Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu pro CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v prohlížeči Internet Explorer). Mezitím budeme web zobrazovat bez stylů a JavaScriptu, abychom zajistili jeho nepřetržitou podporu.
Na rozdíl od obratlovců se všeobecně předpokládá, že hmyz postrádá samčí pohlavní steroidní hormony. U druhu Anopheles gambiae se zdá, že ekdysonový steroid 20-hydroxyekdyson (20E) se vyvinul tak, aby kontroloval vývoj vajíček, když je syntetizován samicemi2, a aby indukoval refrakterní období páření, když je samci přenášejí3. Vzhledem k tomu, že vývoj vajíček a páření jsou základními reprodukčními znaky, pochopení toho, jak samice komárů Anopheles integrují tyto hormonální signály, by mohlo usnadnit návrh nových programů na kontrolu malárie. Zde odhalujeme, že tyto reprodukční funkce jsou regulovány odlišnými pohlavními steroidy prostřednictvím komplexní sítě enzymů aktivujících/inaktivujících ekdysteroidy. Identifikovali jsme samčí specifický oxidovaný ekdyson, 3-dehydro-20E (3D20E), který chrání rodičovství tím, že po pohlavním přenosu a aktivaci defosforylací vypne samičí sexuální receptivitu. Je pozoruhodné, že přenos 3D20E také indukoval expresi reprodukčních genů, které udržují vývoj vajíček během infekce Plasmodiem, a tím zajišťuje zdraví infikovaných samic. 20E odvozený od samic nevyvolává sexuální reakci. ale umožňuje pářícím se jedincům klást vajíčka poté, co jsou inhibovány kinázy inhibující 20E. Identifikace tohoto samčího specifického hmyzího steroidního hormonu a jeho role v regulaci sexuální vnímavosti, plodnosti a interakce s Plasmodiem naznačuje potenciál pro snížení reprodukční úspěšnosti komárů přenášejících malárii.
Počet případů malárie a úmrtí na ni opět roste4 kvůli rozšířené rezistenci na insekticidy u komárů rodu Anopheles, jediných přenašečů lidských parazitů malárie. Párovací biologie těchto komárů je obzvláště atraktivním cílem pro nové intervence v oblasti kontroly malárie, protože samice se páří pouze jednou5; sterilní provedení tohoto jednorázového páření by mělo velký potenciál ke snížení populace komárů v terénu.
Ženy se stávají sexuálně neschopnými po podání vysokých titrů steroidních hormonů od mužů. Studie ukázaly, že spouštěčem obtíží s dalším pářením je 20-hydroxyekdyson (20E), steroidní hormon lépe známý jako regulátor cyklu svlékání v larválním stádiu. Schopnost samců syntetizovat a přenášet 20E se vyvinula specificky u druhů Anopheles, které patří do podrodu Cellia7, který je rozšířen v Africe a zahrnuje nejnebezpečnější přenašeče malárie, včetně Anopheles gambiae. To je obzvláště pozoruhodné, protože u těchto druhů samice také produkují 20E po každém příjmu krve a 20E řídí cyklus oogeneze (viz odkaz 8). Je však málo známo o způsobu, jakým samice integrují signály ze dvou různých zdrojů ekdysonu (přenos samcem a indukce krmení krví), aniž by ohrozily svou vlastní schopnost páření. Ve skutečnosti, pokud 20E produkovaný samicemi spustí sexuální intoleranci, povede to k neplodnosti u jedinců krmících se pannou, což je u těchto komárů velmi časté chování5.
Možným vysvětlením je, že samci A. gambiae přenášejí modifikovaný samčí specifický ekdyson, který aktivuje signální kaskádu v samičím reprodukčním traktu, což vede k nestabilitě páření. Ačkoli obratlovci mají více steroidních hormonů, jako je estrogen a androgen (viz odkaz 9), podle našich znalostí nebyly u hmyzu identifikovány androgenně ovlivněné steroidy.
Naším cílem bylo stanovit repertoár steroidních hormonů v samčí přídatné žláze (MAG) pohlavně dospělého druhu A. gambiae a hledat možné modifikující steroidy. Pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií (HPLC-MS/MS) namísto dříve používané méně specifické metody jsme v této tkáni detekovali ekdyson (E) a 20E, což potvrdilo předchozí výsledek. Vzorek však byl dominován oxidovanými fosforylovanými steroidy, odpovídajícími vzorci 3-dehydro-20E-22-fosfát (3D20E22P)12 (obrázek 1). Mezi další formy patří 3-dehydro-20E (3D20E) a 20E-22-fosfát (20E22P). Intenzita signálu HPLC-MS/MS 3D20E22P byla o dva řády vyšší než u jeho defosforylované formy 3D20E a o tři řády vyšší než u E a 20E (obrázek 1). Ačkoli v jiných částech těla a dolních reprodukčních cestách... (LRT; rozšířená data, obr. 1a). Analyzovali jsme také ekdysteroidy u nově uzavřených (<1 den starých) samců a samic a detekovali jsme 3D20E a 3D20E22P pouze v MAG; E, 20E a 20E22P byly přítomny u obou pohlaví (rozšířená data, obr. 1b). Tato data naznačují, že dospělí samci A. gambiae produkují ve svých MAG vysoké titry modifikujících hormonů, které samice nesyntetizují.
MAG a samičí LRT (včetně síní, semenných váčků a parovaria) byly odebrány ze 4denních (4denních) panenských samců a panenských a spářených samic (0,5, 3 a 12 hpm). Ekdyson v těchto tkáních byl analyzován pomocí HPLC-MS/MS (průměr ± standardní hodnota; nepárový t-test, oboustranný, korigován na míru falešných objevů (FDR); NS, nevýznamné; *P < 0,05, **P < 0,01). 3D20E: 3 hodiny vs. 0,5 hodiny, P = 0,035; 12 hodin vs. 3 hodiny, P = 0,0015; 12 hodin vs. 0,5 hodiny, P = 0,030. 3D20E22P: 3 hodiny vs. 0,5 hodiny, P = 0,25; 12 hodin vs. 3 hodiny, P = 0,0032; 12 hodin vs. 0,5 hodiny, P = 0,015). Data pocházejí ze tří biologických replikátů. Plocha píku pro každý sledovaný ekdyson byla vypočtena a normalizována podle počtu komárů. Ekdyson je barevně znázorněn takto: E, zelená; 20E, oranžová; 20E22P, fialová; 3D20E, modrá; 3D20E22P, růžová. Vložený obrázek zvětšuje měřítko na ose y, aby znázornil nižší hladiny ekdysonu.
Abychom zjistili, zda se 3D20E22P a 3D20E přenášejí během páření, rozebrali jsme samičí LRT v různých časových bodech po páření. Ačkoli ekdyson nebyl u panenských samic nalezen, pozorovali jsme značné množství 3D20E22P v LRT bezprostředně po páření (0,5 hodiny po páření, hpm), které se časem snižovalo, zatímco hladiny 3D20E se významně zvyšovaly (obr. 1). Použitím chemicky syntetizovaného 3D20E jako standardu jsme zjistili, že hladiny tohoto steroidního hormonu v pářících se LRT byly nejméně 100krát vyšší než 20E (tabulka rozšířených dat 1). 3D20E22P je tedy hlavní samčí ekdyson, který se během páření přenáší do samičích LRT, a jeho defosforylovaná forma, 3D20E, se krátce po páření stává vysoce hojnou. To naznačuje důležitou roli tohoto ekdysonu v biologii samic po páření.
Po vygenerování nové datové sady RNA sekvenování (RNA-seq) (obr. 2a) jsme pomocí speciálně vytvořeného bioinformatického pipeline hledali gen pro ekdysonkinázu (EcK), ekdysonoxidázu (EO) a ekdyson kódující 20E-modifikovanou fosfatázu. EPP) je exprimován v reprodukčních tkáních. Identifikovali jsme jeden kandidátní gen EPP a dva potenciální geny EcK (EcK1 a EcK2), ale nepodařilo se nám najít vhodný kandidátní gen EO. Je pozoruhodné, že jednotlivé geny EPP byly exprimovány ve vysokých hladinách (98,9. percentil) v gambijských MAG, ale ne v samičích LRT (obr. 2b), což je v rozporu s naším očekáváním, protože v této samičí tkáni došlo k defosforylaci 3D20E22P. Proto se domníváme, že samčí EPP může být během páření přenesen. Ve skutečnosti jsme použili in vivo značení stabilními izotopy k maskování samičího proteinu po páření, enzymu identifikovaného MS v samičí síni (obr. 2c a doplňková tabulka 1). Přítomnost EPP u MAG a spářených (ale ne panenských) samic LRT byl také potvrzen pomocí specifických protilátek (obr. 2d).
a, Na míru vytvořený bioinformatický kanál pro vyhledávání genů kódujících EcK, EO a EPP v reprodukčních tkáních každého pohlaví. Čísla vedle šipek označují počet kandidátů samčích a samičích genů v každém kroku. Tato analýza identifikovala jeden gen EPP (EPP) a jeden gen EcK (EcK1), které jsou exprimovány u samců, a jeden gen EcK (EcK2), který je exprimován u obou pohlaví, ale nevede k nalezení kandidátního genu EO.b, Teplotní mapa porovnávající expresi kandidátních genů v panenských (V) a pářících se (M) tkáních Anopheles gambiae a Anopheles albicans. Spca, oplodnění; MAG, pomocné žlázy u samců; jiné části těla, včetně prsou, křídel, nohou, tukových těl a vnitřních orgánů u obou pohlaví a vaječníků u samic. EcK2 je vysoce exprimován jak v MAG, tak v síních Gambie, zatímco EPP se nachází pouze v MAG.c, Proteomická analýza translokace skupiny mužského ejakulátu do síní samiček ve 3, 12 a 24 hpm, která ukazuje 67 nejhojnějších proteinů. Samice byly chovány na dietě obsahující 15N pro značení (a maskování) všech proteinů. Neznačení samci byli spářeni se značenými samicemi a LRT samic byly preparovány ve 3, 12 a 24 hpm pro proteomickou analýzu (úplný seznam ejakulačních proteinů viz doplňková tabulka 1). V vložené tabulce byly EPP, Eck1 a EcK2 detekovány v MAG panenských samců proteomickou analýzou těchto tkání.d, EPP byl detekován Western blotem v MAG a LRT spářených samic, ale ne u panenských samic ani samců ani ve zbytku těla samice. Membrány byly současně sondováno protilátkami proti aktinu (kontrola náplně) a anti-EPP. Všichni samci jsou panni. Zdrojová data z gelu viz doplňkový obrázek 1. Western bloty byly provedeny dvakrát s podobnými výsledky.
Aktivita ekdysteroidní fosfofosfatázy EPP byla ověřena po inkubaci pomocí HPLC-MS/MS s 3D20E22P izolovaným z MAG (rozšířená data, obr. 2a). Dále, když jsme umlčeli EPP pomocí RNA-zprostředkované interference (RNAi), detekovali jsme silné snížení aktivity fosfatázy v reprodukčních tkáních těchto samců (obr. 3a) a samice pářené se samci s umlčeným EPP vykazovaly významně nižší podíl defosforylovaného 3D20E (obr. 3b) i přes částečné umlčení genů (rozšířená data, obr. 2b,c). Naproti tomu jsme u stejných komárů nezjistili významné změny v poměru 20E22P/20E, což by mohlo naznačovat, že enzym je specifický pro 3D20E22P (obr. 3b).
a, Snížená aktivita fosfatázy v MAG způsobená umlčováním EPP za použití kontrol s dvouvláknovou EPP RNA (dsEPP) nebo dvouvláknovou GFP RNA (dsGFP). V každém opakování bylo použito dvacet MAG poolů (P = 0,0046, párový t-test, oboustranný), znázorněných samostatnými tečkami.b, Samice pářené se samci s umlčeným EPP měly významně nižší podíl defosforylované 3D20E při 3 hpm (P = 0,0043, nepárový t-test, oboustranný), zatímco hladiny 20E nebyly ovlivněny (P = 0,063, nepárové). t-test, oboustranný). Data jsou prezentována jako průměr ± standardní hodnota ze tří souborů po 13, 16 a 19 samicích. c, Samice pářené se samci s umlčeným EPP měly významně vyšší míru opětovného páření (P = 0,0002, Fisherův exaktní test, oboustranný). Samice byly nejprve nuceny se pářit, aby si zajistily pářící status; O 2 dny později byli kontaktováni s dalšími samci nesoucími transgenní spermie, aby se pomocí kvantitativní PCR detekce transgenu posoudila míra opětovného páření.d Samice krmené krví pářené se samci s umlčeným EPP měly významně sníženou plodnost (P < 0,0001; Mann-Whitneyův test, oboustranný) a mírně snížený počet vajíček (P = 0,088, Mann-Whitneyův test, oboustranný), zatímco míra tření nebyla ovlivněna (P = 0,94, Fisherův exaktní test, oboustranný). Ve všech panelech n představuje počet biologicky nezávislých vzorků komárů.NS, nevýznamné.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Dále jsme posoudili, zda je defosforylace ekdysonu důležitá pro vyvolání rezistence k páření u samic. Je pozoruhodné, že samice pářící se se samci s deplecí EPP se znovu pářily s mnohem vyšší frekvencí (44,9 %) než kontrolní samice (10,4 %), když byly vystaveny dalším (transgenním) samcům (obr. 3c). Také jsme pozorovali významný pokles plodnosti (obr. 3d, vlevo) a mírný pokles počtu vajíček nakladených těmito samicemi (obr. 3d, uprostřed), zatímco procento vajíček nakladených samicemi (další reakce vyvolaná u samic pářením) nebylo ovlivněno (obr. 3d, vpravo). Vzhledem k pozorované specificitě EPP pro 3D20E22P tyto výsledky naznačují, že aktivace 3D20E pomocí EPP přeneseného během páření může hrát důležitou roli v potlačení vnímavosti samic k dalšímu páření, což je chování dříve připisované sexuálnímu přenosu 20E. Tento samec-specifický hormon proto také silně ovlivňuje plodnost samic.
Dále jsme porovnali aktivitu 20E a 3D20E v injekčních experimentech u pohlavně zralých panen s použitím chemicky syntetizovaného 3D20E (obr. 4a–c) a komerčně dostupného 20E. Zjistili jsme, že 3D20E byl významně účinnější než 20E při potlačování citlivosti samic na páření v obou koncentracích (obr. 4d). Je pozoruhodné, že poloviční fyziologická hladina 3D20E v LRT (1 066 pg po injekci vs. 2 022 pg po páření) indukovala podíl refrakterních samic, který byl 20krát vyšší než fyziologická hladina 20E (361 pg po injekci) 24 hodin po injekci při nejvyšší koncentraci 18 pg po páření; Rozšířená data (Tabulka 1). Tento výsledek je v souladu s představou, že sexuální přenos 20E nezpůsobuje refrakterní období páření, a dále ukazuje na 3D20E jako hlavní faktor při zajišťování vztahu rodič-dítě. 3D20E byl také významně aktivnější než 20E v testech kladení vajec u panenských samic (Obr. 4e), což naznačuje, že normální míra kladení vajec, kterou jsme pozorovali po částečném umlčení EPP, byla způsobena přítomností zbytkové aktivity 3D20E, která je stále produkována faktory indukovanými pářením u samic.
(a,b) 3D20E chemicky syntetizovaný z 20E (a) s velmi vysokou konverzní/účinností (data prezentována jako průměr ± standardní odchylka ze tří nezávislých syntetických reakcí) (b).c, Hmotnostní spektrum (dolní polovina) přesně odpovídá ekdysonu nalezenému u spářených samičích LRT (horní polovina).d, Ve srovnání s 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisherův přesný test, oboustranný) a 10% ethanolem (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisherův přesný test, oboustranný), zatímco 20E byl významně vyšší než kontrola pouze při vyšších dávkách (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fisherův přesný test, oboustranný).e, Injekce 3D20E indukovala významně vyšší míra tření u panenských samic než u kontrol s 10% ethanolem (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fisherův přesný test, oboustranný), zatímco 20E ve srovnání s kontrolami pouze při vyšších dávkách (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fisherův přesný test, oboustranný). 3D20E indukoval významně vyšší míru tření než 20E při vyšších dávkách (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fisherův přesný test, oboustranný). Ve všech panelech n představuje počet biologicky nezávislých vzorků komárů. NS, nevýznamné. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Data pocházejí ze tří... replikuje.
V předchozích studiích jsme zjistili, že sexuální přenos steroidních hormonů indukuje expresi MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), samičího reprodukčního genu, který chrání samice A. gambiae před infekcí P. falciparum. Zdravotní náklady způsobené 13, nejsmrtelnějším lidským parazitem malárie. Vzhledem k významu MISO pro reprodukční zdatnost Anopheles v oblastech s endemickou malárií jsme se rozhodli zjistit, který hormon, 3D20E nebo 20E, spouští expresi tohoto genu. Zjistili jsme, že zatímco injekce 20E specificky nebo účinněji indukovala některé jaderné hormonální receptory (HR), jako jsou HR3 a HR4, a typické downstream steroidní cíle, jako jsou yolkogenní geny Vg14, 15, 16, MISO byl silněji indukován 3D20E (rozšířená data, obr. 3). Zdá se tedy, že sexuální přenos tohoto androgenního steroidního hormonu indukuje mechanismy, které chrání samice před náklady způsobenými parazitární infekcí. 3D20E dále odlišně ovlivňuje obě izoformy E receptor EcR, indukující EcR-A a potlačující EcR-B, a silněji aktivující další geny indukující páření, včetně HPX15, který ovlivňuje samičí fertilitu. To by mohlo vysvětlovat významnou neplodnost pozorovanou u samic pářených se samci s umlčeným EPP (Rozšířená data, obr. 3). Tato data naznačují existenci následných drah přednostně aktivovaných dvěma ekdyzonovými hormony, které mohou být základem pohlavně specifické funkce.
Dále jsme testovali funkci dvou genů EcK identifikovaných v našem bioinformatickém pipeline. Umlčení EcK1 nebo EcK2 vedlo k významné úmrtnosti u samců (rozšířená data, obr. 4a), což naznačuje, že fosforylace ekdysonu, a tedy jeho inaktivace, je důležitá pro přežití. Protože EcK2 byl exprimován ve vyšších hladinách než EcK1 a byl detekován v MAG pomocí proteomiky (obr. 2b,c a doplňková tabulka 2), validovali jsme jeho ekdysteroidní kinázovou aktivitu inkubací s 20E, což vedlo k fosforylaci 20E22P (rozšířená data, obrázek 2).4b). Při použití 3D20E jako substrátu jsme nebyli schopni detekovat fosforylovaný produkt 3D20E22P (rozšířená data, obr. 4c), což naznačuje, že preferovaným cílem EcK2 může být 20E spíše než 3D20E.
Podle naší analýzy RNA-seq byl EcK2 také vysoce exprimován v LRT panenských samic, kde byl po páření vypnut (obr. 2b). Tato data jsme potvrdili a zjistili, že exprese EcK2 nebyla ovlivněna krmením krví (rozšířená data, obr. 5a). Rozšířením našich počátečních MS experimentů jsme zjistili, že vrchol 20E22P úzce souvisel s vrcholem 20E (22–26 hodin po krevním moučení; rozšířená data, obr. 5b). Umlčení EcK2 u panenských samic vedlo k trojnásobnému zvýšení relativního poměru 20E k 20E22P 26 hodin po krevním moučení (rozšířená data, obrázky 2c a 5c), což potvrzuje, že EcK2 také fosforyluje 20E u samic. Je pozoruhodné, že panenské samice s deplecí EcK2 si zachovaly plnou sexuální receptivitu (rozšířená data, obr. 5d,e), což dále naznačuje, že produkce 20E u samic neindukuje refrakterní období páření. Tyto samice však měly významně... zvýšená míra kladení vajec ve srovnání s kontrolami, přičemž více než 30 % panenských samic kladlo vajíčka (rozšířená data, obr. 5f). Pokud byly injekce dvouvláknové Eck2 RNA (dsEcK2) provedeny po krmení krví, k tření nedošlo a v tomto okamžiku vrchol 20E způsobený požitím krve poklesl. Celkově tyto výsledky podporují model, že 20E produkovaná po sání krve může vyvolat tření, ale pouze tehdy, když je blok tření (EcK2 a možná i další faktory) vypnut pářením. Ani injekce 20E, ani 3D20E neinhibovaly expresi EcK2 u panenských samic (rozšířená data, obr. 5g), což naznačuje, že inhibici této kinázy zprostředkovávají jiné faktory. Hladiny 20E po krmení krví však nebyly dostatečné k vyvolání diskomfortu při páření, ale byly účinně spuštěny vysokými titry pohlavně přenesené 3D20E.
Naše výsledky poskytují důležité poznatky o mechanismech regulujících reprodukční úspěch A. gambiae. Objevil se model, kde se samci vyvinuli k syntéze vysokých titrů 3D20E, samčího specifického modifikovaného ekdyzonu, který zajišťuje rodičovství desenzibilizací samic k dalšímu páření. Zároveň si tito přenašeči malárie vyvinuli účinný systém pro aktivaci 3D20E u samic v reakci na sexuální přenos samčího specifického EPP. Podle našich znalostí se jedná o první příklad steroidního hormonálního systému ovládaného samci a samicí, který plní jedinečnou a klíčovou funkci u hmyzu. Samčí specifická funkce ekdyzonu byla postulována, ale nebyla definitivně prokázána. Například do značné míry vyvrácená hypotéza18 je, že tyto funkce může vykonávat prekurzor 20E E1. Je dobře známo, že u drozofily je monandrie spouštěna sexuálním přenosem malých pohlavních peptidů19,20, které interagují s neurony inervujícími samičí reprodukční trakt prostřednictvím specifických receptorů pohlavních peptidů21,22. Je zapotřebí další práce k určení následných signálních kaskád. kontrolovány 3D20E u samic A. gambiae a zjistit, zda tyto kaskády mohou být konzervovány mezi komáry a drozofilami.
Vzhledem k důležité roli 3D20E v plodnosti a chování samic identifikované v naší studii, dráhy vedoucí k syntéze a aktivaci 3D20E nabízejí nové příležitosti pro budoucí strategie kontroly komárů, jako je generování kompetitivních sterilních samců ve strategiích sterilní technologie hmyzu, které se používají k vypouštění do volné přírody nebo k napodobování 3D20E v panenských hrách. Samčí specifická funkce 3D20E se mohla vyvinout, když A. gambiae a další druhy Cellia získaly schopnost koagulovat svá sperma do pářicích zátek, protože to umožňuje efektivní přenos velkého množství hormonů a enzymů aktivujících hormony. Evoluce 3D20E implementující monandrii zase poskytuje mechanismus pro samice (prostřednictvím vysoké exprese MISO) k podpoře jejich reprodukční zdatnosti v oblastech s vysokým výskytem malárie, což nepřímo přispívá k přenosu Plasmodium. Vzhledem k tomu, že bylo prokázáno, že samičí 20E má zásadní vliv na přežití a růst P. falciparum u samic komárů rodu Anopheles,24 jsou nyní dráhy steroidních hormonů samců i samic klíčovými aspekty interakcí mezi komáry a parazity.
Kmeny A. gambiae G3 byly chovány za standardních hmyzích podmínek (26–28 °C, relativní vlhkost 65–80 %, fotoperioda světlo/tma 12:12 hodin). Larvy byly krmeny práškovým krmivem pro ryby (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets a Tetra Pond Sticks v poměru 7:7:2). Dospělí komáři byli krmeni ad libitum 10% roztokem dextrózy a týdně lidskou krví (studijní krevní složky). Panenské komáry byly získány oddělením pohlaví ve stádiu kukly po mikroskopickém vyšetření konců. Samci nesoucí transgen DsRed byli popsáni dříve.
Experimenty s nuceným pářením byly provedeny podle dříve popsaných protokolů. Pro přirozené páření byly 4denní panenské samice chovány v poměru 1:3 s pohlavně zralými panenskými samci po dobu dvou nocí. V experimentech, ve kterých byl samcům injekčně podán dsEPP, se společné umístění v kleci shodovalo s 3. a 4. dnem po injekci, kdy byla aktivita fosfatázy maximálně utlumena (Rozšířená data, obr. 2b).
Tkáně komárů, zbývající kadavery (zbytek těla) nebo celé tělo byly preparovány do 100% methanolu a homogenizovány pomocí perličky (2 mm skleněné kuličky, 2 400 ot/min, 90 s). Množství tkání a objemy methanolu byly následující: zbytek těla, 50 v 1 000 µl; MAG, 50–100 80 µl; samičí LRT, 25–50 80 µl. Sraženina byla podrobena druhé methanolové extrakci se stejným objemem methanolu. Buněčný odpad byl odstraněn centrifugací. Methanol z obou extrakcí byl sloučen a sušen pod proudem dusíku, poté resuspendován v následujících objemech 80% methanolu ve vodě: zbytek těla, 50 µl; MAG a samičí LRT, 30 µl.
Vzorky byly analyzovány na hmotnostním spektrometru (ID-X, Thermo Fisher) spojeném s LC přístrojem (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl vzorku bylo injektováno na kolonu o rozměrech 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) udržovanou na 25 °C. Mobilní fáze pro LC byly A (voda, 0,1% kyselina mravenčí) a B (acetonitril, 0,1% kyselina mravenčí). LC gradient byl následující: 5% B po dobu 1 minuty, poté zvýšen na 100% B během 11 minut. Po 8 minutách při 100% byla kolona znovu ekvilibrována při 5% B po dobu 4 minut. Průtoková rychlost byla 0,3 ml min-1. Ionizace v MS zdroji se provádí zahřívanou elektrosprejovou ionizací v pozitivním a negativním režimu.
Hmotnostní spektrometr měří data v rozsahu m/z od 350 do 680 s rozlišením 60 000 v plném MS režimu. Data MS/MS byla získána pro [M + H]+ (všechny cíle), [M - H2O + H]+ (všechny cíle) a [M - H]- (fosforylované cíle). Data MS/MS byla použita k potvrzení ekdysonových vlastností cílů, pro které nebyl k dispozici žádný standard. Pro identifikaci necílových ekdysteroidů byla analyzována data MS/MS pro všechny píky HPLC s relativní abundancí >15 %. Kvantifikace se provede pomocí standardních křivek vytvořených z čistých standardů (20E, 3D20E) pro výpočet absolutních množství nebo ředění jednoho specifického vzorku (všechny ostatní cíle) pro výpočet jejich ekvivalence s množstvími zjištěnými u jednoho samce. Pro 3D20E byla kvantifikace provedena pomocí součtu následujících aduktů: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Data byla extrahována a kvantifikována pomocí programu Tracefinder (verze 4.1).MS/MS data byla analyzována pomocí programu Xcalibur (verze 4.4).MS spektra E, 20E a 3D20E byla porovnána s příslušnými standardy. 3D20E22P byl analyzován derivatizací s Girardovým činidlem. 20E22P byl analyzován poměrem m/z.
3D20E22P byl purifikován z MAG. Purifikace byla provedena v analytickém měřítku za použití ultravýkonného kapalinového chromatografu (Acquity, Waters) s kvadrupólovým hmotnostním detektorem (QDa, Acquity, Waters) za stejných podmínek LC jako u analýzy HPLC-MS/MS. Sběr frakcí byl spuštěn, když byla detekována hodnota m/z odpovídající 3D20E22P ve stejném retenčním čase, jak bylo stanoveno dříve. Čistota extrahovaných sloučenin byla poté zkontrolována pomocí HPLC-MS/MS, jak je popsáno výše.
Celková RNA byla extrahována z 10–12 reprodukčních tkání nebo jiných částí těla (bez hlav) za použití činidla TRI (Thermo Fisher) podle pokynů výrobce. RNA byla ošetřena TURBO DNázou (Thermo Fisher). cDNA byla syntetizována za použití reverzní transkriptázy viru myší leukémie Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) podle pokynů výrobce. Primery pro kvantitativní PCR s reverzní transkripcí (RT-qPCR; Extended Data Table 2) byly dříve publikovány24 nebo navrženy za použití Primer-BLAST26, přičemž přednost se dávala produktům o velikosti 70–150 bp a přesahujícím exon-exon spojení nebo pár primerů oddělujících exony. Vzorky cDNA ze tří až čtyř biologických replikátů byly pro RT-qPCR čtyřnásobně zředěny vodou. Kvantifikace byla provedena v 15 µl replikačních reakcích obsahujících 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primery a 5 µl zředěné cDNA. Reakce byly provedeny na systému QuantStudio 6 Pro real-time PCR (Thermo Fisher) a data byla shromážděna a analyzována pomocí programu Design and Analysis (verze 2.4.3). Jak bylo prokázáno v této studii, relativní množství byla normalizována na ribozomální gen RpL19 (AGAP004422), jehož exprese se významně neměnila s příjmem krve 27 ani s pářením 3.
Kvalita RNA byla kontrolována pomocí Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Knihovny párových konců Illumina byly připraveny a zpracovány v Broad Institute of MIT a Harvard. Sekvenční čtení bylo zarovnáno s genomem A. gambiae (kmen PEST, verze 4.12) pomocí HISAT2 (verze 2.0.5) s výchozími parametry. Čtení se skóre mapovací kvality (MAPQ) <30 bylo odstraněno pomocí Samtools (verze 1.3.1). Počet čtení mapovaných na geny byl spočítán pomocí htseq-count (verze 0.9.1) s výchozími parametry. Byly vypočítány normalizované počty čtení a diferenciální genová exprese analyzována pomocí balíčku DESeq2 (verze 1.28.1) v R (verze 4.0.3).
Kandidáti genů modifikujících ekdyson byli identifikováni nejprve prohledáním genomu A. gambiae pomocí algoritmu PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) s použitím výchozích hodnot parametrů s následujícími sekvencemi dotazovaných proteinů: z Bombyx mori (přístupové číslo NP_001038956.1), Musca domestica (přístupové číslo XP_005182020.1, XP_005175332.1 a XP_011294434.1) a Microplitis demolitor (přístupové číslo XP_008552646.1 a XP_008552645.1) EcK z B. mori (přístupové číslo NP_001036900), Drosophila melanogaster (přístupové číslo NP_651202), Apis mellifera (přístupové číslo XP_394838) a Acyrthosiphon pisum (přístupové číslo XP_001947166); a EPP z B. mori (přístupové číslo XP_001947166) NP_001177919.1 a NP_001243996.1) a EO z D. melanogaster (přístupové číslo NP_572986.1) (krok 1). Dále se filtrují zásahy na základě vysoké exprese mRNA (>100 fragmentů/kilobázových exonů na milion mapovaných čtení (FPKM) nebo >85 %) v reprodukční tkáni (samice LRT nebo MAG) v Gambii (krok 2). Pro zlepšení specificity jsme vybrali kandidátní enzymy, které jsou také exprimovány v reprodukční tkáni A. albimanus, druhu Anopheles, který během páření nesyntetizuje ani nepřenáší ekdyson. Kandidátní geny byly filtrovány na základě nízké exprese (<100 FPKM nebo <85. percentil) v reprodukční tkáni A. albimanus (krok 3). Jako finální filtr (krok 4) musely kandidátní geny splňovat alespoň jednu z následujících podmínek: (1) významně zvýšená exprese po páření (P < 0,05) podle analýzy diferencovaně exprimovaných genů a (2) v nereprodukčních tkáních (< 85 % nebo <100 FPKM).
Dříve popsané metody 28, 29, 30 jsme upravili tak, abychom dosáhli izotopového značení celého organismu. Stručně řečeno, divoký typ Saccharomyces cerevisiae typu II (YSC2, Sigma) byl testován v kvasinkovém dusíkatém médiu (BD Difco, DF0335) obsahujícím (hm./obj.) 2 % glukózy (G7528, Sigma), 1,7 % kultivačního média bez aminokyselin a síranu amonného a 5 % 15N síranu amonného (NLM-713, >99 %, Cambridge Isotope Laboratories) jako jediný zdroj dusíku. Kvasinky byly izolovány centrifugací a larvy komárů byly krmeny ad libitum až do zakuklení. Doplněna byla rybí moučka (0,5 mg na 300 larev), aby se zabránilo úmrtnosti ve čtvrtém instaru. V pářovacích experimentech s neznačenými samci byly poté použity pouze samice k analýze samčího proteomu přeneseného během páření.
4-6 dní staré panenské samice s označením 15N byly nuceny pářit se s netagovanými panenskými samci stejného věku. Úspěšné páření bylo ověřeno detekcí pářící zátky pod epifluorescenční mikroskopií. Po 3, 12 a 24 hodinách za minutu byly síně 45-55 spářených samic rozebrány do 50 µl pufru s hydrogenuhličitanem amonným (pH 7,8) a homogenizovány tloučkem. Homogenát byl centrifugován a supernatant smíchán s 50 µl 0,1% RapiGestu (186001860, Waters) v 50 mM hydrogenuhličitanu amonného. Supernatant a peleta z každého vzorku byly rychle zmrazeny na suchém ledu a přes noc odeslány do laboratoře MacCoss na Washingtonské univerzitě, kde byla dokončena příprava vzorku pro LC-MS/MS. Peletu resuspendujte v 50 µl 0,1% RapiGestu v 50 mM hydrogenuhličitanu amonného a sonikujte ve vodní lázni. Koncentrace proteinu v peletě a supernatantu byla měřena pomocí BCA. Vzorky byly redukovány 5 mM dithiothreitolem (DTT; Sigma), alkylovány 15 mM jodoacetamidem (Sigma) a inkubovány při 37 °C (1:0,50) po dobu 1 hodiny s poměrem trypsinizace:trypsin:substrát). RapiGest byl lyzován přidáním 200 mM HCl, následovala inkubace při 37 °C po dobu 45 minut a centrifugace při 14 000 ot/min po dobu 10 minut při 4 °C za účelem odstranění nečistot. Vzorky byly promyty duální extrakcí na pevné fázi (kartráže Oasis MCX, Waters) a resuspendovány v 0,1% kyselině mravenčí pro konečnou koncentraci proteinu 0,33 µg µl-1. Neznačené MAG proteomy byly podobně analyzovány u panenských samců. Pro každý vzorek byly analyzovány dva analytické replikáty. Následně byl 1 µg každého vzorku analyzován za použití 25 cm oxidu křemičitého 75 μm kolony s 4 cm... lapač frit z taveného oxidu křemičitého Kasil1 (PQ) plněný reverzně fázovou pryskyřicí Jupiter C12 (Phenomenex) a 180minutová kapalinová chromatografie. Trávení vzorků – MS/MS byla provedena na hmotnostním spektrometru Q-Exactive HF (Thermo Fisher) se systémem nanoACQUITY UPLC (Waters). Data související s akvizicemi generovaná pro každý běh byla převedena do formátu mzML pomocí programu Proteowizard (verze 3.0.20287) a pomocí programu Comet31 (verze 3.2) proti databázi FASTA obsahující proteinové sekvence z Anopheles gambiae (VectorBase verze 54), Anopheles coluzzi. Bylo provedeno vyhledávání na Mali-NIH (VectorBase verze 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, březen 2021), RNA-seq A. gambiae a třírámcových translacích známých lidských kontaminantů. FDR odpovídající peptidové mapě byly stanoveny pomocí programu Percolator32 (verze 3.05) s prahovou hodnotou 0,01 a peptidy byly sestaveny do proteinových identifikátorů pomocí protein parsimony v programu Limelight33 (verze 2.2.0). Relativní množství proteinů bylo odhadnuto pomocí normalizovaného faktoru spektrální abundance (NSAF) vypočítaného pro každý protein v každém běhu, jak bylo popsáno dříve. NSAF vzhledem ke každému proteinu bylo zprůměrováno napříč vzorky ze dvou různých biologických replikátů. Značení 15N úspěšně maskovalo samičí proteom, ačkoli malé množství neznačeného proteinu bylo možné detekovat u značených panenských vzorků. Detekci redukce samčích proteinů (1-5 spektra) jsme zaznamenali u samičích surových vzorků pouze v technických běhech, kde byly surové vzorky analyzovány po samčích/pářících se vzorcích, v důsledku „přenosu“ HPLC. Občasné proteiny nalezené jako „kontaminanty“ u značených panenských vzorků jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1.
Dva antigenní peptidy, QTTDRVAPAPDQQQ (v rámci izotypu PA) a MESDGTTPSGDSEQ (v rámci izotypu PA a PB) v Genscriptu. Tyto dva peptidy byly sloučeny, poté konjugovány s nosným proteinem KLH a injekčně podány novozélandským králíkům. Králíci byli po čtvrté injekci usmrceni a celkový IgG byl izolován afinitní purifikací. IgG z králíka s nejvyšší specificitou pro EPP byl použit pro další Western blotting.
Pro Western bloty byl odděleně přidán MAG (n = 10, kde n představuje počet biologicky nezávislých vzorků komárů) a samice LRT (n = 30) od 4denních panenských samců a panenských nebo násilně spářených samic (<10 po páření). Extrakční pufr pro proteiny (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% deoxycholát sodný; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× koktejl inhibitorů proteáz (Roche)). Vzorky byly ihned po disekci homogenizovány pomocí perlové rotační sondy (2 mm skleněné kuličky, 2 400 ot/min, 90 s). Nerozpustné zbytky byly odstraněny centrifugací při 20 000 g při 4 °C. Proteiny byly kvantifikovány Bradfordovou metodou (Bio-Rad). Poté bylo denaturováno 20 µg proteinu MAG, 40 µg proteinu LRT a 20 µg zbytkového proteinu a separováno 10% filtrací. Bis-Tris NuPAGE s použitím MOPS pufru. Proteiny byly přeneseny na polyvinylidenfluoridové membrány pomocí přenosového systému iBlot2 (Thermo Fisher). Membrány byly dvakrát promyty v 1× PBS-T (0,1% Tween-20 v PBS) a poté blokovány v blokovacím pufru Odyssey (Li-Cor) po dobu 1 hodiny při 22 °C. Membrány byly třepány přes noc při 4 °C s králičí polyklonální primární protilátkou anti-EPP (1:700 v blokovacím pufru) a potkaní monoklonální primární protilátkou anti-aktin MAC237 (Abeam; 1:4 000). Membrány byly promyty PBS-T a poté inkubovány se sekundárními protilátkami (oslí anti-králičí 800CW a kozí anti-krysí 680LT (Li-Cor), obě 1:20 000) v blokovacím pufru obsahujícím 0,01% SDS a 0,2% Tween-20 po dobu 1 hodiny při 22 °C. Membrány byly promyty PBS-T. a zobrazeny skenerem Odyssey CLx. Snímky byly shromážděny a zpracovány v programu Image Studio (verze 5.2). Specifický pás odpovídající izoformě EPP-RA (82 kDa) nebyl detekován.
Kódující oblasti EPP (jako izoforma AGAP002463-RB obsahující histidinfosfatázovou doménu, NCBI conserved domain search 34) a EcK2 (AGAP002181) byly klonovány do plazmidu pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); primery jsou uvedeny v tabulce 2 s rozšířenými daty. Osm linkerů GS4 (v tandemu) bylo vloženo před C-terminální značku 6xHis konstruktu pET-21a(+)-EcK2. Rekombinantní proteiny byly připraveny za použití bezbuněčné reakce syntézy proteinů E. coli NEBExpress (New England BioLabs). Rekombinantní proteiny byly purifikovány za použití spinových kolon NEBExpress Ni (New England BioLabs). Kontrolní protein dihydrofolátreduktázy (DHFR) byl připraven za použití DNA templátu ze sady NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. Proteiny byly skladovány v 50% glycerolu v PBS při -20 °C po dobu až 3 měsíců.
Fosfatázová aktivita EPP a tkáňových extraktů byla měřena za použití 4-nitrofenylfosfátu (pNPP; Sigma-Aldrich). Reakční pufr obsahoval 25 mM Tris, 50 mM kyselinu octovou, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA a 1 mM DTT. Tkáň byla homogenizována v reakčním pufru a buněčné zbytky byly odstraněny centrifugací. Reakci zahájit přidáním enzymu nebo tkáňového extraktu do reakčního pufru obsahujícího 2,5 mg ml-1 pNPP. Reakční směs byla inkubována při pokojové teplotě ve tmě a množství pNP přeměněného z pNPP bylo kvantifikováno měřením absorbance při 405 nm v různých časech.
Pro stanovení aktivity EcK in vitro byl protein inkubován s 0,2 mg 20E nebo 3D20E ve 200 µl pufru (pH 7,5) obsahujícího 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP a 10 mM MgCl2 po dobu 2 hodin při 27 °C. Reakce byla zastavena přidáním 800 µl methanolu, poté ochlazena na -20 °C po dobu 1 hodiny a následně centrifugována při 20 000 g po dobu 10 minut při 4 °C. Supernatant byl poté analyzován pomocí HPLC-MS/MS. Pro tepelnou inaktivaci proteinů použitých v kontrolní skupině byly proteiny inkubovány v 50% glycerolu v PBS po dobu 20 minut při 95 °C.
Pro stanovení aktivity EPP in vitro byl protein inkubován s 3D20E22P (ekvivalentní množství nalezenému v 18 párech MAG, purifikovaných pomocí HPLC-MS/MS) ve 100 µl pufru (pH 7,5) obsahujícím 25 mM Tris, 50 mM kyselinu octovou, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA a 1 mM DTT po dobu 3 hodin při 27 °C. Reakce byla zastavena přidáním 400 µl methanolu a ochlazena na -20 °C po dobu 1 hodiny, poté centrifugována při 20 000 g po dobu 10 minut při 4 °C. Supernatant byl analyzován pomocí HPLC-MS/MS.
PCR fragmenty pro EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) a EcK2 (556 bp) byly amplifikovány z cDNA připravené z mrtvých těl bezhlavých komárů smíšeného pohlaví. PCR fragment kontroly eGFP (495 bp) byl amplifikován z dříve popsaného pCR2.1-eGFP; PCR primery jsou uvedeny v rozšířené tabulce 2. PCR fragment byl vložen mezi invertované T7 promotory na plazmidu pL4440. Plazmidové konstrukty byly získány z kompetentní E. coli NEB 5-α (New England Biolabs) a před použitím ověřeny sekvenováním DNA (viz doplňková data 1 pro sekvenci inzertu). Primery odpovídající T7 promotoru (rozšířená tabulka 2) byly použity k amplifikaci inzertu z plazmidu založeného na pL4440. Velikost PCR produktu byla potvrzena elektroforézou na agarózovém gelu. dsRNA byla transkribována z PCR templátů pomocí transkripční sady Megascript T7 (Thermo Fisher) a purifikována podle pokynů výrobce s dříve popsanými úpravami.
Pro injekci dsRNA bylo do 1 dne po eklózi injikováno 1 380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) v koncentraci 10 ng nl-1 do hrudníku dospělých samců nebo samic (Nanoject III, Drummond). Hladiny genového knockdownu byly stanoveny v alespoň třech biologických replikátech extrakcí RNA, syntézou cDNA a RT-qPCR. Pro injekci ekdysonu bylo 4denním nebo 6denním panenským samicím krmeným krví injikováno 0,13, 0,21 nebo 0,63 µg 20E nebo 3D20E (Nanoject III, Drummond) v koncentracích 1,3, 2,1 v závislosti na experimentálním designu nebo 6,3 ng nl-1. Injikováno 100 nl 10% (obj./obj.) ethanolu ve vodě; 100 nl 3D20E22P v 10% ethanolu (ekvivalent 75 % množství nalezeného v páru MAG). Komáři byli náhodně zařazeni do injekční skupiny.
Pro testy tření byly 3denní samice krmeny ad libitum lidskou krví. Částečně krmení nebo nenakrmení komáři byli odstraněni. V závislosti na ošetření byly samice umístěny do oddělených třecích kelímků na čtyři noci nejméně 48 hodin po nakrmení krví. Vajíčka byla počítána pod stereoskopem (Stemi 508, Zeiss); u spářených samic byla vajíčka, z nichž se vylíhly larvy, považována za oploděná.
Pro pářicí testy byly samice ponechány alespoň 2 dny v závislosti na ošetření, aby se u nich vyvinula rezistence vůči páření, a následně byli do stejné klece vloženi samci divokého typu odpovídajícího věku. O dvě noci později byly oplodněné vezikuly samic vypreparovány a genomová DNA byla uvolněna zmrazením, rozmrazením a sonikací v pufru obsahujícím 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA a 25 mM NaCl (pH 8,2). Vzorky byly inkubovány s proteinázou K (0,86 µg µl-1) po dobu 15 minut při 55 °C a následně 10 minut při 95 °C. Preparáty surové genomové DNA byly 10krát zředěny a podrobeny detekci sekvencí chromozomu Y pomocí qPCR; primery jsou uvedeny v tabulce 2 s rozšířenými daty. Absence sekvence chromozomu Y naznačuje, že nedošlo k páření.
Pro testy opakovaného páření byly nuceně spářené samice vyšetřeny na přítomnost pářovacích zátek, aby se potvrdil stav páření, a nechaly se 2 dny k rozvoji odolnosti vůči páření v nepřítomnosti samců, jak bylo popsáno dříve36. Samci nesoucí transgenní spermie DsRed byli poté vloženi do klecí samic. O dvě noci později byly ze samic vypreparovány fertilizační váčky a genomová DNA byla připravena, jak je popsáno výše, a podrobena detekci transgenu DsRed pomocí qPCR; primery jsou uvedeny v tabulce 2 s rozšířenými daty. Absence transgenu DsRed naznačovala, že k žádnému opakovanému páření nedošlo.
3D20E byl syntetizován dle dříve popsaného postupu37. Stručně řečeno, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) bylo rozpuštěno v 10 ml vody a následně bylo přidáno 30 mg platinové černi (v práškové formě, Sigma-Aldrich). Do reakční směsi byl kontinuálně probubláván mírný proud O2, který byl míchán při pokojové teplotě. Po 6 hodinách bylo přidáno 30 ml methanolu k zastavení reakce. Směs byla centrifugována za účelem odstranění částic katalyzátoru. Supernatant byl odpařen do sucha ve vakuu při pokojové teplotě. Vysušený reakční produkt byl rozpuštěn v 10% ethanolu a methanolu pro injekce pro HPLC-MS/MS analýzu. Míra konverze (z 20E na 3D20E) byla přibližně 97 % (obr. 4b) a MS spektrum syntetizovaného 3D20E odpovídalo spektru zjištěnému u spářených samic (obr. 4c).
Legenda obsahuje specifické podrobnosti o provedených statistických testech. GraphPad (verze 9.0) byl použit k provedení Fisherova exaktního testu, Mantel-Coxova testu a Studentova t-testu. Cochran-Mantel-Haenszelovy testy byly provedeny pomocí vlastního R skriptu (dostupného na https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Normalita distribuce dat byla testována pomocí Shapiro-Wilkova testu s prahem významnosti 0,05. Pokud data neprošla testem normality, byl proveden Mann-Whitneyův test. Data o přežití byla analyzována pomocí Mantel-Coxova testu. Pro provedení analýzy diferenciální exprese na úrovni genů RNA-seq byl použit balíček DESeq2 (verze 1.28.1). Vodorovný sloupec na grafu představuje medián. Jako prahová hodnota pro všechny testy byla použita hodnota významnosti P = 0,05.
Více informací o designu studie naleznete v abstraktu Nature Research Report, na který odkazuje tento článek.
Data MS proteomiky byla uložena do konsorcia ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) prostřednictvím partnerského repozitáře PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) s identifikátorem datové sady PXD032157.
Datový soubor RNA-seq je uložen v knihovně Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) pod sériovým číslem GSE198665.
Další datové soubory generované a/nebo analyzované během aktuální studie lze na základě odůvodněné žádosti získat od příslušných autorů. Tento článek poskytuje zdrojová data.
De Loof, A. Ekdysteroidy: Zanedbávané pohlavní steroidy hmyzu? Muž: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyekdyson a vývoj vaječníků u Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).