Třídění proteinů v sekreční dráze je nezbytné pro udržení buněčné kompartmentalizace a homeostázy. Kromě třídění zprostředkovaného schránkou je role lipidů v třídění kinesinů v procesu sekrečního transportu dlouhodobou základní otázkou, která dosud nebyla zodpovězena. V této studii provádíme 3D simultánní vícebarevné zobrazování v reálném čase s vysokým rozlišením, abychom in vivo dokázali, že nově syntetizované proteiny imobilizované glykosylfosfatidylinositolem s velmi dlouhými ceramidovými lipidovými skupinami jsou shlukovány a klasifikovány do specializovaných exportních míst endoplazmat, která se liší od míst používaných transmembránovými proteiny. Dále ukazujeme, že délka řetězce ceramidu v membráně endoplazmatického retikula je pro tuto selektivitu třídění kritická. Naše studie poskytuje první přímý in vivo důkaz pro klasifikaci proteinových nákladů na základě délky lipidového řetězce do selektivních exportních míst v sekreční dráze.
V eukaryotických buňkách jsou proteiny syntetizované v endoplazmatickém retikulu (ER) během transportu sekreční cestou tříděny, aby byly doručeny do příslušného buněčného cíle (1). Kromě třídění zprostředkovaného pláštěm se dlouho spekulovalo, že určité lipidy mohou také sloužit jako selektivní výstupní body tím, že se shlukují do specifických membránových domén, které specifické proteiny (2-5). Stále však chybí přímé důkazy in vivo, které by prokázaly tento možný mechanismus založený na lipidech. Abychom tento základní problém vyřešili, studovali jsme na kvasinkách, jak jsou proteiny ukotvené glykosylfosfatidylinositolem (GPI) (GPI-AP) diferencovaně exportovány z ER. GPI-AP jsou různé lipidově vázané povrchové buněčné proteiny (6, 7). GPI-AP je sekretovaný protein připojený k vnějším cípům plazmatické membrány prostřednictvím glykolipidové skupiny (kotva GPI). Akceptují kotvy GPI jako konzervativní posttranslační modifikace v lumenu ER (8). Po připojení prochází GPI-AP Golgiho aparátem (5, 9) z ER do plazmatické membrány. Přítomnost GPI kotev způsobuje, že je GPI-AP transportován odděleně od transmembránově sekretovaných proteinů (včetně dalších proteinů plazmatické membrány) podél sekreční dráhy (5, 9, 10). V kvasinkových buňkách jsou GPI-AP odděleny od ostatních sekretovaných proteinů v endoplazmatickém retikulu a poté zabaleny do unikátních vezikul obalených komplexem plášťových proteinů II (COPII) (6, 7). Determinanty tohoto klasifikačního procesu v procesu exportu ER nejsou jasné, ale spekuluje se, že tento mechanismus může vyžadovat lipidy, zejména strukturní remodelace lipidové části GPI kotvy (5, 8). U kvasinek začíná lipidová remodelace GPI bezprostředně po připojení GPI a v mnoha případech způsobuje vazbu ceramidu na 26uhlíkovou nasycenou mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem (C26:0) (11, 12). Ceramid C26 je dosud hlavním ceramidem produkovaným kvasinkovými buňkami. Syntetizuje se v ER a většina z něj je exportována do Golgiho aparátu prostřednictvím vezikul COPII (13). Export GPI-AP z ER vyžaduje specificky probíhající syntézu ceramidu (14, 15) a následně přeměna ceramidu na inositolfosfátový ceramid (IPC) v Golgiho aparátu závisí na syntéze kotvy GPI (16). Biofyzikální studie s umělými membránami ukázaly, že ceramidy s velmi dlouhým acylovým řetězcem se mohou shlukovat a vytvářet uspořádané domény s jedinečnými fyzikálními vlastnostmi (17, 18). Tato data vedou k hypotéze, že ceramid C26 a GPI-AP s ceramidem C26 využívají své fyzikální vlastnosti ke shlukování do uspořádaných oblastí nebo oblastí v relativně chaotickém lipidovém prostředí membrány ER. Skládá se převážně z krátkých a nenasycených glycerolipidů (C16:1 a C18:1) (19, 20). Tyto oblasti budou selektivně zaměřeny na specifická výstupní místa ER (ERES), kde mohou být ceramid a GPI-AP na bázi ceramidu společně transportovány do Golgiho aparátu ve stejném vyhrazeném vezikulu COPII (5).
V této studii jsme přímo testovali tento mechanismus založený na lipidech pomocí super-rozlišovací konfokální zobrazovací mikroskopie v reálném čase (SCLIM), což je špičková mikroskopická technika, která umožňuje simultánní pozorování fluorescenčně značených proteinů. Trojbarevné a trojrozměrné (3D) obrazy mají v živých buňkách extrémně vysoké rozlišení a rychlost (21, 22).
Nejprve jsme aplikovali technologii SCLIM, abychom dále definovali, jak byl normální GPI-AP s ceramidovou skupinou C26 izolován od proteinů sekretovaných transmembránou po opuštění ER u S. cerevisiae. Abychom ověřili klasifikaci ER, použili jsme genetický systém, který dokáže přímo vizualizovat nově syntetizovaný náklad vstupující do ERES in vivo (7, 23). Jako náklad jsme zvolili GPI-AP Gas1 na bázi ceramidu C26 značený zeleným fluorescenčním proteinem (GFP) a transmembránově sekretovaný protein Mid2 značený fluorescenčním proteinem blízké infračervené oblasti (iRFP), přičemž oba cílí na plazmatickou membránu (24–26). U teplotně citlivého mutanta sec31-1 jsou tyto dva náklady exprimovány pod galaktózou indukovatelným promotorem a konstitutivním markerem ERES. Při extrémní teplotě (37 °C), protože mutace sec31-1 ovlivňuje funkci plášťové složky COPII Sec31 inhibovat klíčení COPII a export ER, se nově syntetizovaný náklad hromadí v ER (23). Po ochlazení na nízkou teplotu (24 °C) se mutantní buňky sec31-1 zotavily ze sekreční oblasti a nahromaděný nový syntetický náklad začal být exportován z ER. Vizualizace CLIM ukázala, že většina nově syntetizovaného Gas1-GFP a Mid2-iRFP se stále akumulovala v ER mutantních buněk sec31-1 po inkubaci při 37 °C a poté byla uvolněna při 24 °C po dobu 5 minut (obrázek 1). Vzhledem k tomu, že Mid2-iRFP je distribuován po celé membráně ER a Gas1-GFP je koncentrován a shromažďován v nespojité oblasti membrány ER, je jejich distribuce zcela odlišná (obrázek 1, A až C a video S1). Kromě toho, jak je znázorněno na obrázku 1D, klastr Gas1-GFP neobsahuje Mid2-iRFP. Tyto výsledky naznačují, že GPI-AP a transmembránové proteiny byly brzy odděleny do různých oblastí membrány ER. Klastr Gas1-GFP sousedí se specifickým ERES značeným plášťovým proteinem mCherry COPII Sec13 (obrázek 1, E a F a video S1) (23).
Buňky sec31-1 exprimují galaktózou indukované sekrece, ceramid GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, zelená) s dlouhým acylovým řetězcem (C26) a transmembránový protein Mid2-iRFP (TMP, modrá). Toto konstruktivní ERES značení Sec13-mCherry (ERES, purpurová) bylo inkubováno při 37 °C po dobu 30 minut, přemístěno na 24 °C a o 5 minut později zobrazeno pomocí SCLIM. (A až C) ukazuje reprezentativní sloučený nebo jednotlivý 2D obraz roviny (A), 2D projekční obraz 10 Z-řezů (B) nebo 3D obraz buněčné hemisféry markerů cargo a ERES (C). Měřítko 1 μm (A a B). Jednotka měřítka je 0,551 μm (C). Gas1-GFP byl detekován v diskrétních oblastech nebo shlucích ER, zatímco Mid2-iRFP byl detekován a distribuován po celé membráně ER (C). (D) Graf ukazuje relativní intenzitu fluorescence Gas1-GFP a Mid2-iRFP v klastru Gas1-GFP podél linie bílé šipky (vlevo). AU, libovolná jednotka. (E a ​​F) představují 3D obraz, který kombinuje značku goods a ERES. Klastry Gas1-GFP byly detekovány v blízkosti specifického ERES. Jednotka měřítka je 0,551 μm. (F) Bílá plná šipka označuje klastr Gas1-GFP spojený s ERES. Prostřední a pravý panel ukazují sloučený zvětšený 3D obraz a otočený pohled na vybraný klastr Gas1-GFP.
Úzký prostorový vztah mezi klastrem Gas1-GFP a specifickým ERES naznačuje, že Gas1-GFP může vstoupit do selektivního ERES, což se liší od selektivity, kterou Mid2-iRFP používá k opuštění ER. Abychom tuto možnost řešili, kvantifikovali jsme poměr ERES pouze pro jeden nebo dva druhy zboží (obrázek 2, A až C). Zjistili jsme, že většina ERES (70 %) obsahuje pouze jeden typ nákladu. Spodní obrázek na obrázku 2C ukazuje dva typické příklady ERES pouze s Gas1-GFP (obrázek 1) nebo pouze s Mid2-iRFP (obrázek 2). Naproti tomu přibližně 20 % ERES obsahuje dva druhy nákladu, které se překrývají ve stejné oblasti. Bylo zjištěno, že některé ERES (10 %) obsahovaly dva typy nákladu, ale byly izolovány v jasně odlišných oblastech. Tato statistická analýza proto ukazuje, že po exportu ER jsou GPI-AP Gas1-GFP a transmembránový náklad Mid2-iRFP rozděleny do různých ERES (obrázek 2D). Tato účinnost třídění je velmi v souladu s předchozí biochemickou analýzou (6) a morfologickým stanovením (7). Můžeme také pozorovat chování karanténního nákladu vstupujícího do ERES (obrázek 2E a video S2). Obrázek 2E ukazuje, že pouze malá část Gas1-GFP (panel 3) nebo Mid2-iRFP (panel 4) vstupuje do ERES z jedné strany a je uzavřena v samostatné oblasti. Panel 5 z obrázku 2E ukazuje, že Gas1-GFP a Mid2-iRFP se někdy nacházejí ve stejném ERES, ale vstupují z různých stran a jsou koncentrovány v oddělených oblastech, které mohou představovat různé vezikuly COPII. Také jsme potvrdili, že pozorovaná separace a klasifikace Gas1 na bázi ceramidu C26 GPI-AP jako selektivního ERES je specifická, protože jiný transmembránový sekreční náklad, protein plazmatické membrány Axl2 (27) značený GFP, vykazuje podobné chování jako Mid2-iRFP. (obrázek S1 a video S3). Nově syntetizovaný Axl2-GFP je distribuován membránou ER podobně jako Mid2-iRFP (obrázek S1, A a B) a je ko-lokalizován s Mid2-iRFP ve většině ERES (obrázek S1, B až D). Panely 1 a 2 na obrázku 1. S1C ukazuje dva typické příklady ERES, kde se dva transmembránové nákladové materiály překrývají. V těchto případech oba nákladové materiály vstupují do ERES společně (obrázek S1E, panel 3 a film S3).
Buňky sec31-1 exprimující galaktózou indukovatelné sekrece, Gas1-GFP (GPI-AP, zelená) a Mid2-iRFP (TMP, modrá) a konstitutivní ERES značení Sec13-mCherry (ERES, purpurová) byly umístěny do teploty 37 °C. Po 30minutové inkubaci při teplotě 24 °C byly teploty přemístěny na 24 °C, aby se uvolnil sekreční blok, a po 20 minutách byly provedeny snímky pomocí SCLIM. (A až C) Reprezentativní 2D projekční snímky (A; měřítko, 1 μm) nebo 3D snímky buněčných hemisfér (B a C; jednotka měřítka, 0,456 μm) nákladu a 10 Z-řezů označených ERES. Spodní panel v (B) a panel v (C) zobrazují zpracované snímky pro zobrazení pouze zboží přítomného v ERES (purpurová) [Gas1-GFP (šedá) a Mid2-iRFP (světle modrá)]. (C) Otevřená šipka: ERES nese pouze jeden kus nákladu (1 až 4). Šedá šipka: ERES obsahuje oddělený náklad (5). Bílá plná šipka: ERES obsahující společně umístěný náklad. Níže: Vybraný jednotlivý ERES obsahuje pouze Gas1-GFP (1) nebo Mid2-iRFP (2). Měřítko, 100 nm. (D) Kvantifikace mikrofotografie popsané v (C). Průměrné procento ERES, které obsahuje pouze jeden náklad (Gas1-GFP nebo Mid2-iRFP), oddělený náklad a překrývající se náklad. Ve třech nezávislých experimentech n=432 v 54 buňkách. Chybová úsečka = SD. Dvoustranný nepárový t-test. *** P = 0,0002. (E) 3D obraz vybraných ERES karanténního nákladu označeného (C). Gas1-GFP (zelená) (3) nebo Mid2-iRFP (modrá) (4) vstupuje do ERES (purpurová) z jedné strany a je omezen na malou oblast v rámci ERES. Někdy oba typy nákladu vstupují do stejného ERES (5) ze stejné strany a jsou omezeny na izolovanou oblast v rámci ERES. Měřítko, 100 nm.
Dále jsme otestovali hypotézu, že ceramid s dlouhým acylovým řetězcem (C26) přítomný v membráně ER řídí specifické shlukování a třídění Gas1 do selektivních ERES. Za tímto účelem jsme použili modifikovaný kvasinkový kmen GhLag1, ve kterém byly dvě endogenní ceramidové syntázy Lag1 a Lac1 nahrazeny GhLag1 (homologem Lag1 bavlny), což vedlo ke kvasinkovému kmenu s ceramidovou membránou kratší než u divokého typu (obrázek 3A) (28). Analýza hmotnostní spektrometrií (MS) ukázala, že u kmenů divokého typu je 95 % celkového ceramidu ceramid s velmi dlouhým (C26) řetězcem, zatímco u GhLag1 je 85 % ceramidu velmi dlouhých (C18 a C16) ceramidů, pouze 2 % ceramidu je ceramid s velmi dlouhým (C26) řetězcem. Ačkoli jsou ceramidy C18 a C16 dosud hlavními ceramidy detekovanými v membráně GhLag1, MS analýza také potvrdila, že GPI kotva Gas1-GFP exprimovaná v kmeni GhLag1 obsahuje ceramid C26, který je srovnatelný s lipidy divokého typu. Kvalita je stejná (obr. 3A) (26). To znamená, že enzym Cwh43 remodelující ceramid je vysoce selektivní pro ceramid C26, jak je znázorněno na obrázku 26, přednostně inkorporuje GPI kotvu z malého množství ceramidu C26 v kmeni GhLag1. S2 (29). Nicméně buněčná membrána GhLag1 v podstatě obsahuje pouze ceramid C18-C16, zatímco Gas1-GFP stále obsahuje ceramid C26. Tato skutečnost činí z tohoto kmene ideální nástroj pro specifické řešení problému délky acylového řetězce membránového ceramidu v ER. Hypotetická role třídy a třídění. Poté jsme nejprve studovali schopnost C26 Gas1-GFP akumulovat se v shlucích v GhLag1 s teplotně citlivou mutantní alelou sec31-1 pomocí konvenční fluorescenční mikroskopie, kde v ceramidu ER membrány existuje pouze dlouhý řetězec (C18-C16) (obr. 3). Zjistili jsme, že v sec31-1 byla většina Gas1-GFP koncentrována ve shlucích, zatímco Gas1-GFP v sec31-1 GhLag1 s dlouhou ceramidovou ER membránou (C18-C16) nebyl převážně shluštěn a byl distribuován v celé ER membráně. Přesněji řečeno, protože shluštění na bázi ceramidu C26 úzce souvisí se specifickým ERES (obrázek 1), zkoumali jsme dále, zda tento proces může zahrnovat i funkci mechanismu exportního proteinu ER. GPI-AP používá pro export ER speciální systém COPII, který je aktivně regulován strukturální remodelací glykanové části kotvy GPI proteinem Ted1 (30, 31). Rekombinantní GPI-glykan je poté rozpoznán transmembránovým komplexem receptoru p24 pro náklad, který následně selektivně rekrutuje Lst1, což je specifická izoforma hlavní podjednotky vázající náklad COPII, Sec24, a vytváří tak COPII bohatý na GPI-AP. Vezikuly COPII jsou nezbytné (31-33). Proto jsme zkonstruovali dvojitý mutant, který kombinoval deleci těchto jednotlivých proteinů (složka komplexu p24 Emp24, enzym Ted1 pro remodelaci GPI-glykanu a specifická podjednotka Lst1 COPII) s mutantním kmenem sec31-1 a studovali jsme je. Je možné vytvořit Gas1-klastr GFP (obrázek 3). Pozorovali jsme, že v sec31-1emp24Δ a sec31-1ted1Δ je Gas1-GFP převážně neklastrovaný a distribuovaný po celé membráně ER, jak bylo dříve pozorováno u sec31-1 GhLag1, zatímco v sec31-1lst1Δ je Gas1-GFP jako sec31-1. Tyto výsledky naznačují, že kromě přítomnosti ceramidu C26 v membráně ER se pro shlukování Gas1-GFP musí také vázat na komplex p24 a nevyžaduje specifický nábor Lst1. Poté jsme zkoumali možnost, že délka řetězce ceramidu v membráně ER může regulovat vazbu Gas1-GFP na p24. Zjistili jsme však, že přítomnost ceramidu C18-C16 v membráně neovlivňuje GPI-glykany rekonstruované komplexem p24 (obrázky S3 a S4, A a B) ani vazbu na GPI-AP a schopnost exportu GPI-AP. Nábor podtypu COPII Lst1 (obrázek S4C). Shlukování závislé na ceramidu C26 proto nevyžaduje interakce proteinů s různými mechanismy exportu proteinů ER, ale podporuje alternativní mechanismus třídění řízený délkou lipidů. Poté jsme analyzovali, zda je délka acylového řetězce ceramidu v membráně ER důležitá pro efektivní klasifikaci Gas1-GFP jako selektivního ERES. Vzhledem k tomu, že Gas1 v kmeni GhLag1 s krátkým řetězcem ceramidu opouští ER a vstupuje do plazmatické membrány (obrázek S5), domníváme se, že pokud je třídění řízeno délkou acylového řetězce ceramidu, může být Gas1 v kmeni GhLag1 přesměrován a křížen. ERES produkty se stejnou membránou.
(A) Buněčná membrána GhLag1 obsahuje převážně kratší ceramidy C18-C16, zatímco GPI kotva Gas1-GFP má stále stejnou C26 IPC jako buňky divokého typu. Nahoře: Analýza délky acylového řetězce ceramidu v buněčné membráně kmenů divokého typu (Wt) a GhLag1p pomocí hmotnostní spektrometrie (MS). Data představují procento celkového ceramidu. Průměr ze tří nezávislých experimentů. Chybová úsečka = SD. Dvoustranný nepárový t-test. **** P <0,0001. Spodní panel: MS analýza délky acylového řetězce IPC přítomného v GPI kotvě Gas1-GFP (GPI-IPC) exprimované v kmenech divokého typu a GhLag1p. Data představují procento celkového signálu IPC. Průměr z pěti nezávislých experimentů. Chybová úsečka = SD. Dvoustranný nepárový t-test. ns, není důležité. P = 0,9134. (B) Fluorescenční mikrofotografie buněk sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ a sec31-1lst1Δ exprimujících galaktózou indukovaný Gas1-GFP byly inkubovány při 37 °C po dobu 30 minut a následně převedeny do běžné fluorescenční mikroskopie po 24 °C. Bílá šipka: Klastr Gas1-GFP v ER. Otevřená šipka: Neklastrovaný Gas1-GFP je distribuován po celé membráně ER, což ukazuje charakteristické barvení jaderného kruhu v ER. Měřítko, 5 μm. (C) Kvantifikace mikrofotografie popsané v (B). Průměrné procento buněk s tečkovitou strukturou Gas1-GFP. Ve třech nezávislých experimentech, n ≥ 300 buněk. Chybová úsečka = SD. Dvoustranný nepárový t-test. **** P < 0,0001.
Abychom tento problém přímo vyřešili, provedli jsme SCLIM vizualizaci Gas1-GFP a Mid2-iRFP v GhLag1 s teplotně citlivou mutantní alelou sec31-1 (obrázek 4 a video S4). Poté, co byl ER zadržen při 37 °C a následně uvolněn při 24 °C, většina nově syntetizovaného Gas1-GFP nebyla shlukována a distribuována po celé membráně ER, jak bylo pozorováno konvenčními mikroskopy (obrázek 4, A a B). Kromě toho velké procento ERES (67 %) obsahuje dva typy nákladu, které se v něm nacházejí společně (obrázek 4D). Panely 1 a 2 na obrázku 4C ukazují dva typické příklady ERES s překrývajícími se Gas1-GFP a Mid2-GFP. Kromě toho byly oba druhy zboží rekrutovány do stejného ERES (obrázek 4E, panel 3 a video S4). Naše výsledky tedy naznačují, že délka acylového řetězce ceramidu v membráně ER je důležitým determinantem agregace a klasifikace proteinů ER.
Buňky Sec31-1 GhLag1 exprimující galaktózou indukované sekrece, Gas1-GFP (GPI-AP, zelená) a Mid2-iRFP (TMP, modrá) a konstitutivní ERES-značený Sec13-mCherry (ERES, purpurová) Inkubujte při 37 °C. Pokračujte 30 minut, poté snižte teplotu na 24 °C, aby se uvolnily sekrece, a po 20 minutách proveďte snímkování pomocí SCLIM. (A až C) Reprezentativní 2D projekční snímky (A; měřítko, 1 μm) nebo 3D snímky buněčných hemisfér (B a C; jednotka měřítka, 0,45 μm) 10 Z-řezů označených nákladem a ERES. Spodní panel v (B) a panel v (C) zobrazují zpracované snímky, aby se zobrazily pouze položky přítomné v ERES (purpurová) [Gas1-GFP (šedá) a Mid2-iRFP (světle modrá)]. (C) Bílá vyplněná šipka: ERES, položky se překrývají. Otevřená šipka: ERES obsahuje pouze jednu položku. Spodní panel: Vybraný ERES má překrývající se zboží (1 a 2) vyznačené v (C). Měřítko, 100 nm. (D) Kvantifikace mikrofotografie popsané v (C). V jednotkách sec31-1 a sec31-1 GhLag1 je zahrnut pouze jeden náklad (Gas1-GFP nebo Mid2-iRFP) a průměrné procento ERES pro izolovaný náklad a překrývající se náklad. Ve třech nezávislých experimentech bylo n = 432 v 54 buňkách (sec31-1) a n = 430 ve 47 buňkách (sec31-1 GhLag1). Chybová úsečka = SD. Dvoustranný nepárový t-test. *** P = 0,0002 (sec31-1) a ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D obraz vybraného ERES s překrývajícím se nákladem (3) vyznačeným v (C). Gas1-GFP (zelená) a Mid2-iRFP (modrá) se přibližují k ERES (purpurová) ze stejné strany a zůstávají ve stejné oblasti omezené ERES. Měřítko, 100 nm.
Tato studie poskytuje přímý in vivo důkaz, že proteinové nákladové látky na bázi lipidů jsou klasifikovány do selektivních exportních míst v sekreční dráze, a odhaluje důležitost délky acylového řetězce pro selektivitu klasifikace. Pomocí výkonné a špičkové mikroskopické techniky zvané SCLIM jsme demonstrovali nově syntetizovaný Gas1-GFP (hlavní GPI-AP plazmatické membrány s velmi dlouhou lipidovou částí ceramidu s acylovým řetězcem (C26)) u kvasinek. Oblasti shlukované v diskrétních ER jsou asociovány se specifickými ERES, zatímco transmembránově sekretované proteiny jsou distribuovány po celé membráně ER (obrázek 1). Kromě toho tyto dva typy nákladových látek selektivně vstupují do různých ERES (obrázek 2). Délka acylového řetězce buněčného ceramidu v membráně je zkrácena z C26 na C18-C16, klastr Gas1-GFP je narušen do diskrétní oblasti ER a Gas1-GFP je přesměrován tak, aby opustil ER s transmembránovým proteinem přes stejný ERES (obrázek 3 a obrázek 3). 4).
Ačkoli GPI-AP využívá specializovaný proteinový mechanismus k výstupu z ER, zjistili jsme, že separace závislá na ceramidu C26 se nespoléhá na diferenciální proteinové interakce, které by mohly vést ke specializaci ERES (obrázky S4 a S5). Naše zjištění místo toho podporují alternativní klasifikační mechanismus řízený shlukováním proteinů na bázi lipidů a následným vyloučením jiných proteinů. Naše pozorování naznačují, že oblast Gas1-GFP nebo shluk asociovaný se specifickým ERES postrádá transmembránově sekretovaný protein Mid2-iRFP, což naznačuje, že shluk GPI-AP závislý na ceramidu C26 usnadní jejich vstup do příslušného ERES a zároveň vyloučí transmembránový vstup sekretů do tohoto konkrétního ERES (obrázky 1 a 2). Naproti tomu přítomnost ceramidů C18-C16 v membráně ER nezpůsobuje tvorbu oblastí nebo shluků GPI-AP, takže nevylučují ani nenahrazují transmembránově sekretované proteiny ve stejném ERES (obrázky 3 a 4). Proto navrhujeme, že ceramid C26 řídí separaci a klasifikaci usnadněním shlukování proteinů vázaných na specifické ERES.
Jak dosáhnout tohoto shlukování závislého na ceramidu C26 do specifické oblasti ER? Tendence membránového ceramidu k laterálnímu oddělování může způsobit, že GPI-AP a ceramid C26 vytvářejí malé a okamžitě uspořádané lipidy v nepravidelnějším lipidovém prostředí membrány ER obsahujícím kratší a nenasycené glycerolipidy. Kvalitní shluky (17, 18). Tyto malé dočasné shluky mohou být po vazbě na komplex p24 dále fúzovány do větších a stabilnějších shluků (34). V souladu s tím jsme ukázali, že C26 Gas1-GFP potřebuje interagovat s komplexem p24, aby vytvořil větší viditelné shluky (obrázek 3). Komplex p24 je heterozygotní oligomer složený ze čtyř různých transmembránových proteinů p24 v kvasinkách (35), který zajišťuje multivalentní vazbu, jež může vést k zesíťování malých shluků GPI-AP, čímž vzniká větší stabilní shluk (34). Interakce mezi proteinovými ektodoménami GPI-AP může také přispívat k jejich agregaci, jak je ukázáno během jejich Golgiho transportu v polarizovaných epiteliálních buňkách savců (36). Pokud je však v membráně ER přítomen ceramid C18-C16 a komplex p24 se váže na Gas1-GFP, nebudou se tvořit velké samostatné shluky. Základní mechanismus může záviset na specifických fyzikálních a chemických vlastnostech ceramidu s dlouhým acylovým řetězcem. Biofyzikální studie umělých membrán ukazují, že ačkoli jak ceramidy s dlouhým (C24), tak krátkým (C18-C16) acylovým řetězcem mohou způsobit fázovou separaci, pouze ceramidy s dlouhým acylovým řetězcem (C24) mohou podporovat vysoké zakřivení a ohýbání filmu a tím jeho tvarování. Vzájemným odkazem (17, 37, 38) bylo prokázáno, že transmembránová šroubovice TMED2, lidského homologu Emp24, selektivně interaguje se sfingomyelinem na bázi ceramidu C18 v cytoplazmatických lalůčcích (39). Pomocí molekulárně dynamických (MD) simulací jsme zjistili, že se ceramidy C18 i C26 hromadí kolem cytoplazmatických laloků transmembránové šroubovice Emp24 a mají podobné preference (obrázek S6). Za zmínku stojí, že to naznačuje, že transmembránová šroubovice Emp24 může vést k asymetrické distribuci lipidů v membráně. Jedná se o nedávný výsledek založený na savčích buňkách. Podobné MD simulace také ukazují přítomnost etherových lipidů (40). Proto spekulujeme, že ceramid C26 ve dvou lalocích ER26 je lokálně obohacen. Když se GPI-AP v luminálních lalocích přímo váže na multivalentní p24 a dochází k akumulaci ceramidu C26 kolem p24 v cytoplazmatických lalocích, může to podpořit doprovodnou agregaci proteinů a zakřivení membrány, které vzniká skrze prsty (41), což způsobuje oddělení GPI-AP do diskrétních oblastí sousedících s ERES, což také zvýhodňuje vysoce zakřivené oblasti membrány ER (42). Předchozí zprávy podporovaly navrhovaný mechanismus (43, 44). Multivalentní vazba oligolektinů, patogenů nebo protilátek na glykosfingolipidy na bázi ceramidu (GSL) na plazmatické membráně spouští rozsáhlou agregaci GSL, zvyšuje fázovou separaci a způsobuje deformaci a internalizaci membrány (44). Iwabuchi atd. (43) Bylo zjištěno, že v přítomnosti dlouhých (C24), ale nikoli krátkých (C16) acylových řetězců, multivalentní ligand vázaný na laktosylceramid GSL indukoval tvorbu velkých shluků a invaginaci membrány a cytoplazmatická Lyn-zprostředkovaná signální transdukce na cípcích je propojena acylovými řetězci ve spřažených neutrofilech.
V savčích polarizovaných epiteliálních buňkách řídí separaci a třídění GPI-AP koncentrace anti-Golgiho sítě (TGN) na úrovni apikální plazmatické membrány (10, 45). Tato agregace je řízena oligomerací GPI-AP (36), ale může také záviset na délce ceramidového řetězce, kterou nacházíme v kvasinkách. Ačkoli savčí GPI-AP má kotvu na bázi etherového lipidu a jeho chemická struktura se velmi liší od ceramidu s velmi dlouhým acylovým řetězcem, nedávná studie zjistila, že oba lipidy mají evolučně podobné fyzikální a chemické vlastnosti a funkci (40). Část etherového lipidu v savčích buňkách proto může být podobná ceramidu C26 v kvasinkách a její úlohou je asociovat se s ceramidem s dlouhým řetězcem v membráně, aby podpořila agregaci a třídění GPI-AP. Ačkoli je třeba tuto možnost ještě přímo otestovat, předchozí zjištění podporují, že transport ceramidu s dlouhým acylovým řetězcem do Golgiho tělíska není prováděn cytoplazmatickými transferovými proteiny, ale závisí na syntéze GPI kotev, jako je tomu u kvasinek. Zdá se tedy, že evoluční konzervativní mechanismus je schopen selektivně kotransportovat ceramid s velmi dlouhým acylovým řetězcem a GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ve stejném transportním vezikulu.
V kvasinkových a savčích polarizovaných epiteliálních buněčných systémech dochází k agregaci a separaci GPI-AP od ostatních proteinů plazmatické membrány před dosažením buněčného povrchu. Paladino a kol. (48) zjistili, že na TGN savčích polarizovaných epiteliálních buněk je shlukování GPI-AP nezbytné nejen pro selektivní klasifikaci GPI-AP na apikální plazmatickou membránu, ale také reguluje organizaci shlukování GPI-AP a jejich biologickou aktivitu. Buněčný povrch. U kvasinek tato studie ukázala, že ceramidově závislý klastr GPI-AP C26 na ER může regulovat organizaci shluků a funkční aktivitu GPI-AP na plazmatické membráně (24, 49). V souladu s tímto modelem jsou buňky GhLag1 alergické na inhibitory GPI nebo léky, které ovlivňují integritu buněčné stěny (28), a potřeba funkčních Gas1-GFP klastrů (49) špičkového ceramidu promítaného při páření kvasinkových buněk naznačuje G. Možné fyziologické důsledky buněk hLag1. Chyba GPI-AP. Nicméně další testování, zda byla funkční organizace buněčného povrchu naprogramována z ER metodou třídění založenou na délce lipidů, bude předmětem našeho budoucího výzkumu.
Kmeny Saccharomyces cerevisiae použité v této práci jsou uvedeny v tabulce S1. Kmeny MMY1583 a MMY1635 genu SCLIM pro zobrazování živých buněk byly konstruovány na pozadí W303. Tyto kmeny exprimující Sec13-mCherry s fluorescenční proteinovou značkou byly konstruovány metodou založenou na polymerázové řetězové reakci (PCR) s plazmidem pFA6a jako templátem (23). Kmen exprimující Mid2-iRFP značený fluorescenčním proteinem pod kontrolou promotoru GAL1 byl konstruován následovně. PCR amplifikace sekvence iRFP-KanMx z vektoru pKTiRFP-KAN (dar od E. O'Shea, plasmid Addgene číslo 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identifikátor výzkumného zdroje (RRID): Addgene_64687) a vložena do C-konce endogenního Mid2. Poté, co byla genomová sekvence Mid2-iRFP amplifikována a klonována do promotoru GAL1, byla integrována do místa Not I-Sac I integračního plazmidu pRS306. Výsledný plazmid pRGS7 byl linearizován pomocí Pst I pro integraci do lokusu URA3.
Fúzní gen Gas1-GFP je exprimován pod kontrolou promotoru GAL1 v centromerovém (CEN) plazmidu, který je konstruován následovně. Sekvence Gas1-GFP byla amplifikována PCR z plazmidu pRS416-GAS1-GFP (24) (dar od L. Popolo) a klonována do místa Xma I–Xho I plazmidu CEN pBEVY-GL LEU2 (dar od C). Miller; číslo plazmidu Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Výsledný plazmid byl pojmenován pRGS6. Fúzní gen Axl2-GFP je také exprimován pod kontrolou promotoru GAL1 vektoru pBEVY-GL LEU2 a jeho konstrukce je následující. Sekvence Axl2-GFP byla amplifikována z plazmidu pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) pomocí PCR a klonována do místa Bam HI-Pst I vektoru pBEVY-GL LEU2. Výsledný plazmid byl pojmenován pRGS12. Sekvence oligonukleotidů použitých v této studii je uvedena v tabulce S2.
Kmen byl doplněn 0,2 % adeninu a 2 % glukózy [YP-dextróza (YPD)], 2 % rafinózou [YP-rafinóza] bohatým médiem s kvasnicovým extraktem a proteinem p (YP) (1 % kvasničného extraktu a 2 % proteinu ept). (YPR)] nebo 2 % galaktózou [YP-galaktóza (YPG)] jako zdrojem uhlíku, nebo syntetickým minimálním médiem (0,15 % kvasničné dusíkaté báze a 0,5 % síranu amonného) pro doplnění vhodných aminokyselin a bází potřebných pro výživu a obsahujícím 2 % glukózy (syntetické glukózové minimální médium) nebo 2 % galaktózy (syntetické galaktózové minimální médium) jako zdrojem uhlíku.
Pro zobrazování v reálném čase byly teplotně citlivé mutantní buňky sec31-1 exprimující konstrukt pod promotorem GAL1 pěstovány v médiu YPR při 24 °C přes noc do střední logaritmické fáze. Po indukci v YPG při 24 °C po dobu 1 hodiny byly buňky inkubovány v SG při 37 °C po dobu 30 minut a poté přeneseny do 24 °C, aby se uvolnily ze sekrečního bloku. Konkanavalin A byl použit k fixaci buněk na podložním sklíčku a zobrazen pomocí SCLIM. SCLIM je kombinací invertovaného fluorescenčního mikroskopu Olympus IX-71 a olejové čočky s numerickou aperturou UPlanSApo 100×1,4 (Olympus), vysokorychlostního konfokálního skeneru s rotujícím diskem a vysokým poměrem signálu k šumu (Yokogawa Electric), zakázkového spektrometru a zakázkového chlazení. Zesilovač obrazu systému (Hamamatsu Photonics) může poskytnout systém zvětšovacích čoček s konečným zvětšením ×266,7 a kameru s nábojově vázaným zařízením, která násobí elektrony (Hamamatsu Photonics) (21). Pořízení obrazu se provádí pomocí zakázkového softwaru (Yokogawa Electric). Pro 3D snímky jsme použili zakázkový piezoelektrický aktuátor k vertikálnímu vibrování objektivu a optické části vzdálené od sebe 100 nm jsme shromáždili do vrstvy. Obraz Z-vrstvy je převeden na 3D voxelová data a teoretická funkce rozptylu bodů použitá pro konfokální mikroskop s rotujícím diskem je použita pro dekonvoluční zpracování softwarem Volocity (PerkinElmer). Pomocí softwaru Volocity pro automatické stanovení prahových hodnot pro analýzu kolokace byl měřen ERES včetně nákladu. Analýza linkového skenování byla provedena pomocí softwaru MetaMorph (Molecular Devices).
Pro stanovení statistické významnosti použijte software GraphPad Prism. U oboustranného Studentova t-testu a běžné jednocestné analýzy rozptylu (ANOVA) se rozdíly mezi skupinami považují za rozdíly s významným vlivem na P < 0,05 (*).
Pro fluorescenční mikroskopii Gas1-GFP byly buňky v logaritmické fázi pěstovány přes noc v YPD a shromážděny centrifugací, dvakrát promyty fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem a inkubovány na ledu po dobu alespoň 15 minut a poté dále analyzovány pod mikroskopem, jak bylo popsáno dříve (24). Pro akvizici byl použit mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) vybavený objektivem, filtrem L5 (GFP), kamerou Hamamatsu a softwarem Application Suite X (LAS X).
Vzorky byly denaturovány SDS vzorkovacím pufrem při 65 °C po dobu 10 minut a poté separovány SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (PAGE). Pro imunoblotovou analýzu bylo do každé dráhy naneseno 10 μl vzorku. Primární protilátka: Použita králičí polyklonální anti-Gas1 v ředění 1:3000, králičí polyklonální anti-Emp24 v ředění 1:500 a králičí polyklonální anti-GFP (dar od H. Riezmana) v ředění 1:3000. Myší monoklonální protilátka anti-Pgk1 byla použita v ředění 1:5000 (dar od J. de la Cruz). Sekundární protilátka: Kozí anti-králičí imunoglobulin G (IgG) konjugovaný s křenovou peroxidázou (HRP) v ředění 1:3000 (Pierce). Kozí anti-myší IgG konjugovaný s HRP byl použit v ředění 1:3000 (Pierce). Zóna imunitní odpovědi byla pozorována chemiluminiscenční metodou s použitím činidla SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Jak je popsáno v (31), byl proveden experiment s přirozenou imunoprecipitací na obohacené frakci ER. Stručně řečeno, kvasinkové buňky byly dvakrát promyty pufrem TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu a směsí inhibitorů proteázy) při 600 nm (OD600) a optické hustotě 100. Byl rozbit skleněnými kuličkami a poté byly buněčné zbytky a skleněné kuličky odstraněny centrifugací. Supernatant byl poté centrifugován při 17 000 g po dobu 15 minut při 4 °C. Peleta byla resuspendována v TNE a byl přidán digitalisový saponin do konečné koncentrace 1 %. Suspenze byla inkubována po dobu 1 hodiny s rotací při 4 °C a poté byly nerozpustné složky odstraněny centrifugací při 13 000 g při 4 °C po dobu 60 minut. Pro imunoprecipitaci Gas1-GFP nejprve preinkubujte vzorek s prázdnými agarózovými kuličkami (ChromoTek) při 4 °C po dobu 1 hodiny a poté inkubujte s GFP-Trap_A (ChromoTek) při 4 °C po dobu 3 hodin. Imunoprecipitované kuličky byly pětkrát promyty TNE obsahujícím 0,2 % digoxigeninu, eluovány SDS vzorkovacím pufrem, separovány na SDS-PAGE a analyzovány imunoblotováním.
Jak je popsáno v (31), stanovení síťování bylo provedeno na obohacené frakci ER. Stručně řečeno, obohacená frakce ER byla inkubována s 0,5 mM dithiobis(sukcinimidylpropionátem) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20 °C, 20 min). Síťovací reakce byla ukončena přidáním glycinu (konečná koncentrace 50 mM, 5 minut, 20 °C).
Jak bylo popsáno dříve (50), byla provedena MS analýza ceramidu u kmenů divokého typu a GhLag1. Stručně řečeno, buňky byly pěstovány do exponenciální fáze (3 až 4 jednotky OD600/ml) v YPD při 30 °C a bylo sklizeno 25 × 107 buněk. Jejich metabolismus byl zastaven kyselinou trichloroctovou. Použito bylo extrakční rozpouštědlo [ethanol, voda, ether, pyridin a 4,2 N hydroxid amonný (15:15:5:1:0,018 obj./obj.)] a 1,2 nmol interního standardu C17 ceramidu (860517, Avanti polární lipid)). Použito bylo monomethylaminové činidlo [methanol, voda, n-butanol a roztok methylaminu (4:3:1:5 obj./obj.)] k provedení mírné alkalické hydrolýzy extraktu a poté k odsolení použit vodou nasycený n-butanol. Nakonec byl extrakt resuspendován v rozpouštědle s pozitivním módem [chloroform/methanol/voda (2:7:1) + 5 mM octan amonný] a vstříknut do hmotnostního spektrometru. Pro identifikaci a kvantifikaci molekul sfingolipidů byl proveden multireakční monitoring (MRM). Terciární kvadrupólový hmotnostní spektrometr TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) je vybaven robotickým nanoflow iontovým zdrojem Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) pro analýzu lipidů. Energie srážky je optimalizována pro každou kategorii ceramidů. MS data byla získána v pozitivním módu. Pro každý biologický replikát je lipidový signál mediánem tří nezávislých měření.
Jak je popsáno v (31), buňky (800×107) exprimující Gas1-GFP byly podrobeny přirozené imunoprecipitaci. Purifikovaný Gas1-GFP byl separován pomocí SDS-PAGE a přenesen na polyvinylidenfluoridovou (PVDF) membránu. Protein byl vizualizován barvením PVDF amidovou černí. Pás Gas1-GFP byl z PVDF vyříznut a 5krát promyt methanolem a jednou vodou o kvalitě vhodné pro kapalinovou chromatografii-MS (LC-MS). Inkubací membránového proužku s 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), pufrem a 500 μl čerstvě rozpuštěné směsi 1 M dusitanu sodného při 37 °C po dobu 3 hodin se lipidová frakce uvolní z Gas1-GFP a lyzuje se uvolňování inosinfosfátového ceramidu mezi glukosaminem a inositolem (51). Poté byl membránový proužek čtyřikrát promyt vodou o kvalitě vhodné pro LC-MS, sušen při pokojové teplotě a skladován v dusíkové atmosféře při -80 °C do doby analýzy. Jako kontrola byl pro každý experiment použit slepý vzorek PVDF membrány. Lipid extrahovaný z Gas1-GFP byl poté analyzován MS, jak je popsáno (50). Stručně řečeno, PVDF proužky obsahující GPI-lipid byly resuspendovány v 75 μl negativního rozpouštědla pro formu [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM octan amonný] a prošly analýzou sfingolipidů elektrosprejovou ionizací (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). V tomto případě byla MS data získána v režimu negativních iontů.
Jak již bylo zmíněno, lipidová část GPI kotvy byla oddělena od [3H]-inositolem značeného GPI-AP (16). Lipidy byly odděleny tenkovrstvou chromatografií za použití systému rozpouštědel (55:45:10 chloroform-methanol-0,25% KCl) a vizualizovány pomocí FLA-7000 (Fujifilm).
Buňky exprimující Gas1-GFP (600×107) byly dvakrát promyty TNE pufrem, rozdrceny skleněnými kuličkami a poté centrifugovány za účelem odstranění buněčných zbytků a skleněných kuliček. Supernatant byl poté centrifugován při 17 000 g po dobu 1 hodiny při 4 °C. Peleta byla promyta v TNE a inkubována s 1 U PI-PLC (Invitrogen) v TNE obsahujícím 0,2 % digitalisového saponinu po dobu 1 hodiny při 37 °C. Po ošetření enzymem byla membrána odstraněna centrifugací při 17 000 g při 4 °C po dobu 1 hodiny. Pro imunoprecipitaci Gas1-GFP byl supernatant inkubován s GFP-Trap_A (ChromoTek) při 4 °C přes noc. Purifikovaný Gas1-GFP separovaný pomocí SDS-PAGE byl obarven brilantní modří Coomassie. Barvicí pás Gas1-GFP byl odříznut od šedé barvy obklopující akvadukt a po alkylaci jodacetamidem a redukci dithiothreitolem byla provedena gelová digesce trypsinem. Tryptické peptidy a peptidy s GPI-glykany byly extrahovány a sušeny. Vysušený peptid byl rozpuštěn ve 20 μl vody. Část (8 μl) byla vstříknuta do LC. K separaci peptidů za specifických gradientových podmínek byla použita oktadecylsilanová (ODS) kolona (Develosil 300ODS-HG-5; vnitřní průměr 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, prefektura Aiči, Japonsko). Mobilní fází bylo rozpouštědlo A (0,08% kyselina mravenčí) a rozpouštědlo B (0,15% kyselina mravenčí v 80% acetonitrilu). K eluci kolony rozpouštědlem A během 55 minut při průtoku 50 μl min-1 po dobu 5 minut byl použit systém Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) a poté byla koncentrace rozpouštědla B zvýšena na 40 %. (Spojené státy). Eluát byl kontinuálně zaváděn do iontového zdroje ESI a tryptické peptidy a peptidy s GPI-glykany byly analyzovány pomocí LTQ Orbitrap XL (hybridní hmotnostní spektrometr s lineární iontovou pastí a orbitrapou; Thermo Fisher Scientific). V MS nastavení bylo napětí kapilárního zdroje nastaveno na 4,5 kV a teplota přenosové kapiláry byla udržována na 300 °C. Napětí kapiláry a napětí čočky trubice bylo nastaveno na 15 V a 50 V. Data MS byla získána v režimu kladných iontů (rozlišení 60 000; přesnost hmotnosti 10 ppm) v hmotnostním rozsahu 300/m/z s poměrem hmotnost/náboj (m/z) 3000. Data MS/MS jsou získána pomocí iontové pasti v přístroji LTQ Orbitrap XL [první 3 číslice, na kterých data závisí, disociace indukovaná kolizí (CID)].
MD simulace byly provedeny pomocí softwaru GROMACS (52) a silového pole MARTINI 2 (53-55). K vytvoření dvojvrstvy obsahující dioleoylfosfatidylcholin (DOPC) a Cer C18 nebo DOPC a Cer C26 byl poté použit Membrane Builder v CHARMM GUI (56, 57). Topologie a souřadnice Cer C26 jsou odvozeny z DXCE odstraněním přebytečných kuliček ze sfingosinového ocasu. Pomocí níže popsaného postupu vyvažte dvojitou vrstvu a spusťte ji, poté použijte poslední souřadnice systému k vytvoření systému obsahujícího Emp24. Transmembránová doména kvasinky Emp24 (zbytky 173 až 193) byla konstruována jako α-helix pomocí nástroje Visual MD (VMD) pro analýzu molekulární struktury (58). Poté, po odstranění překrývajících se lipidů, byl protein hrubě granulován a vložen do dvojvrstvy pomocí CHARMM GUI. Finální systém obsahuje 1202 DOPC a 302 Cer C26 nebo 1197 DOPC a 295 Cer C18 a Emp24. Systém se ionizuje na koncentraci 0,150 M. Pro dvě dvojvrstvé kompozice byly provedeny čtyři nezávislé replikáty.
Lipidová dvojvrstva je vyvážena pomocí procesu CHARMM GUI, který zahrnuje minimalizaci a následné vyvážení 405 000 kroků, kde jsou omezení polohy postupně snižována a eliminována a časový krok se zvyšuje z 0,005 ps na 0,02 ps. Po dosažení rovnováhy produkuje 6 µs s časovým krokem 0,02 ps. Po vložení Emp24 použijte stejný proces CHARMM GUI k minimalizaci a vyvážení systému a poté spusťte systém po dobu 8 s v produkčním režimu.
U všech systémů je tlak během procesu vyvažování řízen Berendsenovým barostatem (59) a během výrobního procesu je tlak řízen Parrinello-Rahmanovým barostatem (60). Ve všech případech je průměrný tlak 1 bar a používá se semiizotropní schéma tlakového propojení. V procesu vyvažování a výroby se používá termostat (61) s rekalibrací rychlosti pro propojení teploty proteinových, lipidových a rozpouštědlových částic. Během celé operace je cílová teplota 310 K. Nevazebná interakce se vypočítá generováním párovacího seznamu pomocí Verletova schématu s tolerancí pufru 0,005. Coulombův člen se vypočítá pomocí reakčního pole a mezní vzdálenosti 1,1 nm. Vander-Waalsův člen používá mezní schéma s mezní vzdáleností 1,1 nm a Verletovo mezní schéma se používá pro potenciální drift (62).
Pomocí VMD je mezní vlnová délka mezi fosfátovými kuličkami DOPC nebo ceramidovými kuličkami AM1 a proteinem 0,7 nm a vypočítá se počet lipidů, které interagují s proteinem. Podle následujícího vzorce vypočítejte faktor deplece-enrichment (DE) jako v (63): Faktor DE = (množství celkových lipidů v proteinu 0,7) v proteinu 0,7 (množství Cer v celkových lipidech)
Uvedená hodnota je získána jako průměr a chybové úsečky jsou čtyři nezávislé kopie SE. Statistická významnost faktoru DE je vypočítána t-testem [(průměrnáDE-faktor-1)/SE]. Vypočítejte hodnotu P z jednostranného rozdělení.
Nástroj GROMACS byl použit k výpočtu 2D laterální mapy hustoty systému obsahujícího Emp24 v posledních 250 ns záznamu. Pro získání mapy obohacení/ochuzení ceramidu je mapa hustoty Cer vydělena součtem mapy Cer a DOPC a poté vydělena koncentrací Cer v těle. Používá se stejná barevná stupnice mapy.
Doplňující materiály k tomuto článku naleznete na adrese http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný za podmínek licence Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, která umožňuje použití, distribuci a reprodukci v jakémkoli médiu, pokud konečné použití není pro komerční zisk a předpokladem je, že původní dílo je správné. Odkaz.
Poznámka: O uvedení vaší e-mailové adresy vás žádáme pouze proto, aby osoba, kterou stránce doporučíte, věděla, že chcete, aby e-mail viděla, a že se nejedná o spam. Nebudeme zaznamenávat žádné e-mailové adresy.
Tato otázka se používá k ověření, zda jste návštěvník, a k zabránění automatickému odesílání spamu.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Lonero), Ana Maria Perez-Ligio), LoS Migio Perez-Ligio (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D zobrazování v reálném čase s vysokým rozlišením odhaluje důležitost délky ceramidového řetězce pro třídění proteinů v selektivních výstupních místech.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Lonero), Ana Maria Perez-Ligio), LoS Migio Perez-Ligio (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D zobrazování v reálném čase s vysokým rozlišením odhaluje důležitost délky ceramidového řetězce pro třídění proteinů v selektivních výstupních místech.
©2020 American Association for the Advancement of Science. všechna práva vyhrazena. AAAS je partnerem HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.