Děkujeme za návštěvu webu nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat nejnovější verzi prohlížeče (nebo vypnout režim kompatibility v prohlížeči Internet Explorer). Abychom zajistili trvalou podporu, tento web nebude obsahovat styly ani JavaScript.
Sirovodík (H2S) má na lidský organismus řadu fyziologických a patologických účinků. Sirník sodný (NaHS) se široce používá jako farmakologický nástroj pro hodnocení účinků H2S v biologických experimentech. Ačkoli ztráta H2S z roztoků NaHS trvá jen několik minut, roztoky NaHS byly v některých studiích na zvířatech použity jako donorové sloučeniny pro H2S v pitné vodě. Tato studie zkoumala, zda pitná voda s koncentrací NaHS 30 μM připravená v lahvích pro potkanů/myší může zůstat stabilní po dobu alespoň 12–24 hodin, jak navrhují někteří autoři. Připravte roztok NaHS (30 μM) v pitné vodě a ihned jej nalijte do lahví s vodou pro potkanů/myší. Vzorky byly odebrány ze špičky a vnitřku lahve s vodou v čase 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 a 24 hodin za účelem měření obsahu sulfidů metodou s methylenovou modří. Kromě toho byl samcům a samicím potkanů ​​po dobu dvou týdnů injekčně aplikován NaHS (30 μM) a koncentrace sulfidů v séru byly měřeny obden během prvního týdne a na konci druhého týdne. Roztok NaHS ve vzorku odebraném z hrotu lahve s vodou byl nestabilní; po 12 a 24 hodinách se snížil o 72 %, respektive o 75 %. Ve vzorcích odebraných z vnitřku lahví s vodou nebyl pokles NaHS do 2 hodin významný; po 12 a 24 hodinách se však snížil o 47 %, respektive o 72 %. Injekce NaHS neovlivnila hladinu sulfidů v séru u samců a samic potkanů. Závěrem lze říci, že roztoky NaHS připravené z pitné vody by se neměly používat k darování H2S, protože roztok je nestabilní. Tato cesta podání vystaví zvířata nepravidelnému a menšímu než očekávanému množství NaHS.
Sirovodík (H2S) se používá jako toxin již od roku 1700; jeho možnou roli jako endogenní biosignální molekuly však popsali Abe a Kimura v roce 1996. Během posledních tří desetiletí byly objasněny četné funkce H2S v různých lidských systémech, což vedlo k poznání, že donorové molekuly H2S mohou mít klinické uplatnění při léčbě nebo zvládání určitých onemocnění; viz nedávný přehled Chirino et al.
Hydrogensulfid sodný (NaHS) se široce používá jako farmakologický nástroj k posouzení účinků H2S v mnoha studiích na buněčných kulturách a zvířatech5,6,7,8. NaHS však není ideálním donorem H2S, protože se v roztoku rychle přeměňuje na H2S/HS-, snadno se kontaminuje polysulfidy a snadno oxiduje a odpařuje4,9. V mnoha biologických experimentech se NaHS rozpouští ve vodě, což vede k pasivnímu odpařování a ztrátě H2S10,11,12, spontánní oxidaci H2S11,12,13 a fotolýze14. Sulfid v původním roztoku se v důsledku odpařování H2S11 velmi rychle ztrácí. V otevřené nádobě je poločas rozpadu (t1/2) H2S přibližně 5 minut a jeho koncentrace klesá přibližně o 13 % za minutu10. Ačkoli ztráta sirovodíku z roztoků NaHS trvá jen několik minut, některé studie na zvířatech používaly roztoky NaHS jako zdroj sirovodíku v pitné vodě po dobu 1–21 týdnů, přičemž roztok obsahující NaHS byl nahrazován každých 12–24 hodin.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Tato praxe není v souladu s principy vědeckého výzkumu, protože dávkování léků by mělo být založeno na jejich použití u jiných druhů, zejména u lidí.27
Preklinický výzkum v biomedicíně si klade za cíl zlepšit kvalitu péče o pacienty nebo výsledky léčby. Výsledky většiny studií na zvířatech však dosud nebyly přeneseny na člověka28,29,30. Jedním z důvodů tohoto translačního selhání je nedostatečná pozornost věnovaná metodologické kvalitě studií na zvířatech30. Cílem této studie proto bylo zjistit, zda 30 μM roztoky NaHS připravené v lahvích s vodou pro potkanů/myší mohou zůstat stabilní v pitné vodě po dobu 12–24 hodin, jak se tvrdí nebo navrhuje v některých studiích.
Všechny experimenty v této studii byly provedeny v souladu s publikovanými pokyny pro péči o laboratorní zvířata a jejich používání v Íránu31. Všechny experimentální zprávy v této studii se rovněž řídily pokyny ARRIVE32. Etická komise Ústavu endokrinních věd Lékařské univerzity Shahida Beheshtiho schválila všechny experimentální postupy v této studii.
Dihydrát octanu zinečnatého (CAS: 5970-45-6) a bezvodý chlorid železitý (CAS: 7705-08-0) byly zakoupeny od společnosti Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Francie). Hydroxid sulfidu sodného (CAS: 207683-19-0) a N,N-dimethyl-p-fenylendiamin (DMPD) (CAS: 535-47-0) byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Isofluran byl zakoupen od společnosti Piramal (Bethlehem, PA, USA). Kyselina chlorovodíková (HCl) byla zakoupena od společnosti Merck (Darmstadt, Německo).
Připravte roztok NaHS (30 μM) v pitné vodě a ihned jej nalijte do lahví s vodou pro krysy/myši. Tato koncentrace byla zvolena na základě četných publikací používajících NaHS jako zdroj H2S; viz část Diskuse. NaHS je hydratovaná molekula, která může obsahovat různá množství hydratační vody (tj. NaHS•xH2O); podle výrobce bylo procento NaHS použité v naší studii 70,7 % (tj. NaHS•1,3 H2O) a tuto hodnotu jsme zohlednili v našich výpočtech, kde jsme použili molekulovou hmotnost 56,06 g/mol, což je molekulová hmotnost bezvodého NaHS. Hydratační voda (nazývaná také krystalická voda) jsou molekuly vody, které tvoří krystalickou strukturu33. Hydráty mají ve srovnání s anhydráty odlišné fyzikální a termodynamické vlastnosti34.
Před přidáním NaHS do pitné vody změřte pH a teplotu rozpouštědla. Roztok NaHS ihned nalijte do láhve s vodou pro krysy/myši v kleci pro zvířata. Vzorky byly odebrány z hrotu a z vnitřku láhve s vodou v čase 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 a 24 hodin pro měření obsahu sulfidů. Měření sulfidů byla provedena ihned po každém odběru vzorku. Vzorky jsme odebrali z hrotu zkumavky, protože některé studie ukázaly, že malá velikost pórů ve vodní zkumavce může minimalizovat odpařování H2S15,19. Zdá se, že tento problém se týká i roztoku v láhvi. To však neplatilo pro roztok v hrdle láhve s vodou, který měl vyšší rychlost odpařování a autooxidoval; zvířata ve skutečnosti tuto vodu vypila jako první.
Ve studii byli použiti samci a samice potkanů ​​kmene Wistar. Potkani byli chováni v polypropylenových klecích (2–3 potkani na klec) za standardních podmínek (teplota 21–26 °C, vlhkost 32–40 %) s 12 hodinami světla (7:00 až 19:00) a 12 hodinami tmy (19:00 až 7:00). Potkani měli volný přístup k vodě z vodovodu a byli krmeni standardním krmivem (Khorak Dam Pars Company, Teherán, Írán). Věkově odpovídající (6 měsíců) samice (n=10, tělesná hmotnost: 190–230 g) a samci (n=10, tělesná hmotnost: 320–370 g) potkanů ​​Wistar byli náhodně rozděleni do kontrolní skupiny a skupiny ošetřené NaHS (30 μM) (n=5 na skupinu). Pro určení velikosti vzorku jsme použili přístup KISS (Keep It Simple, Stupid), který kombinuje předchozí zkušenosti a analýzu síly testu35. Nejprve jsme provedli pilotní studii na 3 krysách a stanovili průměrnou hladinu celkového sulfidu v séru a směrodatnou odchylku (8,1 ± 0,81 μM). Poté jsme s ohledem na 80% sílu testu a za předpokladu oboustranné 5% hladiny významnosti stanovili předběžnou velikost vzorku (n = 5 na základě předchozí literatury), která odpovídala standardizované velikosti účinku 2,02 s předem definovanou hodnotou navrženou Festingem pro výpočet velikosti vzorku experimentálních zvířat35. Po vynásobení této hodnoty směrodatnou odchylkou (2,02 × 0,81) byla předpokládaná detekovatelná velikost účinku (1,6 μM) 20 %, což je přijatelné. To znamená, že n = 5/skupina je dostatečná k detekci 20% průměrné změny mezi skupinami. Krysy byly náhodně rozděleny do kontrolní skupiny a skupiny ošetřené NaSH pomocí náhodné funkce softwaru Excel36 (doplňkový obrázek 1). Zaslepení bylo provedeno na úrovni výsledků a výzkumníci provádějící biochemická měření si nebyli vědomi zařazení do skupin.
Skupiny obou pohlaví s NaHS byly po dobu 2 týdnů léčeny 30 μM roztokem NaHS připraveným v pitné vodě; čerstvý roztok byl dodáván každých 24 hodin, během nichž byla měřena tělesná hmotnost. Vzorky krve byly odebrány z konečků ocasů všech krys v isofluranové anestezii obden na konci prvního a druhého týdne. Vzorky krve byly centrifugovány při 3000 g po dobu 10 minut, sérum bylo odděleno a uloženo při teplotě –80 °C pro následné měření močoviny v séru, kreatininu (Cr) a celkového sulfidu. Močovina v séru byla stanovena enzymatickou ureázovou metodou a kreatinin v séru byl stanoven fotometrickou Jaffeho metodou za použití komerčně dostupných souprav (Man Company, Teherán, Írán) a automatického analyzátoru (Selectra E, sériové číslo 0-2124, Nizozemsko). Variační koeficienty pro močovinu a Cr v rámci testu a mezi testy byly menší než 2,5 %.
Metoda s methylenovou modří (MB) se používá k měření celkového množství sulfidů v pitné vodě a séru obsahujícím NaHS; MB je nejčastěji používanou metodou pro měření sulfidů v objemových roztocích a biologických vzorcích11,37. Metodu MB lze použít k odhadu celkového množství sulfidů38 a k měření anorganických sulfidů ve formě H2S, HS- a S2 ve vodné fázi39. Při této metodě se síra sráží jako sulfid zinečnatý (ZnS) za přítomnosti octanu zinečnatého11,38. Srážení octanem zinečnatým je nejrozšířenější metodou pro separaci sulfidů od ostatních chromoforů11. ZnS byl znovu rozpuštěn pomocí HCl11 za silně kyselých podmínek. Sulfid reaguje s DMPD ve stechiometrickém poměru 1:2 v reakci katalyzované chloridem železitým (Fe3+ působí jako oxidační činidlo) za vzniku barviva MB, které je detekováno spektrofotometricky při 670 nm40,41. Detekční limit metody MB je přibližně 1 μM11.
V této studii bylo do zkumavky přidáno 100 μl každého vzorku (roztoku nebo séra); poté bylo přidáno 200 μl octanu zinečnatého (1% hm./obj. v destilované vodě), 100 μl DMPD (20 mM v 7,2 M HCl) a 133 μl FeCl3 (30 mM v 1,2 M HCl). Směs byla inkubována při 37 °C ve tmě po dobu 30 minut. Roztok byl centrifugován při 10 000 g po dobu 10 minut a absorbance supernatantu byla odečtena při 670 nm pomocí čtečky mikrodestiček (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Koncentrace sulfidů byly stanoveny pomocí kalibrační křivky NaHS (0–100 μM) v ddH2O (doplňkový obrázek 2). Všechny roztoky použité pro měření byly čerstvě připraveny. Variační koeficienty v rámci testů a mezi testy pro měření sulfidů byly 2,8 %, respektive 3,4 %. Celkové množství sulfidů získaných ze vzorků pitné vody a séra obsahujících thiosíran sodný jsme také stanovili pomocí metody obohacených vzorků42. Výtěžnost vzorků pitné vody a séra obsahujících thiosíran sodný byla 91 ± 1,1 % (n = 6) a 93 ± 2,4 % (n = 6).
Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru GraphPad Prism verze 8.0.2 pro Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). Pro porovnání teploty a pH pitné vody před a po přidání NaHS byl použit párový t-test. Úbytek H2S v roztoku obsahujícím NaHS byl vypočítán jako procentuální pokles oproti výchozímu příjmu a pro posouzení, zda byl úbytek statisticky významný, jsme provedli jednocestnou ANOVA s opakovanými měřeními následovanou Dunnettovým testem vícenásobného srovnání. Tělesná hmotnost, močovina v séru, kreatinin v séru a celkový sulfid v séru v průběhu času byly porovnány u kontrolních a NaHS ošetřených potkanů ​​různého pohlaví pomocí oboucestné smíšené (mezi-v rámci) ANOVA následované Bonferroniho post hoc testem. Dvoustranné hodnoty P < 0,05 byly považovány za statisticky významné.
Hodnota pH pitné vody byla před přidáním NaHS 7,60 ± 0,01 a po přidání NaHS 7,71 ± 0,03 (n = 13, p = 0,0029). Teplota pitné vody byla 26,5 ± 0,2 a po přidání NaHS klesla na 26,2 ± 0,2 (n = 13, p = 0,0128). Připravte 30 μM roztok NaHS v pitné vodě a uložte jej do lahve na vodu. Roztok NaHS je nestabilní a jeho koncentrace v průběhu času klesá. Při odběru vzorku z hrdla lahve na vodu byl pozorován významný pokles (68,0 %) během první hodiny a obsah NaHS v roztoku se snížil o 72 %, respektive 75 % po 12 a 24 hodinách. Ve vzorcích odebraných z lahví na vodu nebyl pokles NaHS významný až do 2 hodin, ale po 12 a 24 hodinách se snížil o 47 %, respektive 72 %. Tato data naznačují, že procento NaHS v 30 μM roztoku připraveném v pitné vodě se po 24 hodinách snížilo přibližně na čtvrtinu původní hodnoty, bez ohledu na místo odběru vzorků (obrázek 1).
Stabilita roztoku NaHS (30 μM) v pitné vodě v lahvích pro krysy/myši. Po přípravě roztoku byly odebrány vzorky z hrotu a vnitřku lahve na vodu. Data jsou prezentována jako průměr ± SD (n = 6/skupina). * a #, P < 0,05 ve srovnání s časem 0. Fotografie lahve na vodu ukazuje hrot (s otvorem) a tělo lahve. Objem hrotu je přibližně 740 μl.
Koncentrace NaHS v čerstvě připraveném 30 μM roztoku byla 30,3 ± 0,4 μM (rozsah: 28,7–31,9 μM, n = 12). Po 24 hodinách se však koncentrace NaHS snížila na nižší hodnotu (průměr: 3,0 ± 0,6 μM). Jak je znázorněno na obrázku 2, koncentrace NaHS, kterým byly krysy vystaveny, nebyly během sledovaného období konstantní.
Tělesná hmotnost samic potkanů ​​se v průběhu času významně zvýšila (z 205,2 ± 5,2 g na 213,8 ​​± 7,0 g v kontrolní skupině a z 204,0 ± 8,6 g na 211,8 ± 7,5 g ve skupině léčené NaHS); léčba NaHS však neměla žádný vliv na tělesnou hmotnost (obr. 3). Tělesná hmotnost samců potkanů ​​se v průběhu času významně zvýšila (z 338,6 ± 8,3 g na 352,4 ± 6,0 g v kontrolní skupině a z 352,4 ± 5,9 g na 363,2 ± 4,3 g ve skupině léčené NaHS); léčba NaHS však neměla žádný vliv na tělesnou hmotnost (obr. 3).
Změny tělesné hmotnosti samic a samců potkanů ​​po podání NaHS (30 μM). Data jsou prezentována jako průměr ± SEM a byla porovnána pomocí obousměrné smíšené (mezihodnoty) analýzy rozptylu s Bonferroniho post hoc testem. n = 5 každého pohlaví v každé skupině.
Koncentrace močoviny a kreatinfosfátu v séru byly u kontrolních potkanů ​​a potkanů ​​léčených NaSH v průběhu celé studie srovnatelné. Léčba NaSH navíc neovlivnila koncentrace močoviny a kreatinfosfátu v séru (tabulka 1).
Výchozí koncentrace celkového sulfidu v séru byly srovnatelné u kontrolních potkanů ​​a potkanů ​​ošetřených NaHS u samců (8,1 ± 0,5 μM vs. 9,3 ± 0,2 μM) a samic (9,1 ± 1,0 μM vs. 6,1 ± 1,1 μM). Podávání NaHS po dobu 14 dnů nemělo žádný vliv na hladiny celkového sulfidu v séru ani u samců, ani u samic potkanů ​​(obr. 4).
Změny koncentrací celkového sulfidu v séru u samců a samic potkanů ​​po podání NaHS (30 μM). Data jsou prezentována jako průměr ± SEM a byla porovnána pomocí obousměrné smíšené (within-within) analýzy rozptylu s Bonferroniho post hoc testem. Každé pohlaví, n = 5/skupina.
Hlavním závěrem této studie je, že pitná voda obsahující NaHS je nestabilní: 24 hodin po odběru vzorku z hrotu a uvnitř lahví s vodou pro krysy/myši lze detekovat pouze asi čtvrtinu počátečního celkového obsahu sulfidů. Kromě toho byly krysy vystaveny nestabilním koncentracím NaHS v důsledku ztráty H2S v roztoku NaHS a přidání NaHS do pitné vody neovlivnilo tělesnou hmotnost, hladinu močoviny a kreatinchromu v séru ani celkový obsah sulfidů v séru.
V této studii byla rychlost ztráty H2S z 30 μM roztoků NaHS připravených v pitné vodě přibližně 3 % za hodinu. V pufrovaném roztoku (100 μM sulfidu sodného v 10 mM PBS, pH 7,4) byl hlášen pokles koncentrace sulfidu v průběhu 8 hodin o 7 %11. Dříve jsme obhajovali intraperitoneální podávání NaHS hlášením, že rychlost ztráty sulfidu z 54 μM roztoku NaHS v pitné vodě byla přibližně 2,3 % za hodinu (4 %/hodinu během prvních 12 hodin a 1,4 %/hodinu během posledních 12 hodin po přípravě)8. Dřívější studie43 zjistily konstantní ztrátu H2S z roztoků NaHS, primárně v důsledku odpařování a oxidace. I bez přidání bublin se sulfid v zásobním roztoku rychle ztrácí v důsledku odpařování H2S11. Studie ukázaly, že během procesu ředění, který trvá přibližně 30–60 sekund, se v důsledku odpařování ztrácí přibližně 5–10 % H2S6. Aby se zabránilo odpařování H2S z roztoku, vědci přijali několik opatření, včetně jemného míchání roztoku12, zakrytí zásobního roztoku plastovou fólií6 a minimalizace vystavení roztoku vzduchu, protože rychlost odpařování H2S závisí na rozhraní vzduch-kapalina.13 Spontánní oxidace H2S probíhá hlavně v důsledku iontů přechodných kovů, zejména železitého železa, které jsou nečistotami ve vodě.13 Oxidace H2S vede k tvorbě polysulfidů (atomů síry spojených kovalentními vazbami)11. Aby se zabránilo jeho oxidaci, roztoky obsahující H2S se připravují v deoxygenovaných rozpouštědlech44,45 a poté se proplachují argonem nebo dusíkem po dobu 20–30 minut, aby se zajistila deoxygenace.11,12,37,44,45,46 Kyselina diethylentriaminpentaoctová (DTPA) je chelátor kovů (10–4 M), který zabraňuje autooxidaci HS v aerobních roztocích. V nepřítomnosti DTPA je rychlost autooxidace HS- přibližně 50 % během přibližně 3 hodin při 25 °C37,47. Vzhledem k tomu, že oxidace 1e-sulfidu je katalyzována ultrafialovým světlem, měl by být roztok skladován na ledu a chráněn před světlem11.
Jak je znázorněno na obrázku 5, NaHS se po rozpuštění ve vodě disociuje na Na+ a HS-6; tato disociace je určena hodnotou pK1 reakce, která je závislá na teplotě: pK1 = 3,122 + 1132/T, kde T se pohybuje od 5 do 30 °C a měří se ve stupních Kelvina (K), K = °C + 273,1548. HS- má vysokou hodnotu pK2 (pK2 = 19), takže při pH < 96,49 se S2- netvoří nebo se tvoří ve velmi malém množství. Naproti tomu HS- působí jako báze a přijímá H+ z molekuly H2O a H2O působí jako kyselina a přeměňuje se na H2S a OH-.
Tvorba rozpuštěného plynu H2S v roztoku NaHS (30 µM). aq, vodný roztok; g, plyn; l, kapalina. Všechny výpočty předpokládají pH vody = 7,0 a teplotu vody = 20 °C. Vytvořeno pomocí BioRender.com.
Navzdory důkazům o nestabilnosti roztoků NaHS bylo v několika studiích na zvířatech použito roztoků NaHS v pitné vodě jako donorové sloučeniny H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 s dobou intervence od 1 do 21 týdnů (tabulka 2). Během těchto studií byl roztok NaHS obnovován každých 12 hodin, 15, 17, 18, 24, 25 hodin nebo 24 hodin, 19, 20, 21, 22, 23 hodin. Naše výsledky ukázaly, že krysy byly vystaveny nestabilním koncentracím léčiva v důsledku ztráty H2S z roztoku NaHS a obsah NaHS v pitné vodě krys významně kolísal během 12 nebo 24 hodin (viz obrázek 2). Dvě z těchto studií uváděly, že hladiny H2S ve vodě zůstaly stabilní po dobu 24 hodin22 nebo že byly pozorovány pouze 2–3% ztráty H2S po dobu 12 hodin15, ale neposkytly podpůrné údaje ani podrobnosti o měření. Dvě studie ukázaly, že malý průměr lahví na vodu může minimalizovat odpařování H2S15,19. Naše výsledky však ukázaly, že to může zpozdit ztrátu H2S z lahve na vodu pouze o 2 hodiny, nikoli o 12–24 hodin. Obě studie uvádějí, že předpokládáme, že se hladina NaHS v pitné vodě nezměnila, protože jsme nepozorovali změnu barvy vody; oxidace H2S vzduchem proto nebyla významná19,20. Překvapivě tato subjektivní metoda hodnotí stabilitu NaHS ve vodě, spíše než měří změnu jeho koncentrace v čase.
Ztráta H2S v roztoku NaHS souvisí s pH a teplotou. Jak je uvedeno v naší studii, rozpouštění NaHS ve vodě vede k tvorbě alkalického roztoku50. Když je NaHS rozpuštěn ve vodě, tvorba rozpuštěného plynu H2S závisí na hodnotě pH6. Čím nižší je pH roztoku, tím větší je podíl NaHS přítomného ve formě molekul plynu H2S a tím více sulfidu se z vodného roztoku ztrácí11. Žádná z těchto studií neuváděla pH pitné vody použité jako rozpouštědlo pro NaHS. Podle doporučení WHO, která přijímá většina zemí, by pH pitné vody mělo být v rozmezí 6,5–8,551. V tomto rozmezí pH se rychlost spontánní oxidace H2S zvyšuje přibližně desetinásobně13. Rozpouštění NaHS ve vodě v tomto rozmezí pH povede ke koncentraci rozpuštěného plynu H2S 1 až 22,5 μM, což zdůrazňuje důležitost sledování pH vody před rozpuštěním NaHS. Kromě toho by teplotní rozsah uvedený ve výše uvedené studii (18–26 °C) vedl ke změně koncentrace rozpuštěného plynu H2S v roztoku přibližně o 10 %, protože změny teploty mění pK1 a malé změny pK1 mohou mít významný vliv na koncentraci rozpuštěného plynu H2S48. Kromě toho tento problém zhoršuje i dlouhá doba trvání některých studií (5 měsíců)22, během níž se očekává velká teplotní variabilita.
Všechny studie kromě jedné21 použily 30 μM roztok NaHS v pitné vodě. Pro vysvětlení použité dávky (tj. 30 μM) někteří autoři poukázali na to, že NaHS ve vodné fázi produkuje přesně stejnou koncentraci plynu H2S a že fyziologický rozsah H2S je 10 až 100 μM, takže tato dávka je ve fyziologickém rozmezí15,16. Jiní vysvětlili, že 30 μM NaHS dokáže udržet hladinu H2S v plazmě ve fyziologickém rozmezí, tj. 5–300 μM19,20. Uvažujeme koncentraci NaHS ve vodě 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), která byla použita v některých studiích ke studiu účinků H2S. Můžeme vypočítat, že koncentrace rozpuštěného plynu H2S je 14,7 μM, což je asi 50 % počáteční koncentrace NaHS. Tato hodnota je podobná hodnotě vypočítané jinými autory za stejných podmínek13,48.
V naší studii podávání NaHS nezměnilo tělesnou hmotnost; tento výsledek je v souladu s výsledky jiných studií u samců myší22,23 a samců potkanů18; Dvě studie však uvádějí, že NaSH obnovil sníženou tělesnou hmotnost u nefrektomizovaných potkanů24,26, zatímco jiné studie neuváděly vliv podávání NaSH na tělesnou hmotnost15,16,17,19,20,21,25. Navíc v naší studii podávání NaSH neovlivnilo hladiny močoviny a kreatin-chromu v séru, což je v souladu s výsledky jiné zprávy25.
Studie zjistila, že přidání NaHS do pitné vody po dobu 2 týdnů neovlivnilo celkové koncentrace sulfidů v séru u samců a samic potkanů. Toto zjištění je v souladu s výsledky Sen et al. (16): 8 týdnů léčby 30 μM NaHS v pitné vodě neovlivnilo hladiny sulfidů v plazmě u kontrolních potkanů; nicméně uvedli, že tento zásah obnovil snížené hladiny H2S v plazmě myší po nefrektomii. Li et al. (22) také uvedli, že léčba 30 μM NaHS v pitné vodě po dobu 5 měsíců zvýšila hladiny volných sulfidů v plazmě u starých myší přibližně o 26 %. Jiné studie nezaznamenaly změny v cirkulujícím sulfidu po přidání NaHS do pitné vody.
Sedm studií uvádělo použití Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, ale neposkytlo další podrobnosti o hydratační vodě a pět studií neuvedlo zdroj NaHS použitého v jejich metodách přípravy17,18,24,25,26. NaHS je hydratovaná molekula a její obsah hydratační vody se může lišit, což ovlivňuje množství NaHS potřebné k přípravě roztoku dané molarity. Například obsah NaHS v naší studii byl NaHS•1,3 H2O. Skutečné koncentrace NaHS v těchto studiích tedy mohou být nižší než ty, které byly uváděny.
„Jak může mít tak krátkodobá sloučenina tak dlouhotrvající účinek?“ položili si tuto otázku Pozgay a kol.21 při hodnocení účinků NaHS na kolitidu u myší. Doufají, že budoucí studie budou schopny na tuto otázku odpovědět, a spekulují, že roztoky NaHS mohou obsahovat stabilnější polysulfidy kromě H2S a disulfidů, které zprostředkovávají účinek NaHS21. Další možností je, že velmi nízké koncentrace NaHS zůstávající v roztoku mohou mít také příznivý účinek. Olson a kol. dokonce poskytli důkazy o tom, že mikromolární hladiny H2S v krvi nejsou fyziologické a měly by být v nanomolárním rozmezí nebo by měly zcela chybět13. H2S může působit prostřednictvím sulfatace proteinů, reverzibilní posttranslační modifikace, která ovlivňuje funkci, stabilitu a lokalizaci mnoha proteinů52,53,54. Ve skutečnosti je za fyziologických podmínek sulfylováno přibližně 10 % až 25 % mnoha jaterních proteinů53. Obě studie uznávají rychlou destrukci NaHS19,23, ale překvapivě uvádějí, že „koncentraci NaHS v pitné vodě jsme kontrolovali jeho každodenní výměnou“.23 Jedna studie omylem uvedla, že „NaHS je standardní donor H2S a v klinické praxi se běžně používá k nahrazení samotného H2S“.18
Výše uvedená diskuse ukazuje, že NaHS se z roztoku ztrácí odpařováním, oxidací a fotolýzou, a proto se předkládají určitá doporučení ke snížení ztrát H2S z roztoku. Zaprvé, odpařování H2S závisí na rozhraní plyn-kapalina13 a pH roztoku11; proto, aby se minimalizovaly ztráty odpařováním, lze hrdlo láhve na vodu co nejvíce zmenšit, jak bylo popsáno dříve15,19, a pH vody lze upravit na přijatelnou horní mez (tj. 6,5–8,551), aby se minimalizovaly ztráty odpařováním11. Zadruhé, ke spontánní oxidaci H2S dochází v důsledku účinků kyslíku a přítomnosti iontů přechodných kovů v pitné vodě13, takže deoxygenace pitné vody argonem nebo dusíkem44,45 a použití chelátorů kovů37,47 může snížit oxidaci sulfidů. Zatřetí, aby se zabránilo fotorozkladu H2S, lze láhve na vodu zabalit do hliníkové fólie; Tato praxe platí i pro světlocitlivé materiály, jako je streptozotocin55. A konečně, anorganické sulfidové soli (NaHS, Na2S a CaS) lze podávat sondou, nikoli rozpuštěné v pitné vodě, jak bylo dříve popsáno56,57,58; studie ukázaly, že radioaktivní sulfid sodný podávaný potkanům sondou je dobře absorbován a distribuován prakticky do všech tkání59. Dosud většina studií podávala anorganické sulfidové soli intraperitoneálně; tato cesta se však v klinickém prostředí používá jen zřídka60. Na druhou stranu je orální cesta nejběžnější a preferovanou cestou podání u lidí61. Proto doporučujeme vyhodnotit účinky donorů H2S u hlodavců orální sondou.
Omezením je, že jsme sulfidy ve vodném roztoku a séru měřili metodou MB. Mezi metody pro měření sulfidů patří jodová titrace, spektrofotometrie, elektrochemická metoda (potenciometrie, amperometrie, coulometrická metoda a amperometrická metoda) a chromatografie (plynová chromatografie a vysokoúčinná kapalinová chromatografie), z nichž nejčastěji používanou metodou je spektrofotometrická metoda MB62. Omezením metody MB pro měření H2S v biologických vzorcích je, že měří všechny sloučeniny obsahující síru a nikoli volný H2S63, protože se provádí za kyselých podmínek, což vede k extrakci síry z biologického zdroje64. Podle Americké asociace veřejného zdraví je však MB standardní metodou pro měření sulfidů ve vodě65. Toto omezení proto neovlivňuje naše hlavní výsledky týkající se nestability roztoků obsahujících NaHS. V naší studii byla navíc výtěžnost měření sulfidů ve vzorcích vody a séra obsahujících NaHS 91 %, respektive 93 %. Tyto hodnoty jsou v souladu s dříve publikovanými rozmezími (77–92)66, což naznačuje přijatelnou analytickou přesnost42. Za zmínku stojí, že jsme v souladu s pokyny Národních institutů zdraví (NIH) použili samce i samice potkanů, abychom se v preklinických studiích vyhnuli nadměrnému spoléhání se na studie pouze na samcích zvířat67 a abychom, kdykoli je to možné, zahrnuli samce i samice potkanů68. Tento bod zdůraznili i další69,70,71.
Závěrem lze říci, že výsledky této studie naznačují, že roztoky NaHS připravené z pitné vody nelze použít k výrobě H2S kvůli jejich nestabilitě. Tato cesta podání by vystavila zvířata nestabilním a nižším než očekávaným hladinám NaHS; zjištění proto nemusí být použitelná pro člověka.
Datové soubory použité a/nebo analyzované během aktuální studie jsou k dispozici u příslušného autora na základě přiměřené žádosti.
Szabo, K. Časová osa výzkumu sirovodíku (H2S): od environmentálního toxinu k biologickému mediátoru. Biochemistry and Pharmacology 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. a Kimura, H. Možná role sirovodíku jako endogenního neuromodulátoru. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. a Papapetropoulos, A. Fyziologická role sirovodíku v buňkách, tkáních a orgánech savců. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB a Kashfi, K. Vyvíjející se potenciál buněčných systémů pro podávání oxidu dusnatého a sirovodíku: nová éra personalizované medicíny. Biochemistry and Pharmacology 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X. a kol. Dlouhodobé podávání donoru sirovodíku s pomalým uvolňováním může zabránit ischemickému/reperfuznímu poškození myokardu. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM a Hermann, A. Fosforylace BK kanálu reguluje citlivost na sirovodík (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM a Hermann, A. Sirovodík zvyšuje aktivitu vápníkem aktivovaných draslíkových (BK) kanálů v nádorových buňkách hypofýzy potkanů. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S. a kol. Sirovodík zvyšuje ochranný účinek dusitanů proti ischemicko-reperfuznímu poškození myokardu u potkanů ​​s diabetem 2. typu. Nitric Oxide 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A. a kol. Trendy v chemii donorů H2S a jejich vliv na kardiovaskulární onemocnění. Antioxidants 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF a Olson, KR (2012). Pasivní ztráty sirovodíku v biologických experimentech. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P. a kol. Chemické aspekty měření sirovodíku ve fyziologických vzorcích. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Spektrofotometrické stanovení sirovodíku v přírodních vodách. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Praktický výcvik v chemii a biologii sirovodíku. „Antioxidanty.“ Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).