Javascript je ve vašem prohlížeči momentálně zakázán. Některé funkce tohoto webu nebudou fungovat, pokud je javascript zakázán.
Zaregistrujte se s konkrétními údaji a lékem, o který máte zájem, a my vámi poskytnuté informace porovnáme s články v naší rozsáhlé databázi a obratem vám e-mailem zašleme kopii ve formátu PDF.
Granule Ban-Lan-Gen zmírňují chronickou recidivující kolitidu vyvolanou dextranem síranem sodným u myší modulací střevní mikrobioty a obnovením produkce střevního SCFA odvozeného od GLP-1
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Pekingská univerzita, Nemocnice v Šen-čenu, Katedra farmacie, Šen-čen, Čínská lidová republika; 2Zdravotnické vědecké centrum Univerzity v Šen-čenu, Farmaceutická fakulta, Šen-čen, Čínská lidová republika; 3Lékařská univerzita v Kuej-čou, Výzkumné centrum pro inženýrské technologie etnické medicíny a tradiční čínské medicíny, Vývoj a aplikace, Ministerstvo školství, Klíčová farmaceutická laboratoř provincie Kuej-čou, Lékařská univerzita v Kuej-jang, Čínská lidová republika; 4 Gastroenterologické oddělení, Nemocnice v Šen-čenu Pekingské univerzity, Šen-čen, Čínská lidová republika; 5 Farmaceutická fakulta, Lékařská univerzita v Kuej-čou, Státní klíčová laboratoř pro funkci a aplikaci léčivých rostlin, Kuej-jang; 6 Katedra laboratorní medicíny, Pekingská univerzita, Nemocnice v Šen-čenu, Šen-čen, Čína [email protected] Shen Xiangchun, Farmaceutická fakulta, Lékařská univerzita v Kuej-čou, Kuej-čou, Čínská lidová republika, 550004, e-mail [email protected] Cíl: Terapie založená na GLP-1 je novou možností léčby zánětlivých onemocnění střev. Granule Ban-Lan-Gen (BLG) jsou známou antivirovou TCM formulací, která vykazuje potenciální protizánětlivou aktivitu při léčbě různých zánětlivých stavů. Jejich protizánětlivý účinek na kolitidu a mechanismus účinku však stále nejsou jasné. METODY: Stanovit chronickou recidivující kolitidu vyvolanou dextransulfátem sodným (DSS) u myší. Pro posouzení ochranného účinku BLG byly provedeny indexy aktivity onemocnění, histologické markery poškození a hladiny prozánětlivých cytokinů. Účinky BLG na střevní mikrobiotu a střevo byly charakterizovány hladinami GLP-1 v séru a expresí Gcg, GPR41 a GRP43 v tlustém střevě, složením střevní mikrobioty, hladinami SCFA ve stolici a uvolňováním GLP-1 z Primární myší epiteliální buňky tlustého střeva produkují GLP-1 odvozený z SCFA. Výsledky: Léčba BLG významně snížila úbytek tělesné hmotnosti, DAI, zkrácení tlustého střeva, poškození tkáně tlustého střeva a hladiny prozánětlivých cytokinů TNF-α, IL-1β a IL-6 v tkáni tlustého střeva. Léčba BLG navíc může významně obnovit expresi Gcg, GPR41 a GRP43 v tlustém střevě a hladiny GLP-1 v séru u myší s kolitidou, a to zvýšením bakterií produkujících SCFA, jako jsou Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001, a snížením množství bakterií, jako jsou Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas a Oscillibacter. Léčba BLG navíc může významně zvýšit hladinu SCFA ve stolici myší s kolitidou. Současně experimenty in vitro také ukázaly, že fekální extrakt myší léčených BLG může výrazně stimulovat primární malé myší epiteliální buňky tlustého střeva, které vylučují GLP-1. Závěry: Tato zjištění naznačují, že BLG má antikolitický účinek. BLG má potenciál pro vývoj jako terapie, alespoň částečně modulací střevní mikrobioty a obnovením produkce GLP-1 odvozeného ze střevních SCFA. Slibné léky pro chronickou recidivující kolitidu. Klíčová slova: kolitida, granule Ban-Lan-Gen, střevní mikrobiota, mastné kyseliny s krátkým řetězcem, GLP-1
Ulcerózní kolitida (UC) je dlouhodobé zánětlivé onemocnění tlustého střeva a konečníku charakterizované opakujícími se průjmy, bolestmi břicha, úbytkem hmotnosti a hlenohnisavou krvavou stolicí.1 V poslední době se prevalence UC zvyšuje v zemích s dříve nízkým výskytem, ​​včetně Číny, s rostoucí popularitou západního životního stylu.2 Tento nárůst představuje závažné problémy pro veřejné zdraví a má vážné důsledky pro pracovní schopnost pacientů a kvalitu života. Je pozoruhodné, že patogeneze UC zůstává do značné míry nejasná, ale obecně se uznává, že genetika, faktory prostředí, střevní mikrobiota a imunitní systém přispívají k rozvoji UC.3 Ani v současnosti neexistuje lék na UC a cílem léčby je klinicky kontrolovat klinické příznaky, navozovat a udržovat remisi, podporovat hojení sliznic a snižovat recidivu. Klasická léčba zahrnuje aminosalicyláty, kortikosteroidy, imunosupresiva a biologická léčiva. Tyto léky však nemohou dosáhnout požadovaného účinku kvůli svým různým vedlejším účinkům.4 V poslední době mnoho kazuistik ukázalo, že tradiční čínská medicína (TCM) prokázala velký potenciál v pomoci zmírnit UC. s nízkou toxicitou, což naznačuje, že vývoj nových terapií tradiční čínské medicíny je slibnou léčebnou strategií pro ulcerózní kolitidu.5-7
Banlangen Granules (BLG) je přípravek tradiční čínské medicíny vyrobený z vodného extraktu z kořene Banlangen.8 Kromě antivirové účinnosti vykazuje BLG potenciální protizánětlivou aktivitu při léčbě různých zánětlivých stavů.9,10 Kromě toho byly z vodných extraktů Radix isatidis izolovány a identifikovány glukosinoláty (R,S-goitrin, progoitrin, epiprorubin a glukosid) a nukleosidy (hypoxanthin, adenosin, uridin a guanosin) a indigové alkaloidy, jako je indigo a indirubin.11,12 Předchozí studie dobře zdokumentovaly, že sloučeniny adenosin, uridin a indirubin vykazují silné účinky proti kolitidě u různých zvířecích modelů kolitidy.13-17 Nebyly však provedeny žádné studie založené na důkazech, které by hodnotily účinnost BLG u kolitidy. V této studii jsme zkoumali ochranný účinek BLG na chronickou recidivující kolitidu vyvolanou dextranem síranem sodným (DSS) u myší C57BL/6 a zjistili jsme... že perorální podávání BLG významně zmírnilo DSS-indukovaný chronický recidivující zánět tlustého střeva u myší, jeho regulační mechanismy jsou spojeny s modulací střevní mikrobioty a obnovou produkce glukagonu podobného peptidu-1 (GLP-1) odvozeného ze střeva.
Granule BLG (bez cukru, schválené NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Peking, Čína; číslo šarže: 20110966) byly zakoupeny v lékárnách. DSS (molekulová hmotnost: 36 000–50 000 daltonů) byl zakoupen od společnosti MP Biologicals (Santa Ana, USA). Sulfasalazin (SASP) (čistota ≥ 98 %), hematoxylin a eosin byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Myší soupravy pro stanovení TNF-α, IL-1β a IL-6 luminex Elisa byly zakoupeny od společnosti R&D systems (Minneapolis, MN, USA). Kyselina octová, kyselina propionová a kyselina máselná byly zakoupeny od společnosti Aladdin Industries (Šanghaj, Čína). Kyselina 2-ethylmáselná byla zakoupena od společnosti Merck KGaA (Darmstadt, Německo).
6-8 týdnů starí samci myší kmene C57BL/6 (tělesná hmotnost 18-22 g) byli zakoupeni od společnosti Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Peking, Čína) a chováni v prostředí s teplotou 22 ± 2 °C s 12hodinovým cyklem světlo/tma. Myši byly krmeny standardní hlodavčí stravou s volným přístupem k pitné vodě po dobu jednoho týdne, aby si zvykly na nové prostředí. Myši byly poté náhodně rozděleny do čtyř skupin: kontrolní skupina, modelová skupina DSS, skupina léčená SASP (200 mg/kg, perorálně) a skupina léčená BLG (1 g/kg, perorálně). Jak je znázorněno na obrázku 1A, podle naší předchozí studie byla experimentální chronická recidivující kolitida u myší indukována třemi cykly 1,8% DSS po dobu 5 dnů, následovanými destilovanou vodou po dobu 7 dnů.18 Myši ve skupinách léčených SASP a BLG byly léčeny SASP a BLG každý den ode dne 0. Podle předběžných experimentů byla dávka BLG stanovena na 1 g/kg. Dávka SASP byla mezitím stanovena na 200 mg/kg dle literatury.4 Kontrolní skupina a skupina s modelem DSS dostávaly po celou dobu experimentu stejný objem vody.
Obrázek 1 BLG zmírňuje chronickou recidivující kolitidu vyvolanou DSS u myší. (A) Experimentální návrh chronické recidivující kolitidy a léčby, (B) změna tělesné hmotnosti, (C) skóre indexu aktivity onemocnění (DAI), (D) délka tlustého střeva, (E) reprezentativní obraz tlustého střeva, (F) barvení H&E. Tlusté střevo (zvětšení, ×100) a (G) histologické skóre. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM (n = 6).##p < 0,01 nebo ###p < 0,001 vs. kontrolní skupina (Con); *p < 0,05 nebo **p < 0,01 nebo ***p < 0,001 vs. skupina DSS.
Denně byly zaznamenávány tělesná hmotnost, konzistence stolice a krvácení z konečníku. Index aktivity onemocnění (DAI) byl stanoven kombinací skóre tělesné hmotnosti, konzistence stolice a krvácení z konečníku, jak bylo popsáno dříve.19 Na konci experimentu byly všechny myši utraceny a pro další experimenty byla odebrána krev, výkaly a tlusté střevo.
Tkáň tlustého střeva byla fixována formalinem a zalita do parafínu. Byly připraveny 5mikronové řezy, obarveny hematoxylin-eosinem (H&E), poté zaslepeny a vyhodnoceny dle dříve popsaného postupu.19
Celková RNA z tkáně tlustého střeva byla extrahována pomocí činidla Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) a následně extrahována cDNA reverzní transkriptázou (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japonsko). Kvantitativní PCR byla provedena za použití systému real-time PCR se SYBR Green Master (Roche, Basel, Švýcarsko). Transkripty cílových genů byly normalizovány na β-aktin a data byla analyzována metodou 2-ΔΔCT. Sekvence genových primerů jsou uvedeny v tabulce 1.
Primární izolace a kultivace buněk tlustého střeva myší byly provedeny dle dříve popsaného postupu.20 Stručně řečeno, tlusté střevo 6-8 týdnů starých myší bylo po usmrcení cervikální dislokací nejprve vyříznuto, poté podélně otevřeno, ošetřeno Hanksovým vyváženým solným roztokem (HBSS, bez vápníku a hořčíku) a nakrájeno na malé kousky o tloušťce 0,5-1 mm. Následně byly tkáně štěpeny 0,4 mg/ml kolagenázy XI (Sigma, Poole, Spojené království) ve volném médiu DMEM a centrifugovány při 300 xg po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Peletu resuspendujte v médiu DMEM (doplněném 10% fetálním bovinním sérem, 100 jednotkami/ml penicilinu a 100 µg/ml streptomycinu) při 37 °C a nechte projít nylonovou síťkou (velikost pórů ~250 µm). Alikvotní podíly buněk tlustého střeva byly umístěny do misek se skleněným dnem a inkubovány s kyselinou octovou, kyselinou propionovou, kyselinou máselnou a extrakty z myších stolic po dobu 2 hodin při 37 °C, 5 % CO2.
Tkáň tlustého střeva byla homogenizována s PBS a hladiny cytokinů IL-6, TNF-α a IL-1β v tkáni tlustého střeva byly detekovány pomocí testovacích sad luminex ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN, USA). Podobně byly hladiny GLP-1 v séru a kultivačním médiu primárních myších epiteliálních buněk tlustého střeva stanoveny pomocí soupravy ELISA (Bioswamp, Wuhan, Čína) podle pokynů výrobce.
Celková DNA z výkalů byla extrahována pomocí soupravy pro extrakci DNA (Tiangen, Čína). Kvalita a množství DNA byly měřeny v poměrech 260 nm/280 nm a 260 nm/230 nm. Následně byly s použitím každé extrahované DNA jako templátu použity specifické primery 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) a 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) k amplifikaci oblastí V3-V4 genu 16S rRNA v různých oblastech. Produkty PCR byly purifikovány pomocí soupravy QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Německo), kvantifikovány pomocí PCR v reálném čase a sekvenovány pomocí sekvenční platformy IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., CA, USA). Pro bioinformatickou analýzu bylo zpracování dat provedeno podle dříve publikovaných protokolů.21,22 Stručně řečeno, k filtrování nezpracovaných expresních souborů byl použit Cutadapt (V1.9.1). OTU byly seskupeny pomocí UPARSE (verze 7.0.1001) s hranicí podobnosti 97 % a k odstranění chimerických sekvencí byl použit program UCHIME. Analýza složení a klasifikace společenstev byly provedeny pomocí klasifikátoru RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) založeného na databázi genů ribozomální RNA SILVA.
Hladiny mastných kyselin s krátkým řetězcem (kyselina octová, kyselina propionová a kyselina máselná) byly měřeny dle dříve popsaného postupu Tao et al. s určitými úpravami.23 Stručně řečeno, 100 mg stolice bylo nejprve suspendováno v 0,4 ml deionizované vody, poté v 0,1 ml 50% kyseliny sírové a 0,5 ml kyseliny 2-ethylmáselné (vnitřní standard), poté homogenizováno a zahřáto na 4 °C. Centrifugujte při 12 000 ot/min po dobu 15 minut při teplotě 10 °C. Supernatant byl extrahován 0,5 ml etheru a vstříknut do plynového chromatografu pro analýzu. Pro analýzu plynovou chromatografií (GC) byly vzorky analyzovány pomocí plynového chromatografu GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) vybaveného plamenoionizačním detektorem (FID). Separace byla provedena pomocí kolony ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Čína). Data byla získána pomocí softwaru pro GC (Shimadzu, Inc.). Dělicí poměr byl 10:1, nosným plynem byl dusík a průtok byl 6 ml/min. Vstřikovaný objem byl 1 μl. Teplota injektoru a detektoru byla 300 °C. Teplota pece byla udržována na 140 °C po dobu 13,5 minuty, poté zvýšena na 250 °C rychlostí 120 °C/min; teplota byla udržována po dobu 5 minut.
Data jsou prezentována jako průměr ± směrodatná chyba průměru (SEM). Významnost dat byla posouzena pomocí jednofaktorové ANOVA následované Duncanovým testem více rozsahů. Pro všechny výpočty byl použit software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) a hodnota p < 0,05 byla považována za statisticky významnou.
Je dobře známo, že ulcerózní kolitida (UC) je chronické recidivující onemocnění tlustého střeva s těžkými bolestmi břicha, průjmem a krvácením. Proto byla u myší stanovena chronická recidivující kolitida indukovaná DSS (Obr. 1A), aby se vyhodnotila účinnost BLG proti kolitidě (Obr. 1A). Ve srovnání s kontrolní skupinou měly myši v modelové skupině DSS významně sníženou tělesnou hmotnost a vyšší DAI a tyto změny byly významně zvráceny po 24 dnech léčby BLG (Obrázek 1B a C). Zkrácení tlustého střeva je důležitým znakem UC. Jak je znázorněno na Obrázcích 1D a E, délka tlustého střeva u myší, které dostávaly DSS, byla významně zkrácena, ale léčba BLG jim ulevila. Následně byla provedena histopatologická analýza k posouzení zánětu tlustého střeva. H&E barvené snímky a patologické skóre ukázaly, že podávání DSS významně narušilo architekturu tlustého střeva a vedlo k destrukci krypt, zatímco léčba BLG významně snížila destrukci krypt a patologické skóre (Obrázek 1F a G). Je pozoruhodné, že ochranný účinek BLG v dávce 1 g/kg byl srovnatelný s ochranným účinkem SASP v dávce 200 mg/kg. Tato zjištění dohromady naznačují, že BLG je účinný při snižování závažnosti chronické recidivující kolitidy vyvolané DSS u myší.
TNF-α, IL-1β a IL-6 jsou důležité zánětlivé markery zánětu tlustého střeva. Jak je znázorněno na obrázku 2A, DSS indukoval významné zvýšení genové exprese TNF-α, IL-1β a IL-6 v tlustém střevě ve srovnání s kontrolní skupinou. Podávání BLG může tyto změny zprostředkované DSS významně zvrátit. Dále jsme pomocí ELISA stanovili hladiny zánětlivých cytokinů TNF-α, IL-1β a IL-6 v tkáni tlustého střeva. Výsledky také ukázaly, že hladiny TNF-α, IL-1β a IL-6 v tlustém střevě byly u myší léčených DSS významně zvýšené, zatímco léčba BLG toto zvýšení zmírnila (obrázek 2B).
Obrázek 2 BLG inhibuje genovou expresi a produkci prozánětlivých cytokinů TNF-α, IL-1β a IL-6 v tlustém střevě myší léčených DSS. (A) Exprese genů TNF-α, IL-1β a IL-6 v tlustém střevě; (B) hladiny proteinů TNF-α, IL-1β a IL-6 v tlustém střevě. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 nebo ##p < 0,01 nebo ###p < 0,001 vs. kontrolní (Con) skupina; *p < 0,05 nebo **p < 0,01 vs. skupina DSS.
Střevní dysbióza je kritická v patogenezi ulcerózní kolitidy.24 Aby se zjistilo, zda BLG moduluje střevní mikrobiotu myší léčených DSS, bylo provedeno sekvenování 16S rRNA za účelem analýzy bakteriální komunity střevního obsahu. Vennův diagram ukazuje, že tři skupiny sdílejí 385 OTU. Zároveň měla každá skupina jedinečné OTU (obr. 3A). Index Chao1 a Shannonův index zobrazené na obrázku 3B a C dále ukázaly, že diverzita komunity střevní mikrobioty byla u myší léčených BLG snížena, zatímco Shannonův index byl ve skupině léčené BLG významně snížen. Analýza hlavních komponent (PCA) a analýza hlavních souřadnic (PCoA) byly použity k určení vzorců shlukování mezi třemi skupinami a ukázaly, že struktura komunity myší léčených DSS byla po léčbě BLG jasně oddělena (obrázek 3D a E). Tato data naznačují, že léčba BLG významně ovlivnila strukturu komunity myší s kolitidou indukovanou DSS.
Obrázek 3 BLG mění diverzitu střevní mikrobioty u myší s kolitidou indukovanou DSS. (A) Vennův diagram OTU, (B) index Chao1, (C) Shannonův index bohatosti, (D) graf skóre OTU pomocí analýzy hlavních komponent (PCA), (E) obrázek skóre OTU pomocí analýzy hlavních souřadnic (PCoA). Data jsou prezentována jako průměr ± SEM (n = 6).**p < 0,01 vs. skupina DSS.
Pro posouzení specifických změn ve fekální mikrobiotě jsme analyzovali složení střevní mikrobioty na všech taxonomických úrovních. Jak je znázorněno na obrázku 4A, hlavními kmeny ve všech skupinách byly Firmicutes a Bacteroidetes, následované Verrucomicrobia. Relativní abundance Firmicutes a poměry Firmicutes/Bacteroidetes byly významně zvýšeny ve fekálních mikrobiálních společenstvech myší léčených DSS ve srovnání s kontrolními myšmi a tyto změny byly významně zvráceny po léčbě BLG. Zejména léčba BLG významně zvýšila relativní abundanci Verrucobacterium ve stolici myší s kolitidou vyvolanou DSS. Na úrovni domácností byly fekální mikrobiální společenstva obsazeny Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae a Prevotellaceae (obr. 4B). Ve srovnání se skupinou DSS, deplece BLG zvýšila abundanci Akkermansiaceae, ale snížila abundanci Lachnospiraceae a Ruminococcaceae. Je pozoruhodné, že na úrovni rodů... Fekální mikrobiota byla obsazena bakteriemi skupiny Lachnospira_NK4A136, Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001 (obr. 4C). Toto zjištění také prokázalo, že léčba BLG účinně zvrátila nerovnováhu mikrobioty v reakci na DSS, charakterizovanou poklesem skupiny Eubacterium_xylanophilum, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas a Oscillibacter a nárůstem Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001.
Obrázek 4 BLG mění početnost střevní mikrobioty u myší s kolitidou indukovanou DSS. (A) Početnost střevní mikrobioty na úrovni kmene; (B) Početnost střevní mikrobioty na úrovni čeledi; (C) Početnost střevní mikrobioty na úrovni rodu. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM (n = 6). #p < 0,05 nebo ###p < 0,001 vs. kontrolní skupina (Con); *p < 0,05 nebo **p < 0,01 nebo ***p < 0,001 vs. skupina DSS.
Vzhledem k tomu, že mastné kyseliny s krátkým řetězcem (SCFA) jsou hlavními metabolity Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001, zatímco acetát, propionát a butyrát jsou nejhojnějšími SCFA ve střevním lumenu,25-27 stále jsme v naší studii. Jak je znázorněno na obrázku 5, koncentrace acetátu, propionátu a butyrátu ve stolici byly ve skupině léčené DSS významně sníženy, zatímco léčba BLG mohla toto snížení do značné míry potlačit.
Obrázek 5. BLG zvyšuje hladiny SCFA ve stolici myší s kolitidou indukovanou DSS. (A) Obsah kyseliny octové ve stolici; (B) obsah kyseliny propionové ve stolici; (C) obsah kyseliny máselné ve stolici. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM (n = 6). #p < 0,05 nebo ##p < 0,01 vs. kontrolní skupina (Con); *p < 0,05 nebo **p < 0,01 vs. skupina DSS.
Dále jsme vypočítali Pearsonův korelační koeficient mezi diferenciálními SCFA na úrovni rodu a fekální mikrobiotou. Jak je znázorněno na obrázku 6, Akkermansia pozitivně korelovala s produkcí kyseliny propionové (Pearson = 0,4866) a kyseliny máselné (Pearson = 0,6192). Naproti tomu Enteromonas i Oscillobacter negativně korelovaly s produkcí acetátu s Pearsonovými koeficienty 0,4709 a 0,5104. Podobně Ruminococcaceae_UCG-014 negativně koreloval s produkcí kyseliny propionové (Pearson = 0,4508) a kyseliny máselné (Pearson = 0,5842).
Obrázek 6 Pearsonova korelační analýza mezi diferenciálními SCFA a kolonickými mikroby. (A) Enteromonas s kyselinou octovou; (B) Bacil otřesu mozku s kyselinou octovou; (C) Akkermansia vs. kyselina propionová; (D) Ruminococcus_UCG-014 s kyselinou propionovou; (E) Akkermansia s kyselinou máselnou; (F) Ruminococcus_UCG-014 s kyselinou máselnou.
Glukagonu podobný peptid-1 (GLP-1) je buněčně specifický posttranslační produkt proglukagonu (Gcg) s protizánětlivými vlastnostmi.28 Jak je znázorněno na obrázku 7, DSS indukoval významný pokles exprese mRNA Gcg. Léčba tlustého střeva a BLG mohla významně zvrátit snížení Gcg indukované DSS ve srovnání s kontrolní skupinou (obr. 7A). Zároveň byla hladina GLP-1 v séru ve skupině léčené DSS významně snížena a léčba BLG mohla tomuto snížení do značné míry zabránit (obr. 7B). Vzhledem k tomu, že mastné kyseliny s krátkým řetězcem mohou stimulovat sekreci GLP-1 prostřednictvím aktivace receptoru spřaženého s G-proteinem 43 (GRP43) a receptoru spřaženého s G-proteinem 41 (GRP41), zkoumali jsme také GPR41 a GRP43 v tlustém střevě myší s kolitidou a zjistili jsme, že exprese mRNA GRP43 a GPR41 v tlustém střevě byla po expozici DSS významně snížena a léčba BLG mohla tyto poklesy účinně zastavit (obrázek 7C a D).
Obrázek 7 BLG zvyšuje hladiny GLP-1 v séru a expresi mRNA Gcg, GPR41 a GRP43 v tlustém střevě u myší léčených DSS. (A) Exprese mRNA Gcg v tkáni tlustého střeva; (B) Hladina GLP-1 v séru; (C) Exprese mRNA GPR41 v tkáni tlustého střeva; (D) Exprese mRNA GPR43 v tkáni tlustého střeva. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 nebo ##p < 0,01 vs. kontrolní (Con) skupina; *p < 0,05 vs. skupina DSS.
Vzhledem k tomu, že léčba BLG mohla u myší léčených DSS zvýšit hladiny GLP-1 v séru, expresi mRNA Gcg v tlustém střevě a hladiny SCFA ve stolici, dále jsme zkoumali acetát, propionát a butyrát, stejně jako u kontrolních myší (F-Con), myší s kolitidou DSS (F-Con) (DSS) a myší s kolitidou léčenou BLG (F-BLG) na uvolňování GLP-1 z primárních myších epiteliálních buněk tlustého střeva. Jak je znázorněno na obrázku 8A, primární myší epiteliální buňky tlustého střeva ošetřené 2 mM kyselinou octovou, kyselinou propionovou a kyselinou máselnou významně stimulovaly uvolňování GLP-1, což je v souladu s předchozími studiemi.29,30 Podobně všechny F-Con, F-DSS a F-BLG (ekvivalent 0,25 g stolice) výrazně stimulovaly uvolňování GLP-1 z primárních myších epiteliálních buněk tlustého střeva. Je pozoruhodné, že množství GLP-1 uvolněného primárními myšími epiteliálními buňkami tlustého střeva ošetřenými F-DSS bylo mnohem nižší než u primárních myší ošetřených F-Con a F-BLG. buňky tlustého střeva (obrázek 8B). Tato data naznačují, že léčba BLG významně obnovila produkci GLP-1 odvozeného ze střevních SCFA.
Obrázek 8 SCFA odvozená z BLG stimuluje uvolňování GLP-1 z primárních myších buněk tlustého střeva. (A) Kyselina octová, kyselina propionová a kyselina máselná stimulovaly uvolňování GLP-1 z primárních myších buněk tlustého střeva; (B) fekální extrakty F-Con, F-DSS a F-BLG stimulovaly primární myší buňky tlustého střeva. Množství uvolněného GLP-1. Alikvotní podíly buněk tlustého střeva byly umístěny do Petriho misek se skleněným dnem a ošetřeny 2 mM kyselinou octovou, kyselinou propionovou, kyselinou máselnou a fekálními extrakty F-Con, F-DSS a F-BLG (ekvivalent 0,25 g stolice). 2 hodiny při 37 °C, 5 % CO2. Množství GLP-1 uvolněného z primárních myších buněk tlustého střeva bylo detekováno metodou ELISA. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM (n = 3). #p < 0,05 nebo ##p < 0,01 vs. slepá směs nebo F-Con; *p < 0,05 vs. F-DSS.
Zkratky: Ace, kyselina octová; Pro, kyselina propionová; nicméně kyselina máselná; F-Con, fekální extrakt z kontrolních myší; F-DSS, fekální extrakt z myší s kolitidou; F-BLG, z tlustého střeva ošetřeného BLG. Fekální extrakty zánětlivých myší.
Ulcerózní kolitida, kterou Světová zdravotnická organizace zařadila mezi refrakterní onemocnění, se stává globálním nebezpečím; Účinné metody pro predikci, prevenci a léčbu tohoto onemocnění jsou však stále omezené. Proto je naléhavě nutné prozkoumat a vyvinout nové bezpečné a účinné terapeutické strategie pro ulcerózní kolitidu (UC). Přípravky tradiční čínské medicíny jsou slibnou možností, protože mnoho přípravků tradiční čínské medicíny se v průběhu staletí ukázalo jako účinné při léčbě UC u čínské populace a všechny se jedná o biologické organické látky a přírodní materiály, které jsou většinou neškodné pro lidi i zvířata.31,32 Cílem této studie bylo najít bezpečný a účinný přípravek tradiční čínské medicíny pro léčbu UC a prozkoumat jeho mechanismus účinku. BLG je známý čínský bylinný přípravek používaný k léčbě chřipky.8,33 Práce v naší laboratoři a dalších ukázala, že indigo, zpracovaný produkt tradiční čínské medicíny ze stejné suroviny jako BLG, vykazuje významnou účinnost při léčbě UC u lidí i zvířat.4,34 Účinky BLG proti kolitidě a jeho mechanismus však nejsou jasné. V současné studii naše výsledky ukazují, že BLG účinně zmírňuje zánět tlustého střeva vyvolaný DSS, který je spojen s modulací střevní mikrobioty. a obnovení produkce GLP-1 ve střevech.
Je dobře známo, že ulcerózní kolitida se vyznačuje relabujícími obdobími s typickými klinickými rysy, jako je úbytek hmotnosti, průjem, krvácení z konečníku a rozsáhlé poškození sliznice tlustého střeva.35 Chronická relabující kolitida byla tedy podávána podáváním tří cyklů 1,8% DSS po dobu pěti dnů, po nichž následovalo sedm dní pití vody. Jak je znázorněno na obrázku 1B, kolísavý úbytek hmotnosti a skóre DAI naznačovaly úspěšnou indukci chronické relabující kolitidy. Myši ve skupině léčené BLG vykazovaly od 8. dne zotavení směrem nahoru, což se významně lišilo od 24. dne. Stejné změny byly pozorovány i ve skóre DAI, což naznačuje zlepšení klinického stavu kolitidy. Pokud jde o poškození tlustého střeva a zánětlivý stav, délka tlustého střeva, poškození tkáně tlustého střeva a genová exprese a produkce prozánětlivých cytokinů TNF-α, IL-1β a IL-6 v tkáni tlustého střeva se po léčbě BLG také výrazně zlepšily. Tyto výsledky dohromady jasně ukazují, že BLG je účinný při léčbě chronické relabující kolitidy u myší.
Jak BLG uplatňuje své farmakologické účinky? Četné předchozí studie ukázaly, že střevní mikrobiota hraje klíčovou roli v patogenezi ulcerózní kolitidy (UC) a terapie založené na mikrobiomu a zaměřené na mikrobiom se ukázaly jako velmi atraktivní strategie pro léčbu UC. V této studii jsme prokázali, že léčba BLG vedla k významným změnám ve složení střevní mikrobioty, což naznačuje, že ochranný účinek BLG proti kolitidě vyvolané DSS souvisí s modulací střevní mikrobioty. Toto pozorování je v souladu s představou, že přeprogramování homeostázy střevní mikrobioty je důležitým přístupem k pochopení účinnosti přípravků tradiční čínské medicíny (TCM).36,37 Je pozoruhodné, že Akkermansia je gramnegativní a striktně anaerobní bakterie, která žije ve vrstvě hlenu střeva, degraduje muciny, produkuje kyselinu propionovou, stimuluje diferenciaci pohárkových buněk a udržuje integritu slizniční bariéry.26 Mnohočetné klinické a zvířecí údaje naznačují, že Akkermansia je silně asociována se zdravou sliznicí,38 a perorální podávání Akkermansia spp. může významně zlepšit zánět sliznice.39 Naše současné údaje naznačují, že relativní hojnost Akkermansia se po léčbě BLG významně zvyšuje. Kromě toho je Prevotellaceae_UCG-001 bakterie produkující SCFA.27 Více studií ukázalo, že Prevotellaceae_UCG-001 byl nalezen v nízké relativní hojnosti ve stolici zvířat s kolitidou.40,41 Naše současné údaje také ukazují, že léčba BLG může významně zvýšit relativní hojnost Prevotellaceae_UCG-001 v tlustém střevě myší léčených DSS. Naproti tomu Oscillibacter je mezofilní, striktně anaerobní bakterie.42 uvádí, že relativní hojnost Oscillibacter byla významně zvýšena u myší s UC a byla významně pozitivně korelována s hladinami IL-6 a IL-1β a patologickým skóre.43,44 Je pozoruhodné, že léčba BLG významně snížila relativní hojnost Oscillibacter ve stolici myší léčených DSS. Je pozoruhodné, že tyto bakterie s pozměněným BLG byly nejvíce produkujícími SCFA. Četné předchozí studie prokázaly potenciální prospěšné účinky SCFA. na zánět tlustého střeva a ochranu integrity střevního epitelu.45,46 Naše současná data také pozorovala, že koncentrace acetátu, propionátu a butyrátu SCFA ve stolici ošetřené DSS byly u myší léčených BLG výrazně zvýšené. Celkově tato zjištění jasně ukazují, že léčba BLG může účinně zvýšit bakterie produkující SCFA indukované DSS u myší s chronickou relabující kolitidou.
GLP-1 je inkretin produkovaný hlavně v ileu a tlustém střevě a hraje důležitou roli v oddálení vyprazdňování žaludku a snižování postprandiální hladiny glukózy v krvi.47 Důkazy naznačují, že dipeptidylpeptidáza (DPP)-4, agonista receptoru GLP-1, a nanoléčivo GLP-1 mohou účinně zmírnit střevní zánět u myší.48-51 Jak bylo uvedeno v předchozích studiích, vysoké koncentrace SCFA byly spojeny s plazmatickými hladinami GLP-1 u lidí a myší.52 Naše současná data ukazují, že po léčbě BLG byly hladiny GLP-1 v séru a exprese mRNA Gcg významně zvýšeny. Podobně byla sekrece GLP-1 významně zvýšena v kolonických kulturách po stimulaci fekálními extrakty z myší s kolitidou léčených BLG ve srovnání se stimulací fekálními extrakty z myší s kolitidou léčených DSS. Jak SCFA ovlivňují uvolňování GLP-1? Gwen Tolhurst a kol. uvádí, že SCFA mohou stimulovat sekreci GLP-1 prostřednictvím GRP43 a GPR41.29 Naše současná data také ukazují, že léčba BLG významně zvyšuje expresi mRNA GRP43 a GPR41 v tlustém střevě myší léčených DSS. Tato data naznačují, že léčba BLG může obnovit produkci GLP-1 podporovanou SCFA aktivací GRP43 a GPR41.
BLG je v Číně dlouhodobě volně prodejný lék (OTC). Maximální tolerovaná dávka BLG u myší z Kunmingu je 80 g/kg a nebyla pozorována žádná akutní toxicita.53 V současné době je doporučená dávka BLG (bez cukru) u lidí 9-15 g/den (3krát denně). Naše studie ukázala, že BLG v dávce 1 g/kg zmírňuje chronickou recidivující kolitidu vyvolanou DSS u myší. Tato dávka se blíží dávce BLG používané klinicky. Naše studie také zjistila, že jeho mechanismus účinku je alespoň zčásti zprostředkován změnami ve střevní mikrobiotě, konkrétně bakteriemi produkujícími SCFA, jako jsou Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001, s cílem obnovit produkci GLP-1 ve střevě. Tato zjištění naznačují, že BLG si zaslouží další zvážení jako potenciální terapeutické činidlo pro klinickou léčbu kolitidy. Přesný mechanismus, kterým moduluje střevní mikrobiotu, však musí být dosud potvrzen pomocí myší s deficitem mikrobioty a transplantací bakterií ve stolici.
Ace, kyselina octová; but, kyselina máselná; BLG, pandan; DSS, dextransulfát sodný; DAI, index aktivity onemocnění; DPP, dipeptidylpeptidáza; FID, plamenoionizační detektor; F-Con, kontrola; Fekální extrakty myší; F-DSS, fekální extrakty myší s kolitidou DSS; F-BLG, fekální extrakty myší s kolitidou léčených BLG; GLP-1, glukagonu podobný peptid-1; Gcg, glukagon; plynová chromatografie, plynová chromatografie; GRP43, receptor spřažený s G proteinem 43; GRP41, receptor spřažený s G proteinem 41; H&E, hematoxylin-eosin; HBSS, Hanksův vyvážený solný roztok; OTC, OTC; PCA, analýza hlavních komponent; PCoA, analýza hlavních koordinátů; Pro, kyselina propionová; SASP, sulfasalazin; SCFA, mastné kyseliny s krátkým řetězcem; čínská medicína, tradiční čínská medicína; UC, ulcerózní kolitida.
Všechny experimentální protokoly byly schváleny Komisí pro etiku zvířat Pekingské univerzity Shenzhen-Hong Kong University of Science and Technology Medical Center (Shenzhen, Čína) v souladu s Institucionálními směrnicemi a předpisy pro zvířata (etické číslo A2020157).
Všichni autoři významně přispěli ke koncepci a designu, sběru dat nebo analýze a interpretaci dat; podíleli se na přípravě článku nebo kritické revizi důležitého intelektuálního obsahu; souhlasili s odesláním rukopisu do aktuálního časopisu; nakonec schválili verzi k publikaci; byli zodpovědní za všechny aspekty práce.
Tuto práci podpořila Národní nadace pro přírodní vědy Číny (81560676 a 81660479), prvotřídní projekt Univerzity v Šen-čenu (86000000210), Fond výboru pro vědecké a technologické inovace v Šen-čenu (JCYJ20210324093810026) a Fond pro výzkum lékařských věd a technologií provincie Guangdong (A2020157 a A2020272), lékárna Lékařské univerzity v Kuej-čou financovaná společností Key Laboratory (YWZJ2020-01) a nemocnice Pekingské univerzity v Šen-čenu (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B a kol. Terapeutický potenciál triptolidu jako protizánětlivého činidla u experimentální kolitidy vyvolané dextranem síranem sodným u myší. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. Globální zátěž IBD: od roku 2015 do roku 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727.doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue a kol. Rostlinné alkaloidy: slibné modifikátory onemocnění u zánětlivých onemocnění střev. Prepharmacology. 2019; 10: 351. doi: 10. 3389/fphar. 2019. 00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B a kol. Indigo Naturalis inhibuje oxidační stres tlustého střeva a reakce Th1/Th17 u kolitidy indukované DSS u myší. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019: 9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Účinnost a bezpečnost čínské bylinné medicíny Sophora flavescens (Sophora flavescens) v léčbě ulcerózní kolitidy: klinické důkazy a potenciální mechanismy. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Přírodní produkty: experimentálně účinné léky pro léčbu zánětlivých onemocnění střev. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913.doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Úvahy o adjuvantní léčbě ulcerózní kolitidy pomocí tradiční čínské medicíny. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283.doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT a kol. Účinnost a bezpečnost granulí Banlangen při léčbě sezónní chřipky: protokol studie pro randomizovanou kontrolovanou studii. trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x