® 1.4.1 nebo FlowJo V.10.
Rychlost spotřeby kyslíku (OCR) a rychlost extracelulární acidifikace (ECAR) byly měřeny v reálném čase pomocí analyzátoru extracelulárního toku Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) vybaveného přístrojem Seahorse XF Cell Mito Stress podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, 2 × 10⁴ buněk LX-2/jamka byly naočkovány na kultivační destičky XF96. Po inkubaci přes noc byly buňky ošetřeny isopropanolem (IPA) a TGF-β1 (doplňkové metody 1). Analýza dat byla provedena pomocí softwaru Seahorse XF Wave, který zahrnuje generátor testů fenotypu energie buněk Seahorse XF. Z tohoto indexu byl vypočítán index bioenergetického zdraví (BHI) [27].
Celková RNA byla transkribována do cDNA. Specifické metody viz odkaz [15]. Jako konstitutivní genové kontroly byly použity hladiny mRNA lidského 60S ribozomálního kyselého proteinu P0 (RPLP0) a cyklofilinu A1 (PPIA). Byl použit systém QuantStudio 6 pro Real-Time PCR (Thermo Fisher, Landsmeer, Nizozemsko) se sadou TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) nebo sadou Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) a relativní násobek genové exprese byl vypočítán pomocí komparativních parametrů cyklování hodnot Ct (ΔΔCt) a metody ∆∆Ct. Podrobnosti o primerech jsou uvedeny v doplňkových tabulkách S2 a S3.
Jaderná DNA (ncDNA) a mitochondriální DNA (mtDNA) byly extrahovány pomocí soupravy DNeasy blood and tissue kit (Qiagen), jak bylo popsáno dříve [28]. Relativní množství mtDNA bylo vypočítáno výpočtem poměru každé cílové oblasti mtDNA ke geometrickému průměru tří oblastí jaderné DNA (mtDNA/ncDNA), jak je podrobně popsáno v doplňkových metodách 2. Podrobnosti o primerech pro mtDNA a ncDNA jsou uvedeny v doplňkové tabulce S4.
Živé buňky byly obarveny barvivem Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) pro vizualizaci mezibuněčných a intracelulárních mitochondriálních sítí. Buňky LX-2 (1 × 10⁴ buněk/jamku) byly kultivovány na skleněných podložních sklíčkách v odpovídajících kultivačních plotnách se skleněným dnem (Ibidi GmbH, Martinsried, Německo). Po 24 hodinách byly živé buňky LX-2 inkubovány se 100 μM MTR po dobu 20 minut při 37 °C a buněčná jádra byla obarvena DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich), jak bylo popsáno dříve [29]. Mitochondriální sítě byly vizualizovány pomocí invertovaného mikroskopu Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Německo) vybaveného konfokálním modulem Zeiss LSM 800 při 37 °C ve zvlhčené atmosféře s 5 % CO₂ za použití objektivu 63×NA 1,3. Pro každý typ vzorku jsme pořídili deset snímků řady Z. Každá série Z obsahuje 30 řezů, každý o tloušťce 9,86 μm. Pro každý vzorek byly pomocí softwaru ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Německo) pořízeny snímky deseti různých zorných polí a analýza mitochondriální morfologie byla provedena pomocí softwaru ImageJ (v1.54d) [30, 31] podle parametrů podrobně popsaných v Doplňkových metodách 3.
Buňky byly fixovány 2% glutaraldehydem v 0,1 M fosfátovém pufru, následovala fixace 1% roztokem oxidu osmia (Sigma Aldrich, MO, USA), postupně dehydratovány acetonem (Merck, Darmstadt, Německo) a nakonec zality do epoxidové pryskyřice. Byly připraveny ultratenké řezy a obarveny 1% uranylacetátem (Merck, Darmstadt, Německo) a 1% citrátem olovnatým (Merck, Darmstadt, Německo). Ultrastrukturální snímky byly získány pomocí transmisního elektronového mikroskopu JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokio, Japonsko) při akceleračním napětí 80 kV.
Morfologie buněk LX-2 ošetřených IPA po dobu 24 hodin byla analyzována fázově kontrastní mikroskopií při 50násobném zvětšení za použití invertovaného světelného mikroskopu Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 a AxioCam MRm, Jena, Německo).
Klinická data byla vyjádřena jako průměr ± směrodatná odchylka nebo medián (interkvartilní rozpětí: IQR). Pro porovnání rozdílů mezi třemi studijními skupinami byla použita jednocestná analýza rozptylu (spojité proměnné) nebo χ² test (kategorické proměnné). Pro korekci vícenásobného testování byla použita míra falešně pozitivních výsledků (FDR) a geny s FDR < 0,05 byly považovány za statisticky významné. Pro korelaci metylace CpG DNA s intenzitou IPA signálu byla použita Spearmanova korelační analýza s uvedením nominálních hodnot p (p < 0,05).
Analýza genových drah byla provedena pomocí webového nástroje pro analýzu genových sad (WebGestalt) pro 268 transkriptů (nominální p < 0,01), 119 transkriptů asociovaných s mitochondrií (nominální p < 0,05) a 4350 CpG z 3093 jaterních transkriptů, které byly asociovány s hladinami IPA v séru v oběhu. Pro nalezení překrývajících se genů byl použit volně dostupný nástroj Venny DB (verze 2.1.0) a pro vizualizaci protein-proteinových interakcí StringDB (verze 11.5).
Pro experiment LX-2 byly vzorky testovány na normalitu pomocí D'Agostino-Pearsonova testu. Data byla získána z alespoň tří biologických replikátů a podrobena jednofaktorové ANOVA s Bonferroniho post hoc testem. Hodnota p menší než 0,05 byla považována za statisticky významnou. Data jsou prezentována jako průměr ± SD a počet experimentů je uveden v každém obrázku. Všechny analýzy a grafy byly provedeny pomocí statistického softwaru GraphPad Prism 8 pro Windows (GraphPad Software Inc., verze 8.4.3, San Diego, USA).
Nejprve jsme zkoumali souvislost hladin IPA v séru s transkripty v játrech, celém těle a mitochondriích. V celkovém profilu transkriptů byl nejsilněji asociovaný gen s hladinami IPA v séru MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitogenem aktivovaná proteinkináza 3); v profilu transkriptů souvisejících s mitochondrií byl nejsilněji asociovaný gen AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serin/threoninová kináza 1) (Doplňkový soubor 1 a Doplňkový soubor 2).
Následně jsme analyzovali globální transkripty (n = 268; p < 0,01) a transkripty asociované s mitochondriemi (n = 119; p < 0,05) a nakonec identifikovali apoptózu jako nejvýznamnější kanonickou signální dráhu (p = 0,0089). U mitochondriálních transkriptů asociovaných s hladinami IPA v séru jsme se zaměřili na apoptózu (FDR = 0,00001), mitofagii (FDR = 0,00029) a signální dráhy TNF (FDR = 0,000006) (obrázek 1A, tabulka 2 a doplňkové obrázky 1A-B).
Analýza překrývajících se globálních transkriptů asociovaných s mitochondrií a metylace DNA v lidských játrech ve spojení s hladinami IPA v séru. A představuje 268 globálních transkriptů, 119 transkriptů asociovaných s mitochondrií a transkriptů metylované DNA, které jsou mapovány na 3092 CpG míst asociovaných s hladinami IPA v séru (hodnoty p < 0,01 pro globální transkripty a metylovanou DNA a hodnoty p < 0,05 pro mitochondriální transkripty). Hlavní překrývající se transkripty jsou zobrazeny uprostřed (AKT1 a YKT6). B Interakční mapa 13 genů s nejvyšším skóre interakce (0,900) s ostatními geny byla vytvořena z 56 překrývajících se genů (oblast černé čáry), které byly významně asociovány s hladinami IPA v séru, pomocí online nástroje StringDB. Zelená: Geny mapované na buněčnou složku Gene Ontology (GO): mitochondrie (GO:0005739). AKT1 je protein s nejvyšším skóre (0,900) pro interakce s jinými proteiny na základě dat (na základě text miningu, experimentů, databází a koexprese). Uzly sítě představují proteiny a hrany představují spojení mezi proteiny.
Vzhledem k tomu, že metabolity střevní mikrobioty mohou regulovat epigenetické složení prostřednictvím metylace DNA [32], zkoumali jsme, zda hladiny IPA v séru souvisejí s metylací DNA v játrech. Zjistili jsme, že dvě hlavní metylační místa spojená s hladinami IPA v séru se nacházela v blízkosti oblasti 3 bohaté na prolin a serin (C19orf55) a člena 6 rodiny proteinů tepelného šoku B (malý) (HSPB6) (dodatečný soubor 3). Metylace DNA 4350 CpG (p < 0,01) korelovala s hladinami IPA v séru a byla obohacena o regulační dráhy dlouhověkosti (p = 0,006) (obrázek 1A, tabulka 2 a doplňkový obrázek 1C).
Abychom pochopili biologické mechanismy, které jsou základem asociací mezi hladinami IPA v séru, globálními transkripty, transkripty asociovanými s mitochondriemi a metylací DNA v lidských játrech, provedli jsme analýzu překrývání genů identifikovaných v předchozí analýze signálních drah (obrázek 1A). Výsledky analýzy obohacení signálních drah 56 překrývajících se genů (uvnitř černé čáry na obrázku 1A) ukázaly, že signální dráha apoptózy (p = 0,00029) zvýraznila dva geny společné pro všechny tři analýzy: AKT1 a YKT6 (homolog YKT6 v-SNARE), jak je znázorněno na Vennově diagramu (doplňkový obrázek 2 a obrázek 1A). Zajímavé je, že jsme zjistili, že AKT1 (cg19831386) a YKT6 (cg24161647) pozitivně korelovaly s hladinami IPA v séru (doplňkový soubor 3). Pro identifikaci potenciálních proteinových interakcí mezi genovými produkty jsme jako vstup vybrali 13 genů s nejvyšším skóre společné oblasti (0,900) z 56 překrývajících se genů a vytvořili jsme mapu interakcí. Podle úrovně spolehlivosti (marginální spolehlivost) byl gen AKT1 s nejvyšším skóre (0,900) na vrcholu (obrázek 1B).
Na základě analýzy metabolické dráhy jsme zjistili, že hlavní metabolickou dráhou je apoptóza, a proto jsme zkoumali, zda by léčba IPA ovlivnila apoptózu HSC in vitro. Dříve jsme prokázali, že různé dávky IPA (10 μM, 100 μM a 1 mM) byly pro buňky LX-2 netoxické [15]. Tato studie ukázala, že léčba IPA v koncentraci 10 μM a 100 μM zvýšila počet životaschopných a nekrotických buněk. Ve srovnání s kontrolní skupinou se však životaschopnost buněk při koncentraci 1 mM IPA snížila, zatímco míra nekrózy buněk zůstala nezměněna (obrázek 2A, B). Abychom našli optimální koncentraci pro indukci apoptózy v buňkách LX-2, testovali jsme 10 μM, 100 μM a 1 mM IPA po dobu 24 hodin (obrázek 2A-E a doplňkový obrázek 3A-B). Je zajímavé, že IPA 10 μM a 100 μM snížily míru apoptózy (%), nicméně IPA 1 mM zvýšila pozdní apoptózu a míru apoptózy (%) ve srovnání s kontrolou, a proto byla vybrána pro další experimenty (obrázky 2A–D).
IPA indukuje apoptózu buněk LX-2. Pro kvantifikaci rychlosti apoptózy a morfologie buněk průtokovou cytometrií byla použita metoda dvojitého barvení Annexinem V a 7-AAD. Buňky BA byly inkubovány s 10 μM, 100 μM a 1 mM IPA po dobu 24 hodin nebo s F–H TGF-β1 (5 ng/ml) a 1 mM IPA v bezsérovém médiu po dobu 24 hodin. A: živé buňky (Annexin V -/ 7AAD-); B: nekrotické buňky (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: časné (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: pozdní (Annexin V+/7AAD.+); E, H: procento celkových časných a pozdních apoptotických buněk v míře apoptózy (%). Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD, n = 3 nezávislé experimenty. Statistická srovnání byla provedena pomocí jednofaktorové ANOVA s Bonferroniho post hoc testem. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Jak jsme již dříve ukázali, 5 ng/ml TGF-β1 může indukovat aktivaci HSC zvýšením exprese klasických markerových genů [15]. Buňky LX-2 byly ošetřeny kombinací 5 ng/ml TGF-β1 a 1 mM IPA (obr. 2E–H). Léčba TGF-β1 nezměnila míru apoptózy, nicméně společná léčba IPA zvýšila pozdní apoptózu a míru apoptózy (%) ve srovnání s léčbou TGF-β1 (obr. 2E–H). Tyto výsledky naznačují, že 1 mM IPA může podporovat apoptózu v buňkách LX-2 nezávisle na indukci TGF-β1.
Dále jsme zkoumali vliv IPA na mitochondriální dýchání v buňkách LX-2. Výsledky ukázaly, že 1 mM IPA snížil parametry rychlosti spotřeby kyslíku (OCR): nemitochondriální dýchání, bazální a maximální dýchání, únik protonů a produkci ATP ve srovnání s kontrolní skupinou (obrázek 3A, B), zatímco index bioenergetického zdraví (BHI) se nezměnil.
IPA snižuje mitochondriální dýchání v buňkách LX-2. Křivka mitochondriálního dýchání (OCR) je prezentována jako parametry mitochondriálního dýchání (nemitochondriální dýchání, bazální dýchání, maximální dýchání, únik protonů, tvorba ATP, SRC a BHI). Buňky A a B byly inkubovány s 10 μM, 100 μM a 1 mM IPA po dobu 24 hodin. Buňky C a D byly inkubovány s TGF-β1 (5 ng/ml) a 1 mM IPA v bezsérovém médiu po dobu 24 hodin. Všechna měření byla normalizována na obsah DNA pomocí soupravy CyQuant. BHI: index bioenergetického zdraví; SRC: respirační rezervní kapacita; OCR: rychlost spotřeby kyslíku. Data jsou prezentována jako průměr ± směrodatná odchylka (SD), n = 5 nezávislých experimentů. Statistická srovnání byla provedena pomocí jednofaktorové ANOVA a Bonferroniho post hoc testu. *p < 0,05; **p < 0,01; a ***p < 0,001
Pro komplexnější pochopení vlivu IPA na bioenergetický profil buněk LX-2 aktivovaných TGF-β1 jsme analyzovali mitochondriální oxidativní fosforylaci pomocí OCR (obr. 3C,D). Výsledky ukázaly, že léčba TGF-β1 mohla snížit maximální respiraci, respirační rezervní kapacitu (SRC) a BHI ve srovnání s kontrolní skupinou (obr. 3C,D). Kombinovaná léčba navíc snížila bazální respiraci, únik protonů a produkci ATP, ale SRC a BHI byly významně vyšší než u pacientů léčených TGF-β1 (obr. 3C,D).
Také jsme provedli „test buněčného energetického fenotypu“ poskytovaný softwarem Seahorse (doplňkový obrázek 4A–D). Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 3B, metabolické potenciály OCR i ECAR byly po léčbě TGF-β1 sníženy, nicméně ve skupinách léčených kombinovanou terapií a terapií IPA nebyl pozorován žádný rozdíl ve srovnání s kontrolní skupinou. Dále byly po kombinované terapii a terapii IPA sníženy jak bazální, tak i stresové hladiny OCR ve srovnání s kontrolní skupinou (doplňkový obrázek 4C). Je zajímavé, že podobný vzorec byl pozorován u kombinované terapie, kde nebyla pozorována žádná změna bazálních a stresových hladin ECAR ve srovnání s léčbou TGF-β1 (doplňkový obrázek 4C). U HSC snížení mitochondriální oxidativní fosforylace a schopnost kombinované léčby obnovit SCR a BHI po expozici léčbě TGF-β1 nezměnily metabolický potenciál (OCR a ECAR). Celkově vzato tyto výsledky naznačují, že IPA může snižovat bioenergetiku v HSC, což naznačuje, že IPA může indukovat nižší energetický profil, který posouvá fenotyp HSC směrem k inaktivaci (doplňkový obrázek 4D).
Vliv IPA na dynamiku mitochondrií byl zkoumán pomocí trojrozměrné kvantifikace mitochondriální morfologie a síťových propojení, stejně jako barvení MTR (obrázek 4 a doplňkový obrázek 5). Obrázek 4 ukazuje, že ve srovnání s kontrolní skupinou léčba TGF-β1 snížila průměrnou povrchovou plochu, počet větví, celkovou délku větví a počet spojení větví (obrázek 4A a B) a změnila podíl mitochondrií ze sférické na střední morfologii (obrázek 4C). Pouze léčba IPA snížila průměrný objem mitochondrií a změnila podíl mitochondrií ze sférické na střední morfologii ve srovnání s kontrolní skupinou (obrázek 4A). Naproti tomu sféricita, průměrná délka větví a mitochondriální aktivita hodnocená pomocí MTR závislého na mitochondriálním membránovém potenciálu (obrázek 4A a E) zůstaly nezměněny a tyto parametry se mezi skupinami nelišily. Celkově vzato tyto výsledky naznačují, že léčba TGF-β1 a IPA zřejmě modulují tvar a velikost mitochondrií, stejně jako složitost sítě v živých buňkách LX-2.
IPA mění mitochondriální dynamiku a množství mitochondriální DNA v buňkách LX-2. A. Reprezentativní konfokální snímky živých buněk LX-2 inkubovaných s TGF-β1 (5 ng/ml) a 1 mM IPA po dobu 24 hodin v bezsérovém médiu, zobrazující mitochondriální sítě obarvené Mitotracker™ Red CMXRos a jádra obarvená modře DAPI. Všechna data obsahovala alespoň 15 snímků na skupinu. Pro každý typ vzorku jsme pořídili 10 snímků Z-stack. Každá sekvence na ose Z obsahovala 30 řezů, každý o tloušťce 9,86 μm. Měřítko: 10 μm. B. Reprezentativní objekty (pouze mitochondrie) identifikované aplikací adaptivního prahování na snímek. Kvantitativní analýza a srovnání morfologických síťových propojení mitochondrií byly provedeny pro všechny buňky v každé skupině. C. Frekvence poměrů tvarů mitochondrií. Hodnoty blízké 0 označují sférické tvary a hodnoty blízké 1 označují vláknité tvary. D Obsah mitochondriální DNA (mtDNA) byl stanoven dle popisu v části Materiály a metody. Analýza E Mitotracker™ Red CMXRos byla provedena průtokovou cytometrií (30 000 událostí) dle popisu v části Materiály a metody. Data jsou prezentována jako průměr ± SD, n = 3 nezávislé experimenty. Statistická srovnání byla provedena pomocí jednofaktorové ANOVA a Bonferroniho post hoc testu. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Následně jsme analyzovali obsah mtDNA v buňkách LX-2 jako indikátor počtu mitochondrií. Ve srovnání s kontrolní skupinou byl obsah mtDNA ve skupině léčené TGF-β1 zvýšen (obrázek 4D). Ve srovnání se skupinou léčenou TGF-β1 byl obsah mtDNA ve skupině s kombinovanou léčbou snížen (obrázek 4D), což naznačuje, že IPA může snižovat obsah mtDNA a pravděpodobně i počet mitochondrií, stejně jako mitochondriální dýchání (obrázek 3C). Navíc se zdá, že IPA v kombinované léčbě snižuje obsah mtDNA, ale neovlivňuje mitochondriální aktivitu zprostředkovanou MTR (obrázky 4A–C).
Zkoumali jsme souvislost IPA s hladinami mRNA genů spojených s fibrózou, apoptózou, přežitím a mitochondriální dynamikou v buňkách LX-2 (obrázek 5A–D). Ve srovnání s kontrolní skupinou vykazovala skupina léčená TGF-β1 zvýšenou expresi genů, jako je řetězec kolagenu typu I α2 (COL1A2), α-aktin hladkého svalstva (αSMA), matrixová metaloproteináza 2 (MMP2), tkáňový inhibitor metaloproteinázy 1 (TIMP1) a gen podobný dynaminu 1 (DRP1), což naznačuje zvýšenou fibrózu a aktivaci. Dále ve srovnání s kontrolní skupinou léčba TGF-β1 snížila hladiny mRNA nukleárního receptoru pregnanu X (PXR), kaspázy 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitoru B-buněk α, zesilovače světelného peptidu genu nukleárního faktoru κ (NFκB1A) a inhibitoru podjednotky kinázy nukleárního faktoru κB β (IKBKB) (obrázek 5A–D). Ve srovnání s léčbou TGF-β1 snížila kombinovaná léčba s TGF-β1 a IPA expresi COL1A2 a MMP2, ale zvýšila hladiny mRNA PXR, TIMP1, B-buněčného lymfomu-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β a IKBKB. Léčba IPA významně snížila expresi MMP2, proteinu X asociovaného s Bcl-2 (BAX), AKT1, proteinu optické atrofie 1 (OPA1) a mitochondriálního fúzního proteinu 2 (MFN2), zatímco exprese CASP8, NFκB1A, NFκB1B a IKBKB byla ve srovnání s kontrolní skupinou zvýšena. Nebyl však zjištěn žádný rozdíl v expresi kaspázy-3 (CASP3), faktoru aktivujícího apoptotickou peptidázu 1 (APAF1), mitochondriálního fúzního proteinu 1 (MFN1) a štěpného proteinu 1 (FIS1). Tyto výsledky kolektivně naznačují, že léčba IPA moduluje expresi genů spojených s fibrózou, apoptózou, přežitím a mitochondriální dynamikou. Naše data naznačují, že léčba IPA snižuje fibrózu v buňkách LX-2; zároveň stimuluje přežití posunem fenotypu směrem k inaktivaci.
IPA moduluje expresi fibroblastových, apoptotických, viabilních a mitochondriálních dynamických genů v buňkách LX-2. Histogramy zobrazují expresi mRNA v porovnání s endogenní kontrolou (RPLP0 nebo PPIA) po indukci buněk LX-2 pomocí TGF-β1 a IPA v bezsérovém médiu po dobu 24 hodin. A označuje fibroblasty, B označuje apoptotické buňky, C označuje přežívající buňky a D označuje expresi genů mitochondriální dynamiky. Data jsou prezentována jako průměr ± směrodatná odchylka (SD), n = 3 nezávislé experimenty. Statistická srovnání byla provedena pomocí jednofaktorové ANOVA a Bonferroniho post hoc testu. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Poté byly pomocí průtokové cytometrie (obrázek 6A,B) hodnoceny změny velikosti buněk (FSC-H) a cytoplazmatické komplexity (SSC-H) a změny morfologie buněk po ošetření IPA byly hodnoceny transmisní elektronovou mikroskopií (TEM) a fázově kontrastní mikroskopií (doplňkový obrázek 6A-B). Jak se očekávalo, buňky ve skupině léčené TGF-β1 se ve srovnání s kontrolní skupinou zvětšily (obrázek 6A,B), což vykazuje klasickou expanzi drsného endoplazmatického retikula (ER*) a fagolysozomů (P), což naznačuje aktivaci hematopoetických kmenových buněk (HSC) (doplňkový obrázek 6A). Ve srovnání se skupinou léčenou TGF-β1 se však ve skupině léčené kombinací TGF-β1 snížila velikost buněk, cytoplazmatická komplexita (obr. 6A,B) a obsah ER* (doplňkový obrázek 6A). Léčba IPA dále ve srovnání s kontrolní skupinou snížila velikost buněk, cytoplazmatickou komplexitu (obr. 6A,B), obsah P a ER* (doplňkový obrázek 6A). Kromě toho se obsah apoptotických buněk po 24 hodinách léčby IPA zvýšil ve srovnání s kontrolní skupinou (bílé šipky, doplňkový obr. 6B). Tyto výsledky dohromady naznačují, že 1 mM IPA může stimulovat apoptózu HSC a zvrátit změny morfologických parametrů buněk indukované TGF-β1, čímž reguluje velikost a komplexitu buněk, což může souviset s inaktivací HSC.
IPA mění velikost buněk a cytoplazmatickou komplexitu v buňkách LX-2. Reprezentativní snímky analýzy průtokovou cytometrií. Analýza použila strategii synchronizace specifickou pro buňky LX-2: SSC-A/FSC-A k definování buněčné populace, FSC-H/FSC-A k identifikaci dubletů a SSC-H/FSC-H pro analýzu velikosti a komplexity buněk. Buňky byly inkubovány s TGF-β1 (5 ng/ml) a 1 mM IPA v bezsérovém médiu po dobu 24 hodin. Buňky LX-2 byly rozděleny do levého dolního kvadrantu (SSC-H-/FSC-H-), levého horního kvadrantu (SSC-H+/FSC-H-), pravého dolního kvadrantu (SSC-H-/FSC-H+) a pravého horního kvadrantu (SSC-H+/FSC-H+) pro analýzu velikosti buněk a cytoplazmatické komplexity. B. Morfologie buněk byla analyzována průtokovou cytometrií za použití FSC-H (dopředný rozptyl, velikost buněk) a SSC-H (boční rozptyl, cytoplazmatická komplexita) (30 000 událostí). Data jsou prezentována jako průměr ± SD, n = 3 nezávislé experimenty. Statistická srovnání byla provedena pomocí jednofaktorové ANOVA a Bonferroniho post hoc testu. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 a ****p < 0,0001
Střevní metabolity, jako je IPA, se staly žhavým tématem výzkumu, což naznačuje, že by ve střevní mikrobiotě mohly být objeveny nové cíle. Je proto zajímavé, že IPA, metabolit, který jsme spojili s jaterní fibrózou u lidí [15], se u zvířecích modelů ukázal jako potenciální antifibrotická sloučenina [13, 14]. Zde poprvé demonstrujeme souvislost mezi sérovou hladinou IPA a globální jaterní transkriptomikou a metylací DNA u obézních jedinců bez diabetu 2. typu (T2D), přičemž zdůrazňujeme apoptózu, mitofagii a dlouhověkost, stejně jako možný kandidátní gen AKT1 regulující homeostázu jater. Další novinkou naší studie je, že jsme prokázali interakci léčby IPA s apoptózou, buněčnou morfologií, mitochondriální bioenergetikou a dynamikou v buňkách LX-2, což naznačuje nižší energetické spektrum, které posouvá fenotyp HSC směrem k inaktivaci, což činí IPA potenciálním kandidátem pro zlepšení jaterní fibrózy.
Zjistili jsme, že apoptóza, mitofagie a dlouhověkost byly nejdůležitějšími kanonickými dráhami obohacenými o jaterní geny spojené s cirkulujícím sérovým IPA. Narušení systému kontroly kvality mitochondrií (MQC) může vést k mitochondriální dysfunkci, mitofagii a apoptóze, a tím podporovat výskyt MASLD [33, 34]. Můžeme proto spekulovat, že IPA se může podílet na udržování buněčné dynamiky a mitochondriální integrity prostřednictvím apoptózy, mitofagie a dlouhověkosti v játrech. Naše data ukázala, že ve třech testech byly společné dva geny: YKT6 a AKT1. Za zmínku stojí, že YKT6 je protein SNARE zapojený do procesu fúze buněčných membrán. Hraje roli v autofagii a mitofagii tím, že na autofagosomu vytváří iniciační komplex s STX17 a SNAP29, čímž podporuje fúzi autofagosomů a lysozomů [35]. Ztráta funkce YKT6 navíc vede k narušené mitofagii [36], zatímco zvýšená regulace YKT6 je spojena s progresí hepatocelulárního karcinomu (HCC), což ukazuje zvýšené přežití buněk [37]. Na druhou stranu, AKT1 je nejdůležitější interagující gen a hraje důležitou roli v onemocněních jater, včetně signální dráhy PI3K/AKT, buněčného cyklu, migrace buněk, proliferace, fokální adheze, mitochondriální funkce a sekrece kolagenu [38–40]. Aktivovaná signální dráha PI3K/AKT může aktivovat hematopoetické kmenové buňky (HSC), což jsou buňky zodpovědné za produkci extracelulární matrix (ECM), a její dysregulace může přispívat k výskytu a progresi jaterní fibrózy [40]. Kromě toho je AKT jedním z klíčových faktorů přežití buněk, který inhibuje apoptózu buněk závislou na p53, a aktivace AKT může být spojena s inhibicí apoptózy jaterních buněk [41, 42]. Získané výsledky naznačují, že IPA se může podílet na apoptóze spojené s mitochondrií jater tím, že ovlivňuje rozhodování hepatocytů mezi vstupem do apoptózy nebo přežitím. Tyto účinky mohou být regulovány kandidátními geny AKT a/nebo YKT6, které jsou kritické pro homeostázu jater.
Naše výsledky ukázaly, že 1 mM IPA indukoval apoptózu a snížil mitochondriální dýchání v buňkách LX-2 nezávisle na léčbě TGF-β1. Je pozoruhodné, že apoptóza je hlavní cestou pro rozlišení fibrózy a aktivaci hematopoetických kmenových buněk (HSC) a je také klíčovou událostí v reverzibilní fyziologické reakci jaterní fibrózy [4, 43]. Obnova BHI v buňkách LX-2 po kombinované léčbě navíc poskytla nové poznatky o potenciální roli IPA v regulaci mitochondriální bioenergetiky. V klidových a neaktivních podmínkách hematopoetické buňky normálně využívají mitochondriální oxidativní fosforylaci k produkci ATP a mají nízkou metabolickou aktivitu. Na druhou stranu aktivace HSC zvyšuje mitochondriální dýchání a biosyntézu, aby kompenzovala energetické nároky vstupu do glykolytického stavu [44]. Skutečnost, že IPA neovlivnila metabolický potenciál a ECAR, naznačuje, že glykolytická dráha je méně prioritní. Podobně jiná studie ukázala, že 1 mM IPA byl schopen modulovat aktivitu mitochondriálního dýchacího řetězce v kardiomyocytech, lidské buněčné linii hepatocytů (Huh7) a lidských endoteliálních buňkách pupečníkové žíly (HUVEC); Nebyl však zjištěn žádný vliv IPA na glykolýzu v kardiomyocytech, což naznačuje, že IPA může ovlivňovat bioenergetiku jiných typů buněk [45]. Proto spekulujeme, že 1 mM IPA může působit jako mírný chemický rozpojovací činidlo, protože může významně snížit expresi fibrogenních genů, morfologii buněk a mitochondriální bioenergetiku, aniž by změnil množství mtDNA [46]. Mitochondriální rozpojovací činidla mohou inhibovat fibrózu indukovanou kulturou a aktivaci HSC [47] a snižovat produkci mitochondriálního ATP regulovanou nebo indukovanou určitými proteiny, jako jsou rozpojovací proteiny (UCP) nebo adenin nukleotidová translokáza (ANT). V závislosti na typu buňky může tento jev chránit buňky před apoptózou a/nebo apoptózu podporovat [46]. Pro objasnění role IPA jako mitochondriálního rozpojovacího činidla v inaktivaci hematopoetických kmenových buněk jsou však zapotřebí další studie.
Poté jsme zkoumali, zda se změny v mitochondriálním dýchání odrážejí v mitochondriální morfologii živých buněk LX-2. Je zajímavé, že léčba TGF-β1 mění mitochondriální poměr ze sférického na střední, se sníženým větvením mitochondrií a zvýšenou expresí DRP1, klíčového faktoru v mitochondriálním štěpení [48]. Fragmentace mitochondrií je navíc spojena s celkovou složitostí sítě a přechod z fúze do štěpení je kritický pro aktivaci hematopoetických kmenových buněk (HSC), zatímco inhibice mitochondriálního štěpení vede k apoptóze HSC [49]. Naše výsledky tedy naznačují, že léčba TGF-β1 může indukovat snížení složitosti mitochondriální sítě se sníženým větvením, což je častější u mitochondriálního štěpení spojeného s aktivovanými hematopoetickými kmenovými buňkami (HSC). Naše data dále ukázala, že IPA by mohla změnit poměr mitochondrií ze sférického na střední tvar, čímž by se snížila exprese OPA1 a MFN2. Studie ukázaly, že downregulace OPA1 by mohla způsobit snížení mitochondriálního membránového potenciálu a spustit apoptózu buněk [50]. Je známo, že MFN2 zprostředkovává mitochondriální fúzi a apoptózu [51]. Získané výsledky naznačují, že indukce buněk LX-2 pomocí TGF-β1 a/nebo IPA zřejmě moduluje tvar a velikost mitochondrií, stejně jako stav aktivace a složitost sítě.
Naše výsledky naznačují, že kombinovaná léčba TGFβ-1 a IPA by mohla snížit mtDNA a morfologické parametry buněk regulací exprese mRNA genů fibrózy, apoptózy a genů souvisejících s přežitím v buňkách vyhýbajících se apoptóze. IPA skutečně snížila hladinu exprese mRNA AKT1 a důležitých genů fibrózy, jako jsou COL1A2 a MMP2, ale zvýšila hladinu exprese CASP8, který je spojen s apoptózou. Naše výsledky ukázaly, že po léčbě IPA se exprese BAX snížila a exprese mRNA podjednotek rodiny TIMP1, BCL-2 a NF-κB zvýšila, což naznačuje, že IPA by mohla stimulovat signály přežití v hematopoetických kmenových buňkách (HSC), které se apoptóze vyhýbají. Tyto molekuly mohou působit jako pro-survival signály v aktivovaných hematopoetických kmenových buňkách, což může být spojeno se zvýšenou expresí antiapoptotických proteinů (jako je Bcl-2), sníženou expresí proapoptotického BAX a komplexní interakcí mezi TIMP a NF-κB [5, 7]. IPA vyvíjí své účinky prostřednictvím PXR a zjistili jsme, že kombinovaná léčba s TGF-β1 a IPA zvýšila hladiny exprese mRNA PXR, což naznačuje potlačení aktivace HSC. Je známo, že aktivovaná signalizace PXR inhibuje aktivaci HSC jak in vivo, tak in vitro [52, 53]. Naše výsledky naznačují, že IPA se může podílet na clearance aktivovaných HSC podporou apoptózy, snížením fibrózy a mitochondriálního metabolismu a zesílením signálů přežití, což jsou typické procesy, které převádějí aktivovaný fenotyp HSC na inaktivovaný. Dalším možným vysvětlením potenciálního mechanismu a role IPA v apoptóze je, že vychytává dysfunkční mitochondrie primárně prostřednictvím mitofagie (vnitřní dráha) a vnější signální dráhy TNF (tabulka 1), která je přímo spojena se signální dráhou přežití NF-κB (doplňkový obrázek 7). Je zajímavé, že geny obohacené o IPA jsou schopny indukovat proapoptotické a pro-survivalové signály v apoptotické dráze [54], což naznačuje, že IPA může indukovat apoptotickou dráhu nebo přežití interakcí s těmito geny. Nicméně, jak IPA indukuje apoptózu nebo přežití během aktivace HSC a jaké jsou její mechanistické dráhy, zůstává nejasné.
IPA je mikrobiální metabolit, který vzniká z tryptofanu v potravě prostřednictvím střevní mikrobioty. Studie prokázaly, že má protizánětlivé, antioxidační a epigenetické regulační vlastnosti ve střevním prostředí.[55] Studie ukázaly, že IPA může modulovat funkci střevní bariéry a snižovat oxidační stres, což může přispívat k jeho lokálním fyziologickým účinkům.[56] IPA je ve skutečnosti transportován do cílových orgánů prostřednictvím oběhu a vzhledem k tomu, že IPA sdílí podobnou strukturu hlavních metabolitů s tryptofanem, serotoninem a deriváty indolu, vyvíjí metabolické účinky, které vedou ke kompetitivnímu metabolickému osudu.[52] IPA může soutěžit s metabolity odvozenými od tryptofanu o vazebná místa na enzymech nebo receptorech, což může potenciálně narušovat normální metabolické dráhy. To zdůrazňuje potřebu dalších studií jeho farmakokinetiky a farmakodynamiky, abychom lépe pochopili jeho terapeutické okno.[57] Zda se to může vyskytovat i v hematopoetických kmenových buňkách (HSC), se teprve uvidí.
Uznáváme, že naše studie má určitá omezení. Abychom konkrétně prozkoumali souvislosti související s IPA, vyloučili jsme pacienty s diabetem mellitus 2. typu (DM2). Uznáváme, že to omezuje širokou použitelnost našich zjištění na pacienty s diabetem mellitus 2. typu a pokročilým onemocněním jater. Přestože fyziologická koncentrace IPA v lidském séru je 1–10 μM [11, 20], byla zvolena koncentrace 1 mM IPA na základě nejvyšší netoxické koncentrace [15] a nejvyšší míry apoptózy, bez rozdílu v procentuálním zastoupení populace nekrotických buněk. Ačkoli byly v této studii použity suprafyziologické hladiny IPA, v současné době neexistuje shoda ohledně účinné dávky IPA [52]. Přestože jsou naše výsledky významné, širší metabolický osud IPA zůstává aktivní oblastí výzkumu. Naše zjištění o souvislosti mezi hladinami IPA v séru a metylací DNA jaterních transkriptů byla navíc získána nejen z hematopoetických kmenových buněk (HSC), ale také z jaterních tkání. Na základě našich předchozích zjištění z analýzy transkriptomů, že IPA je spojena s aktivací hematopoetických kmenových buněk (HSC) [15] a HSC jsou hlavními buňkami zapojenými do progrese jaterní fibrózy, jsme se rozhodli použít lidské buňky LX-2. Játra se skládají z mnoha buněčných typů, takže pro studium role IPA a její interakce s jinými typy jaterních buněk by měly být zváženy i jiné buněčné modely, jako je systém kokultivace hepatocytů-HSC-imunitních buněk v kombinaci s aktivací kaspáz a fragmentací DNA, jakož i mechanismus účinku včetně hladiny proteinů.