Bylo prokázáno, že kyselina propionová (PPA), antimykotikum a běžně používaná přísada do stravy, způsobuje u myší abnormální neurovývoj doprovázený gastrointestinální dysfunkcí, která může být způsobena střevní dysbiózou. Souvislost mezi expozicí PPA v potravě a dysbiózou střevní mikrobioty byla navržena, ale dosud nebyla přímo zkoumána. V této studii jsme zkoumali změny ve složení střevní mikrobioty spojené s PPA, které mohou vést k dysbióze. Střevní mikrobiomy myší krmených neošetřenou stravou (n=9) a stravou obohacenou o PPA (n=13) byly sekvenovány pomocí metagenomického sekvenování s dlouhým dosahem za účelem posouzení rozdílů v mikrobiálním složení a bakteriálních metabolických drahách. PPA v potravě byla spojena se zvýšením počtu významných taxonů, včetně několika druhů Bacteroides, Prevotella a Ruminococcus, jejichž členové byli dříve zapojeni do produkce PPA. Mikrobiomy myší vystavených PPA měly také více drah souvisejících s metabolismem lipidů a biosyntézou steroidních hormonů. Naše výsledky naznačují, že PPA může změnit střevní mikrobiotu a s ní spojené metabolické dráhy. Tyto pozorované změny zdůrazňují, že konzervační látky klasifikované jako bezpečné pro konzumaci mohou ovlivnit složení střevní mikrobioty a tím i lidské zdraví.
Lidský mikrobiom je často označován jako „poslední orgán těla“ a hraje zásadní roli v lidském zdraví (Baquero a Nombela, 2012). Zejména střevní mikrobiom je uznáván pro svůj celosystémový vliv a roli v mnoha základních funkcích. Komenzální bakterie jsou ve střevě hojné, zabírají několik ekologických niek, využívají živiny a konkurují potenciálním patogenům (Jandhyala a kol., 2015). Různorodé bakteriální složky střevní mikrobioty jsou schopny produkovat esenciální živiny, jako jsou vitamíny, a podporovat trávení (Rowland a kol., 2018). Bylo také prokázáno, že bakteriální metabolity ovlivňují vývoj tkání a posilují metabolické a imunitní dráhy (Heijtz a kol., 2011; Yu a kol., 2022). Složení lidského střevního mikrobiomu je extrémně rozmanité a závisí na genetických a environmentálních faktorech, jako je strava, pohlaví, léky a zdravotní stav (Kumbhare a kol., 2019).
Mateřská strava je kritickou složkou vývoje plodu a novorozence a pravděpodobným zdrojem sloučenin, které mohou ovlivňovat vývoj (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Jednou z takových zajímavých sloučenin je kyselina propionová (PPA), vedlejší produkt mastné kyseliny s krátkým řetězcem získaný bakteriální fermentací a potravinářská přídatná látka (den Besten et al., 2013). PPA má antibakteriální a antifungální vlastnosti, a proto se používá jako konzervant v potravinách a v průmyslových aplikacích k inhibici růstu plísní a bakterií (Wemmenhove et al., 2016). PPA má různé účinky v různých tkáních. V játrech má PPA protizánětlivé účinky ovlivňováním exprese cytokinů v makrofágech (Kawasoe et al., 2022). Tento regulační účinek byl pozorován i v jiných imunitních buňkách, což vede k downregulaci zánětu (Haase et al., 2021). Opačný účinek však byl pozorován v mozku. Předchozí studie ukázaly, že expozice PPA indukuje u myší chování podobné autismu (El-Ansary et al., 2012). Jiné studie ukázaly, že PPA může indukovat gliózu a aktivovat prozánětlivé dráhy v mozku (Abdelli et al., 2019). Protože PPA je slabá kyselina, může difundovat přes střevní epitel do krevního oběhu a tím procházet restriktivními bariérami včetně hematoencefalické bariéry a placenty (Stinson et al., 2019), což zdůrazňuje význam PPA jako regulačního metabolitu produkovaného bakteriemi. Ačkoli je potenciální role PPA jako rizikového faktoru autismu v současné době předmětem výzkumu, její účinky na jedince s autismem mohou přesahovat rámec indukce nervové diferenciace.
Gastrointestinální příznaky, jako je průjem a zácpa, jsou u pacientů s neurovývojovými poruchami běžné (Cao et al., 2021). Předchozí studie ukázaly, že mikrobiom pacientů s poruchami autistického spektra (PAS) se liší od mikrobiomu zdravých jedinců, což naznačuje přítomnost dysbiózy střevní mikrobioty (Finegold et al., 2010). Podobně se charakteristiky mikrobiomu pacientů se zánětlivými onemocněními střev, obezitou, Alzheimerovou chorobou atd. liší od charakteristik zdravých jedinců (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Dosud však nebyla prokázána žádná kauzální souvislost mezi střevním mikrobiomem a neurologickými onemocněními nebo příznaky (Yap et al., 2021), ačkoli se předpokládá, že v některých z těchto chorobných stavů hraje roli několik bakteriálních druhů. Například Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio a další rody jsou hojnější v mikrobiotě pacientů s autismem (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Je pozoruhodné, že druhy některých z těchto rodů jsou známé tím, že disponují geny spojenými s produkcí PPA (Reichardt et al., 2014; Yun a Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur a Dürre, 2023). Vzhledem k antimikrobiálním vlastnostem PPA může být zvýšení jejího množství prospěšné pro růst bakterií produkujících PPA (Jacobson et al., 2018). Prostředí bohaté na PFA tak může vést ke změnám ve střevní mikrobiotě, včetně gastrointestinálních patogenů, což mohou být potenciální faktory vedoucí ke gastrointestinálním příznakům.
Ústřední otázkou ve výzkumu mikrobiomu je, zda jsou rozdíly v mikrobiálním složení příčinou nebo příznakem základních onemocnění. Prvním krokem k objasnění komplexního vztahu mezi stravou, střevním mikrobiomem a neurologickými onemocněními je posouzení vlivu stravy na mikrobiální složení. Za tímto účelem jsme použili metagenomické sekvenování s dlouhým čtením k porovnání střevních mikrobiomů potomků myší krmených stravou bohatou na PPA nebo s chudou na PPA. Potomci byli krmeni stejnou stravou jako jejich matky. Předpokládali jsme, že strava bohatá na PPA povede ke změnám ve složení střevní mikrobiom a mikrobiálních funkčních drahách, zejména těch, které souvisejí s metabolismem PPA a/nebo produkcí PPA.
Tato studie použila transgenní myši FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories), které nadměrně exprimují zelený fluorescenční protein (GFP) pod kontrolou gliově specifického promotoru GFAP v souladu s pokyny Výboru pro péči o zvířata a jejich používání Univerzity centrální Floridy (UCF-IACUC) (číslo povolení k použití zvířat: PROTO202000002). Po odstavu byly myši chovány jednotlivě v klecích po 1–5 myších každého pohlaví na klec. Myši byly krmeny ad libitum buď purifikovanou kontrolní dietou (modifikovaná otevřená standardní dieta, 16 kcal% tuku), nebo dietou s přídavkem propionátu sodného (modifikovaná otevřená standardní dieta, 16 kcal% tuku, obsahující 5 000 ppm propionátu sodného). Použité množství propionátu sodného odpovídalo 5 000 mg PFA/kg celkové hmotnosti potravy. Jedná se o nejvyšší koncentraci PPA schválenou pro použití jako konzervant potravin. Pro přípravu na tuto studii byly rodičovské myši krmeny oběma druhy stravy po dobu 4 týdnů před pářením a pokračovaly v krmení po celou dobu březosti matky. Potomci myší [22 myší, 9 kontrolních (6 samců, 3 samice) a 13 myší s cholesterolem (4 samci, 9 samic)] byli odstaveni a poté pokračovali ve stejné stravě jako matky po dobu 5 měsíců. Potomci myší byli usmrceni ve věku 5 měsíců a jejich střevní výkal byl odebrán a zpočátku uložen do 1,5ml mikrozkumavek při teplotě -20 °C a poté přenesen do mrazničky při teplotě -80 °C, dokud nebyla vyčerpána hostitelská DNA a extrahovány mikrobiální nukleové kyseliny.
Hostitelská DNA byla odstraněna podle modifikovaného protokolu (Charalampous et al., 2019). Stručně řečeno, obsah stolice byl přenesen do 500 µl InhibitEX (Qiagen, kat. č./ID: 19593) a uložen zmrazený. Na extrakci zpracujte maximálně 1–2 pelety stolice. Obsah stolice byl poté mechanicky homogenizován pomocí plastové tloučku uvnitř zkumavky za vzniku suspenze. Vzorky centrifugujte při 10 000 RCF po dobu 5 minut nebo dokud se vzorky nepeletují, poté odsajte supernatant a peletu resuspendujte ve 250 µl 1× PBS. Do vzorku přidejte 250 µl 4,4% roztoku saponinu (TCI, číslo produktu S0019) jako detergent pro uvolnění eukaryotických buněčných membrán. Vzorky byly jemně promíchány do hladka a inkubovány při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Dále bylo pro rozrušení eukaryotických buněk do vzorku přidáno 350 μl vody bez nukleáz, inkubováno po dobu 30 s a poté bylo přidáno 12 μl 5 M NaCl. Vzorky byly poté centrifugovány při 6000 RCF po dobu 5 minut. Supernatant byl odsát a pelet byl resuspendován ve 100 μl 1X PBS. Pro odstranění hostitelské DNA bylo přidáno 100 μl pufru HL-SAN (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml vody bez nukleáz) a 10 μl enzymu HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Vzorky byly důkladně promíchány pipetováním a inkubovány při 37 °C po dobu 30 minut při 800 ot/min na přístroji Eppendorf™ ThermoMixer C. Po inkubaci byly centrifugovány při 6000 RCF po dobu 3 minut a dvakrát promyty 800 µl a 1000 µl 1X PBS. Nakonec byl pelet resuspendován ve 100 µl 1X PBS.
Celková bakteriální DNA byla izolována pomocí soupravy New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, kat. č. T3010L). Standardní operační postup dodávaný se soupravou je mírně upraven. Před operací pro finální eluci inkubujte a udržujte vodu bez nukleáz při 60 °C. Do každého vzorku přidejte 10 µl proteinázy K a 3 µl RNázy A. Poté přidejte 100 µl pufru pro lýzu buněk a jemně promíchejte. Vzorky byly poté inkubovány v Eppendorf™ ThermoMixer C při 56 °C a 1400 ot/min po dobu nejméně 1 hodiny a maximálně 3 hodin. Inkubované vzorky byly centrifugovány při 12 000 RCF po dobu 3 minut a supernatant z každého vzorku byl přenesen do samostatné 1,5ml mikrozkumavky obsahující 400 µl vazebného roztoku. Zkumavky byly poté pulzně vortexovány po dobu 5–10 sekund v 1sekundových intervalech. Veškerý tekutý obsah každého vzorku (přibližně 600–700 µl) přeneste do filtrační patrony umístěné v průtokové sběrné zkumavce. Zkumavky byly centrifugovány při 1 000 RCF po dobu 3 minut, aby se umožnila počáteční vazba DNA, a poté centrifugovány při 12 000 RCF po dobu 1 minuty, aby se odstranila zbytková kapalina. Sloupec se vzorkem byl přenesen do nové sběrné zkumavky a poté dvakrát promyt. Pro první promytí přidejte do každé zkumavky 500 µl promývacího pufru. Zkumavku 3–5krát obraťte dnem vzhůru a poté centrifugujte při 12 000 RCF po dobu 1 minuty. Kapalinu ze sběrné zkumavky vylijte a filtrační patronu vložte zpět do stejné sběrné zkumavky. Pro druhé promytí přidejte do filtru 500 µl promývacího pufru bez převracení. Vzorky byly centrifugovány při 12 000 RCF po dobu 1 minuty. Filtr přeneste do 1,5ml zkumavky LoBind® a přidejte 100 µl předehřáté vody bez nukleáz. Filtry byly inkubovány při pokojové teplotě po dobu 1 minuty a poté centrifugovány při 12 000 RCF po dobu 1 minuty. Eluovaná DNA byla skladována při -80 °C.
Koncentrace DNA byla kvantifikována pomocí fluorometru Qubit™ 4.0. DNA byla připravena pomocí sady Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (kat. č. Q33231) dle pokynů výrobce. Distribuce délky fragmentů DNA byla měřena pomocí přístroje Aglient™ 4150 nebo 4200 TapeStation. DNA byla připravena pomocí reagencií Agilent™ Genomic DNA Reagents (kat. č. 5067-5366) a Genomic DNA ScreenTape (kat. č. 5067-5365). Příprava knihovny byla provedena pomocí sady Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) dle pokynů výrobce. DNA byla sekvenována pomocí sekvenátoru ONT GridION™ Mk1 s průtokovou celou Min106D (R 9.4.1). Nastavení sekvenování byla: vysoce přesné vyhledávání bází, minimální hodnota q 9, nastavení čárového kódu a ořezávání čárového kódu. Vzorky byly sekvenovány po dobu 72 hodin, poté byla data z testu bazálního volání odeslána k dalšímu zpracování a analýze.
Bioinformatické zpracování bylo provedeno dříve popsanými metodami (Greenman a kol., 2024). Soubory FASTQ získané sekvenováním byly rozděleny do adresářů pro každý vzorek. Před bioinformatickou analýzou byla data zpracována pomocí následujícího postupu: nejprve byly soubory FASTQ vzorků sloučeny do jednoho souboru FASTQ. Poté byly čtení kratší než 1000 bp filtrována pomocí Filtlong v. 0.2.1, přičemž jediný změněný parametr byl –min_length 1000 (Wick, 2024). Před další filtrací byla kvalita čtení kontrolována pomocí NanoPlot v. 1.41.3 s následujícími parametry: –fastq –plots dot –N50 -o(De Coster a Rademakers, 2023). Čtení genomů bylo provedeno zarovnání s referenčním myším genomem GRCm39 (GCF_000001635.27) pomocí minimap2 v. 2.24-r1122 k odstranění hostitelem kontaminovaných čtení s následujícími parametry: -L -ax map-ont(Lee, 2018). Vygenerované soubory pro zarovnání byly převedeny do formátu BAM pomocí samtools view -b (Danecek et al., 2021) v programu samtools v. 1.16.1. Nezarovnané čtení bylo poté identifikováno pomocí samtools view -b -f 4, což naznačuje, že tato čtení nepatří do hostitelského genomu. Nezarovnané čtení bylo převedeno zpět do formátu FASTQ pomocí samtools bam2fq s výchozími parametry. NanoPlot byl znovu spuštěn na dalších filtrovaných čteních s použitím dříve popsaného nastavení. Po filtrování byla metagenomická data sestavena pomocí metaflye v. 2.8.2-b1689 s následujícími parametry: –nano-raw–meta (Kolmogorov et al., 2020). Zbývající parametry ponechte na jejich výchozích hodnotách. Po sestavení byly filtrované čtení namapovány na sestavení pomocí minimap2 a parametr -ax map-ont byl použit k vygenerování souboru pro zarovnání ve formátu SAM. Sestavení bylo nejprve upřesněno pomocí racon v. 1.4.20 s následujícími parametry: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser et al., 2017). Po dokončení racon bylo dále upřesněno pomocí medaka v. 1.7.2 s použitím medaka_consesus, přičemž všechny parametry kromě parametru -m byly ponechány na jejich výchozích hodnotách. Parametr -m je nastaven na r941_min_hac_g507 pro specifikaci chemického složení průtokové kyvety a vysoce přesného volání bází použitého pro naše data (nanoporetech/medaka, 2024). Filtrovaná data (dále jen mikrobiální data) a finální vyčištěné sestavení byly použity pro následnou analýzu.
Pro taxonomickou klasifikaci byly přečtené a sestavené kontigy klasifikovány pomocí programu Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Pro přečtené a sestavené kontigy se generují zprávy a výstupní soubory. Pro analýzu přečtených a sestavených dat použijte volbu –use-names. Pro segmenty přečtených dat jsou zadány volby –gzip-compressed a –paired. Relativní početnost taxonů v metagenomech byla odhadnuta pomocí programu Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Nejprve jsme vytvořili databázi kmer obsahující 1000 bází pomocí bracken-build s následujícími parametry: -d-k 35 -l 1000 Po sestavení se bracken spustí na základě zprávy vygenerované programem kraken2 a filtruje data pomocí následujících voleb: -d -I -O-p 1000 -l

Mezi nimi se vybírá P, G nebo S v závislosti na analyzované úrovni klasifikace. Pro minimalizaci dopadu falešně pozitivních klasifikací byl přijat minimální práh relativní abundance 1e-4 (1/10 000 přečtení). Před statistickou analýzou byly relativní abundance hlášené Brackenem (fraction_total_reads) transformovány pomocí transformace centrovaného logaritmického poměru (CLR) (Aitchison, 1982). Metoda CLR byla zvolena pro transformaci dat, protože je invariantní vůči měřítku a dostatečná pro neřídké datové sady (Gloor et al., 2017). Transformace CLR používá přirozený logaritmus. Data o počtech hlášená Brackenem byla normalizována pomocí relativního logaritmického výrazu (RLE) (Anders a Huber, 2010). Obrázky byly generovány pomocí kombinace matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 a sekvenčních logaritmů (Gloor et al., 2017). 0.12.2 a stantanotace v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Poměr Bacillus/Bacteroidetes byl vypočítán pro každý vzorek s použitím normalizovaného počtu bakterií. Hodnoty uvedené v tabulkách jsou zaokrouhleny na 4 desetinná místa. Simpsonův index diverzity byl vypočítán pomocí skriptu alpha_diversity.py, který je součástí balíčku KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Ve skriptu je uvedena Brackenova zpráva a pro parametr -an je uveden Simpsonův index „Si“. Významné rozdíly v početnosti byly definovány jako průměrné rozdíly CLR ≥ 1 nebo ≤ -1. Průměrný rozdíl CLR ±1 označuje 2,7násobné zvýšení početnosti daného typu vzorku. Znaménko (+/-) označuje, zda je taxon hojnější ve vzorku PPA a v kontrolním vzorku. Významnost byla stanovena pomocí Mann-Whitneyho U testu (Virtanen a kol., 2020). Byl použit software Statsmodels v. 0.14 (Benjamini a Hochberg, 1995; Seabold a Perktold, 2010) a pro korekci vícenásobného testování byl aplikován Benjaminiho-Hochbergův postup. Jako prahová hodnota pro stanovení statistické významnosti byla použita upravená p-hodnota ≤ 0,05.
Anotace genů a odhad relativní abundance byly provedeny s použitím modifikované verze protokolu popsaného Marangou a kol. (Maranga a kol., 2023). Nejprve byly ze všech sestav odstraněny kontigy kratší než 500 bp pomocí SeqKit v. 2.5.1 (Shen a kol., 2016). Vybrané sestavy byly poté sloučeny do pan-metagenomu. Otevřené čtecí rámce (ORF) byly identifikovány pomocí Prodigal v. 1.0.1 (paralelní verze Prodigal v. 2.6.3) s následujícími parametry: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett a kol., 2012; Jaenicke, 2024). Výsledné nukleotidové soubory byly následně filtrovány pomocí Pythonu za účelem odstranění všech neúplných genů. Pro shlukování genů s následujícími parametry byl použit program CD-HIT v. 4.8.1: clustering genů -O-c 0,95 -s 0,85 -aS 0,9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012). Vygenerovaný neredundantní katalog genů byl použit k odhadu genové abundance a anotace. Relativní genová abundance byla odhadnuta pomocí KMA v. 1.4.9 (Clausen et al., 2018). Nejprve vytvořte indexový soubor pomocí KMA index s následujícími parametry: -i -OPoté byl s využitím indexu vygenerovaného spolu s mikrobiálními údaji pro každý vzorek, jak je popsáno v části Bioinformatický postup, spuštěn KMA s následujícími parametry: -i -O-t_db-bcNano -bc 0,7 -ef -t 24. Poté byly počty genů normalizovány pomocí CLR a byla použita analýza hlavních komponent (PCA) třídy Sci-kit learn (Pedregosa et al., 2011). Predikovaná anotace genů byla provedena na neredundantním genovém katalogu pomocí skriptu emapper.py z eggNOG v. 2.1.12 a databáze eggNOG verze 5.0.2 s následujícími parametry: –itype CDS –cpu 24 -i– Katalog dat–go_evidence Neelektronický – výstup– Výstupní adresář–target_orthologs všechny –seed_ortholog_evalue 0,001 –seed_ortholog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –temp_dir(Cantalapiedra et al., 2021). Výsledky KMA byly analyzovány za účelem výběru genů s dostatečným pokrytím templátu a identitou templátu (≥ 90 %) a početností (hloubka ≥ 3). Výsledky hloubky KMA byly transformovány pomocí CLR, jak je popsáno výše. Výsledky KMA byly poté porovnány s ID kontigů z funkční anotace a výsledků klasifikace s použitím zdroje kontigů pro každý gen. Stejně jako u taxonů byly významné rozdíly v početnosti genů definovány jako geny s průměrným rozdílem CLR ≥ 1 nebo ≤ -1, přičemž znaménko (+/-) označovalo, že gen byl hojnější ve vzorcích PPA nebo kontrolních vzorcích.
Geny byly nejprve seskupeny podle identifikátorů orthologů (KO) z Kjótské encyklopedie genů a genomů (KEGG), které přiřadil eggNOG, aby se porovnala abundance genových drah. Geny bez knockoutů nebo geny s více knockouty byly před analýzou odstraněny. Poté byla vypočítána průměrná abundance každého KO na vzorek a provedena statistická analýza. Geny metabolismu PPA byly definovány jako jakýkoli gen, kterému byl ve sloupci KEGG_Pathway přiřazen řádek ko00640, což ukazuje na roli v metabolismu propionátu podle KEGG. Geny identifikované jako asociované s produkcí PPA jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Byly provedeny permutační testy k identifikaci genů metabolismu a produkce PPA, které byly v každém typu vzorku významně hojnější. Pro každý analyzovaný gen bylo provedeno tisíc permutací. Jako mezní hodnota pro stanovení statistické významnosti byla použita p-hodnota 0,05. Funkční anotace byly přiřazeny jednotlivým genům v rámci klastru na základě anotací reprezentativních genů v rámci klastru. Taxony spojené s metabolismem PPA a/nebo produkcí PPA mohly být identifikovány porovnáváním ID kontigů ve výstupních souborech Kraken2 se stejnými ID kontigů zachovanými během funkční anotace pomocí eggNOG. Testování významnosti bylo provedeno pomocí Mann-Whitneyho U testu popsaného dříve. Korekce pro vícenásobné testování byla provedena pomocí Benjaminiho-Hochbergova postupu. Jako hraniční hodnota pro stanovení statistické významnosti byla použita p-hodnota ≤ 0,05.
Rozmanitost střevního mikrobiomu myší byla hodnocena pomocí Simpsonova indexu diverzity. Mezi kontrolními a PPA vzorky nebyly pozorovány žádné významné rozdíly z hlediska rodové a druhové diverzity (p-hodnota pro rod: 0,18, p-hodnota pro druh: 0,16) (Obrázek 1). Mikrobiální složení bylo poté porovnáno pomocí analýzy hlavních komponent (PCA). Obrázek 2 ukazuje shlukování vzorků podle jejich kmenů, což naznačuje, že mezi PPA a kontrolními vzorky existovaly rozdíly v druhovém složení mikrobiomů. Toto shlukování bylo na úrovni rodu méně výrazné, což naznačuje, že PPA ovlivňuje určité bakterie (Doplňkový obrázek 1).
Obrázek 1. Alfa diverzita rodů a druhové složení střevního mikrobiomu myší. Krabicové grafy znázorňující Simpsonovy indexy diverzity rodů (A) a druhů (B) ve vzorcích PPA a kontrolních vzorcích. Signifikance byla stanovena pomocí Mann-Whitneyho U testu a vícenásobná korekce byla provedena pomocí Benjaminiho-Hochbergova postupu. ns, p-hodnota nebyla statisticky významná (p>0,05).
Obrázek 2. Výsledky analýzy hlavních komponent složení střevního mikrobiomu myší na úrovni druhu. Graf analýzy hlavních komponent zobrazuje rozložení vzorků podle jejich prvních dvou hlavních komponent. Barvy označují typ vzorku: myši vystavené PPA jsou fialové a kontrolní myši žluté. Hlavní komponenty 1 a 2 jsou vyneseny na osu x a osu y a jsou vyjádřeny jako jejich vysvětlený poměr rozptylu.
S využitím transformovaných dat počtu RLE byl u kontrolních myší a myší PPA (kontrola: 9,66, PPA: 3,02; p-hodnota = 0,0011) pozorován významný pokles středního poměru Bacteroidetes/Bacilli. Tento rozdíl byl způsoben vyšším výskytem Bacteroidetes u myší PPA ve srovnání s kontrolami, ačkoli rozdíl nebyl statisticky významný (průměrná CLR u kontroly: 5,51, průměrná CLR u PPA: 6,62; p-hodnota = 0,054), zatímco výskyt Bacteroidetes byl podobný (průměrná CLR u kontroly: 7,76, průměrná CLR u PPA: 7,60; p-hodnota = 0,18).
Analýza početnosti taxonomických členů střevního mikrobiomu ukázala, že 1 kmen a 77 druhů se mezi vzorky PPA a kontrolními vzorky významně lišily (doplňková tabulka 2). Početnost 59 druhů ve vzorcích PPA byla významně vyšší než v kontrolních vzorcích, zatímco početnost pouze 16 druhů v kontrolních vzorcích byla vyšší než ve vzorcích PPA (obrázek 3).
Obrázek 3. Rozdílná abundance taxonů ve střevním mikrobiomu myší PPA a kontrolních myší. Volcano plot zobrazují rozdíly v abundanci rodů (A) nebo druhů (B) mezi vzorky PPA a kontrolními vzorky. Šedé tečky označují žádný významný rozdíl v abundanci taxonů. Barevné tečky označují významné rozdíly v abundanci (p-hodnota ≤ 0,05). Prvních 20 taxonů s největšími rozdíly v abundanci mezi typy vzorků je zobrazeno červeně a světle modře (kontrolní vzorky a vzorky PPA). Žluté a fialové tečky byly nejméně 2,7krát hojnější v kontrolních vzorcích nebo vzorcích PPA než v kontrolních vzorcích. Černé tečky představují taxony s významně odlišnou abundancí, s průměrnými rozdíly CLR mezi -1 a 1. Hodnoty P byly vypočteny pomocí Mann-Whitneyho U testu a korigovány pro vícenásobné testování pomocí Benjaminiho-Hochbergova postupu. Tučně zvýrazněné průměrné rozdíly CLR označují významné rozdíly v abundanci.
Po analýze mikrobiálního složení střeva jsme provedli funkční anotaci mikrobiomu. Po odfiltrování genů nízké kvality bylo ve všech vzorcích identifikováno celkem 378 355 unikátních genů. Transformovaná abundance těchto genů byla použita pro analýzu hlavních komponent (PCA) a výsledky ukázaly vysoký stupeň shlukování typů vzorků na základě jejich funkčních profilů (obrázek 4).
Obrázek 4. Výsledky PCA s využitím funkčního profilu střevního mikrobiomu myši. Graf PCA zobrazuje distribuci vzorků v rámci jejich prvních dvou hlavních složek. Barvy označují typ vzorku: myši vystavené PPA jsou fialové a kontrolní myši žluté. Hlavní složky 1 a 2 jsou vyneseny na ose x a ose y a jsou vyjádřeny jako jejich vysvětlený poměr rozptylu.
Dále jsme zkoumali početnost knockoutů genu KEGG v různých typech vzorků. Celkem bylo identifikováno 3648 unikátních knockoutů, z nichž 196 bylo významně hojnější v kontrolních vzorcích a 106 bylo hojnějších ve vzorcích PPA (obrázek 5). V kontrolních vzorcích bylo detekováno celkem 145 genů a ve vzorcích PPA 61 genů s významně odlišným zastoupením. Dráhy související s metabolismem lipidů a aminocukrů byly ve vzorcích PPA významně bohatší (doplňková tabulka 3). Dráhy související s metabolismem dusíku a systémy přenosu síry byly v kontrolních vzorcích významně bohatší (doplňková tabulka 3). Početnost genů souvisejících s metabolismem aminocukrů/nukleotidů (ko:K21279) a metabolismem inositolfosfátu (ko:K07291) byla ve vzorcích PPA významně vyšší (obrázek 5). Kontrolní vzorky měly významně více genů souvisejících s metabolismem benzoátu (ko:K22270), metabolismem dusíku (ko:K00368) a glykolýzou/glukoneogenezí (ko:K00131) (obrázek 5).
Obr. 5. Rozdílná abundance KO ve střevním mikrobiomu myší PPA a kontrolních myší. Vulkánový graf znázorňuje rozdíly v abundanci funkčních skupin (KO). Šedé tečky označují KO, jejichž abundance se mezi typy vzorků významně nelišila (p-hodnota > 0,05). Barevné tečky označují významné rozdíly v abundanci (p-hodnota ≤ 0,05). 20 KO s největšími rozdíly v abundanci mezi typy vzorků je zobrazeno červeně a světle modře, což odpovídá kontrolním vzorkům a vzorkům PPA. Žluté a fialové tečky označují KO, které byly alespoň 2,7krát hojnější v kontrolních vzorcích a vzorcích PPA. Černé tečky označují KO s významně odlišnou abundancí, s průměrnými rozdíly CLR mezi -1 a 1. Hodnoty P byly vypočteny pomocí Mann-Whitneyho U testu a upraveny pro vícenásobná srovnání pomocí Benjaminiho-Hochbergova postupu. NaN označuje, že KO nepatří do dráhy v KEGG. Tučně zvýrazněné průměrné hodnoty rozdílu CLR označují významné rozdíly v abundanci. Podrobné informace o drahách, ke kterým patří uvedené KO, viz doplňková tabulka 3.
Mezi anotovanými geny mělo 1601 genů významně odlišné zastoupení mezi typy vzorků (p ≤ 0,05), přičemž každý gen byl alespoň 2,7krát hojnější. Z těchto genů byly 4 geny hojnější v kontrolních vzorcích a 1597 genů bylo hojnější ve vzorcích PPA. Vzhledem k tomu, že PPA má antimikrobiální vlastnosti, zkoumali jsme zastoupení genů metabolismu a produkce PPA mezi typy vzorků. Z 1332 genů souvisejících s metabolismem PPA bylo 27 genů významně hojnější v kontrolních vzorcích a 12 genů bylo hojnější ve vzorcích PPA. Z 223 genů souvisejících s produkcí PPA byl 1 gen významně hojnější ve vzorcích PPA. Obrázek 6A dále ukazuje vyšší zastoupení genů zapojených do metabolismu PPA s významně vyšším zastoupením v kontrolních vzorcích a velkými velikostmi účinku, zatímco obrázek 6B zdůrazňuje jednotlivé geny s významně vyšším zastoupením pozorovaným ve vzorcích PPA.
Obr. 6. Rozdílná abundance genů souvisejících s PPA v mikrobiomu střeva myši. Volcano plot znázorňuje rozdíly v abundanci genů spojených s metabolismem PPA (A) a produkcí PPA (B). Šedé tečky označují geny, jejichž abundance se mezi typy vzorků významně nelišila (p-hodnota > 0,05). Barevné tečky označují významné rozdíly v abundanci (p-hodnota ≤ 0,05). 20 genů s největšími rozdíly v abundanci je zobrazeno červeně a světle modře (kontrolní vzorky a vzorky PPA). Abundance žlutých a fialových teček byla nejméně 2,7krát vyšší v kontrolních vzorcích a vzorcích PPA než v kontrolních vzorcích. Černé tečky představují geny s významně odlišnou abundancí, s průměrnými rozdíly CLR mezi -1 a 1. Hodnoty P byly vypočteny pomocí Mann-Whitneyho U testu a korigovány pro vícenásobná srovnání pomocí Benjaminiho-Hochbergova postupu. Geny odpovídají reprezentativním genům v neredundantním katalogu genů. Názvy genů se skládají ze symbolu KEGG označujícího gen KO. Tučně zvýrazněné průměrné rozdíly CLR označují významně odlišné abundance. Pomlčka (-) označuje, že v databázi KEGG neexistuje žádný symbol pro daný gen.
Taxony s geny souvisejícími s metabolismem a/nebo produkcí PPA byly identifikovány porovnáním taxonomické identity kontigů s kontigovým ID genu. Na úrovni rodu bylo zjištěno, že 130 rodů má geny související s metabolismem PPA a 61 rodů má geny související s produkcí PPA (doplňková tabulka 4). Žádný rod však nevykazoval významné rozdíly v početnosti (p > 0,05).
Na druhové úrovni bylo u 144 bakteriálních druhů nalezeno geny spojené s metabolismem PPA a u 68 bakteriálních druhů geny spojené s produkcí PPA (doplňková tabulka 5). Mezi metabolizátory PPA vykazovalo osm bakterií významný nárůst početnosti mezi typy vzorků a všechny vykazovaly významné změny v účinku (doplňková tabulka 6). Všichni identifikovaní metabolizátoři PPA s významnými rozdíly v početnosti byli ve vzorcích PPA hojnější. Klasifikace na druhové úrovni odhalila zástupce rodů, které se mezi typy vzorků významně nelišily, včetně několika druhů Bacteroides a Ruminococcus, stejně jako Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus a Alcaligenes polymorpha. Mezi bakteriemi produkujícími PPA vykazovaly čtyři bakterie významné rozdíly v početnosti mezi typy vzorků. Mezi druhy s významnými rozdíly v početnosti patřily Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis a Ruminococcus bovis.
V této studii jsme zkoumali vliv expozice PPA na střevní mikrobiotu myší. PPA může u bakterií vyvolat různé reakce, protože ji produkují určité druhy, používají ji jako zdroj potravy jiné druhy nebo má antimikrobiální účinky. Proto může mít její přidání do střevního prostředí prostřednictvím doplňků stravy různé účinky v závislosti na toleranci, citlivosti a schopnosti ji využít jako zdroj živin. Citlivé bakteriální druhy mohou být eliminovány a nahrazeny těmi, které jsou vůči PPA odolnější nebo schopné ji využít jako zdroj potravy, což vede ke změnám ve složení střevní mikrobioty. Naše výsledky odhalily významné rozdíly v mikrobiálním složení, ale žádný vliv na celkovou mikrobiální rozmanitost. Největší účinky byly pozorovány na druhové úrovni, kdy se mezi vzorky PPA a kontrolními vzorky významně lišilo více než 70 taxonů (doplňková tabulka 2). Další hodnocení složení vzorků vystavených PPA odhalilo větší heterogenitu mikrobiálních druhů ve srovnání s neexponovanými vzorky, což naznačuje, že PPA může zlepšit charakteristiky růstu bakterií a omezit bakteriální populace, které mohou přežít v prostředí bohatém na PPA. PPA tedy může selektivně indukovat změny, spíše než způsobovat rozsáhlé narušení diverzity střevní mikrobioty.
Dříve bylo prokázáno, že konzervační látky v potravinách, jako je PPA, mění množství složek střevního mikrobiomu, aniž by ovlivnily celkovou diverzitu (Nagpal et al., 2021). Zde jsme pozorovali nejvýraznější rozdíly mezi druhy Bacteroides v rámci kmene Bacteroidetes (dříve známého jako Bacteroidetes), které byly významně obohaceny u myší vystavených PPA. Zvýšené množství druhů Bacteroides je spojeno se zvýšenou degradací hlenu, což může zvýšit riziko infekce a podporovat zánět (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Jedna studie zjistila, že novorození samci myší léčení Bacteroides fragilis vykazovali sociální chování připomínající poruchu autistického spektra (PAS) (Carmel et al., 2023), a další studie ukázaly, že druhy Bacteroides mohou měnit imunitní aktivitu a vést k autoimunitní zánětlivé kardiomyopatii (Gil-Cruz et al., 2019). Druhy patřící do rodů Ruminococcus, Prevotella a Parabacteroides byly také významně zvýšeny u myší vystavených PPA (Coretti et al., 2018). Některé druhy Ruminococcus jsou spojovány s onemocněními, jako je Crohnova choroba, a to produkcí prozánětlivých cytokinů (Henke et al., 2019), zatímco druhy Prevotella, jako je Prevotella humani, jsou spojovány s metabolickými onemocněními, jako je hypertenze a citlivost na inzulín (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Nakonec jsme zjistili, že poměr Bacteroidetes (dříve známých jako Firmicutes) k Bacteroidetes byl u myší vystavených PPA významně nižší než u kontrolních myší kvůli vyšší celkové hojnosti druhů Bacteroidetes. Tento poměr byl dříve prokázán jako důležitý ukazatel střevní homeostázy a poruchy tohoto poměru byly spojovány s různými chorobnými stavy (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), včetně zánětlivých onemocnění střev (Stojanov et al., 2020). Zdá se, že druhy kmene Bacteroidetes jsou kolektivně nejvíce ovlivněny zvýšenou hladinou PPA ve stravě. To může být způsobeno vyšší tolerancí k PPA nebo schopností využívat PPA jako zdroj energie, což se ukázalo jako pravdivé u alespoň jednoho druhu, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Alternativně může expozice matky PPA zlepšit vývoj plodu tím, že učiní střevo myších potomků náchylnějším ke kolonizaci Bacteroidetes; design naší studie však takové posouzení neumožnil.
Metagenomické hodnocení obsahu odhalilo významné rozdíly v množství genů spojených s metabolismem a produkcí PPA, přičemž myši vystavené PPA vykazovaly vyšší množství genů zodpovědných za produkci PPA, zatímco myši vystavené PPA vykazovaly vyšší množství genů zodpovědných za metabolismus PAA (obrázek 6). Tyto výsledky naznačují, že vliv PPA na mikrobiální složení nemusí být způsoben pouze jejím použitím, jinak by množství genů spojených s metabolismem PPA mělo vykazovat vyšší množství ve střevním mikrobiomu myší vystavených PPA. Jedním z vysvětlení je, že PPA zprostředkovává bakteriální množství primárně prostřednictvím svých antimikrobiálních účinků, spíše než prostřednictvím svého využití bakteriemi jako živiny. Předchozí studie ukázaly, že PPA inhibuje růst Salmonella Typhimurium způsobem závislým na dávce (Jacobson et al., 2018). Expozice vyšším koncentracím PPA může selektovat bakterie, které jsou rezistentní vůči jejím antimikrobiálním vlastnostem a nemusí být nutně schopny ji metabolizovat nebo produkovat. Například několik druhů Parabacteroides vykazovalo významně vyšší početnost ve vzorcích PPA, ale nebyly detekovány žádné geny související s metabolismem nebo produkcí PPA (doplňkové tabulky 2, 4 a 5). Produkce PPA jako vedlejší produkt fermentace je navíc široce rozšířena mezi různými bakteriemi (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Vyšší bakteriální diverzita může být důvodem vyššího zastoupení genů souvisejících s metabolismem PPA v kontrolních vzorcích (Averina et al., 2020). Dále bylo předpovězeno, že pouze 27 (2,14 %) z 1332 genů budou geny spojené výhradně s metabolismem PPA. Mnoho genů spojených s metabolismem PPA se podílí i na jiných metabolických drahách. To dále ukazuje, že početnost genů zapojených do metabolismu PPA byla v kontrolních vzorcích vyšší; tyto geny mohou fungovat v drahách, které nevedou k využití nebo tvorbě PPA jako vedlejšího produktu. V tomto případě pouze jeden gen spojený s tvorbou PPA vykazoval významné rozdíly v početnosti mezi typy vzorků. Na rozdíl od genů spojených s metabolismem PPA byly markerové geny pro produkci PPA vybrány, protože se přímo podílejí na bakteriální dráze produkce PPA. U myší vystavených PPA bylo zjištěno, že všechny druhy měly významně zvýšenou početnost a schopnost produkovat PPA. To podporuje predikci, že PPA by selektovaly producenty PPA, a proto predikují, že se zvýší produkční kapacita PPA. Početnost genů však nemusí nutně korelovat s genovou expresí; ačkoli je početnost genů spojených s metabolismem PPA v kontrolních vzorcích vyšší, míra exprese se může lišit (Shi et al., 2014). Pro potvrzení vztahu mezi prevalencí genů produkujících PPA a produkcí PPA jsou zapotřebí studie exprese genů zapojených do produkce PPA.
Funkční anotace metagenomů PPA a kontrolních metagenomů odhalila určité rozdíly. PCA analýza obsahu genů odhalila diskrétní shluky mezi vzorky PPA a kontrolními vzorky (obrázek 5). Shlukování v rámci vzorku ukázalo, že obsah kontrolních genů byl rozmanitější, zatímco vzorky PPA se shlukovaly dohromady. Shlukování podle obsahu genů bylo srovnatelné se shlukováním podle druhového složení. Rozdíly v hojnosti drah jsou tedy v souladu se změnami v hojnosti specifických druhů a kmenů v nich. Ve vzorcích PPA byly dvě dráhy s významně vyšší hojností spojeny s metabolismem aminocukrů/nukleotidů (ko:K21279) a s více drahami metabolismu lipidů (ko:K00647, ko:K03801; doplňková tabulka 3). Je známo, že geny spojené s ko:K21279 jsou spojeny s rodem Bacteroides, jedním z rodů s významně vyšším počtem druhů ve vzorcích PPA. Tento enzym se může vyhnout imunitní odpovědi expresí kapsulárních polysacharidů (Wang et al., 2008). To může vysvětlovat nárůst Bacteroidetes pozorovaný u myší vystavených PPA. To doplňuje zvýšenou syntézu mastných kyselin pozorovanou v mikrobiomu PPA. Bakterie využívají dráhu FASIIko:K00647 (fabB) k produkci mastných kyselin, což může ovlivňovat metabolické dráhy hostitele (Yao a Rock, 2015; Johnson a kol., 2020), a změny v metabolismu lipidů mohou hrát roli v neurovývoji (Yu a kol., 2020). Další dráhou vykazující zvýšenou hojnost ve vzorcích PPA byla biosyntéza steroidních hormonů (ko:K12343). Existuje stále více důkazů o tom, že existuje inverzní vztah mezi schopností střevní mikrobioty ovlivňovat hladiny hormonů a být jimi ovlivňována, takže zvýšené hladiny steroidů mohou mít následné zdravotní důsledky (Tetel a kol., 2018).
Tato studie není bez omezení a úvah. Důležitým rozdílem je, že jsme neprovedli fyziologická hodnocení zvířat. Proto není možné přímo dojít k závěru, zda jsou změny v mikrobiomu spojeny s nějakým onemocněním. Dalším úvahou je, že myši v této studii byly krmeny stejnou stravou jako jejich matky. Budoucí studie by mohly určit, zda přechod z diety bohaté na PPA na dietu bez PPA zlepšuje její účinky na mikrobiom. Jedním z omezení naší studie, stejně jako mnoha dalších, je omezená velikost vzorku. Ačkoli lze vyvodit platné závěry, větší velikost vzorku by poskytla větší statistickou sílu při analýze výsledků. Jsme také opatrní při vyvozování závěrů o souvislosti mezi změnami ve střevním mikrobiomu a jakýmkoli onemocněním (Yap et al., 2021). Matoucí faktory, včetně věku, pohlaví a stravy, mohou významně ovlivnit složení mikroorganismů. Tyto faktory mohou vysvětlovat nesrovnalosti pozorované v literatuře ohledně souvislosti střevního mikrobiomu se složitými onemocněními (Johnson et al., 2019; Lagod a Naser, 2023). Například u zvířat i lidí s poruchou autistického spektra (PAS) bylo prokázáno, že jejich množství je buď zvýšené, nebo snížené (Angelis a kol., 2013; Kushak a kol., 2017). Podobně studie složení střev u pacientů se zánětlivými střevními onemocněními zjistily jak zvýšení, tak snížení u stejných taxonů (Walters a kol., 2014; Forbes a kol., 2018; Upadhyay a kol., 2023). Abychom omezili dopad genderové zkreslení, snažili jsme se zajistit rovné zastoupení pohlaví, aby rozdíly byly s největší pravděpodobností způsobeny stravou. Jednou z výzev funkční anotace je odstranění redundantních genových sekvencí. Naše metoda shlukování genů vyžaduje 95% identitu sekvence a 85% podobnost délky, stejně jako 90% pokrytí zarovnáním, aby se eliminovalo falešné shlukování. V některých případech jsme však pozorovali komplexy genů (COG) se stejnými anotacemi (např. MUT) (obr. 6). Jsou zapotřebí další studie, aby se zjistilo, zda jsou tyto ortology odlišné, asociované se specifickými rody, nebo zda se jedná o omezení přístupu shlukování genů. Dalším omezením funkční anotace je potenciální chybná klasifikace; bakteriální gen mmdA je známý enzym zapojený do syntézy propionátu, ale KEGG jej nespojuje s metabolickou cestou propionátu. Naproti tomu ortology scpB a mmcD jsou příbuzné. Velký počet genů bez určených knockoutů může vést k neschopnosti identifikovat geny související s PPA při hodnocení genové abundance. Budoucí studie budou těžit z analýzy metatranskriptomu, která může poskytnout hlubší pochopení funkčních charakteristik střevní mikrobioty a propojit genovou expresi s potenciálními následnými účinky. Pro studie zahrnující specifické neurovývojové poruchy nebo zánětlivá onemocnění střev je nutné fyziologické a behaviorální hodnocení zvířat, aby se propojily změny ve složení mikrobiomu s těmito poruchami. Další studie transplantující střevní mikrobiom myším bez choroboplodných zárodků by byly také užitečné pro určení, zda je mikrobiom hnací silou nebo charakteristikou onemocnění.
Souhrnně jsme prokázali, že PPA ve stravě působí jako faktor měnící složení střevní mikrobioty. PPA je konzervant schválený FDA, který se široce vyskytuje v různých potravinách a při dlouhodobé expozici může vést k narušení normální střevní flóry. Zjistili jsme změny v množství několika bakterií, což naznačuje, že PPA může ovlivnit složení střevní mikrobioty. Změny v mikrobiotě mohou vést ke změnám v hladinách určitých metabolických drah, což může vést k fyziologickým změnám, které jsou relevantní pro zdraví hostitele. Jsou zapotřebí další studie, aby se zjistilo, zda účinky PPA ve stravě na mikrobiální složení mohou vést k dysbióze nebo jiným onemocněním. Tato studie pokládá základ pro budoucí studie o tom, jak mohou účinky PPA na složení střeva ovlivnit lidské zdraví.
Datové sady prezentované v této studii jsou dostupné v online repozitářích. Název repozitáře a jeho evidenční číslo jsou: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Tato studie na zvířatech byla schválena Výborem pro péči o zvířata a jejich používání Univerzity centrální Floridy (UCF-IACUC) (číslo povolení k používání zvířat: PROTO202000002). Tato studie je v souladu s místními zákony, předpisy a institucionálními požadavky.
NG: Konceptualizace, kurace dat, formální analýza, zkoumání, metodologie, software, vizualizace, psaní (původní koncept), psaní (recenze a editace). LA: Konceptualizace, kurace dat, metodologie, zdroje, psaní (recenze a editace). SH: Formální analýza, software, psaní (recenze a editace). SA: zkoumání, psaní (recenze a editace). Hlavní rozhodčí: zkoumání, psaní (recenze a editace). SN: Konceptualizace, administrace projektu, zdroje, supervize, psaní (recenze a editace). TA: Konceptualizace, administrace projektu, supervize, psaní (recenze a editace).
Autoři prohlašují, že na výzkum, napsání a/nebo publikaci tohoto článku neobdrželi žádnou finanční podporu.
Autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez jakýchkoli obchodních nebo finančních vztahů, které by mohly být vykládány jako potenciální střet zájmů. Neuplatňuje se.
Veškeré názory vyjádřené v tomto článku jsou výhradně názory autorů a nemusí nutně odrážet názory jejich institucí, vydavatelů, editorů ani recenzentů. Žádné produkty hodnocené v tomto článku ani žádná tvrzení jejich výrobců nejsou vydavatelem zaručena ani schválena.
Doplňující materiály k tomuto článku naleznete online: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Kyselina propionová indukuje gliózu a neurozáněty regulací dráhy PTEN/AKT u poruch autistického spektra. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Statistická analýza kompozičních dat. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Poměr Firmicutes/Bacteroidetes jako rizikový faktor rakoviny prsu. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Analýza diferenciální exprese dat z počtu sekvencí. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI a kol. (2013). Fekální mikrobiota a metabolom u dětí s autismem a pervazivní vývojovou poruchou blíže neurčenou. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Bakteriální neurometabolické charakteristiky střevní mikrobioty u malých dětí s poruchami autistického spektra. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobiom jako lidský orgán. Clinical Microbiology and Infection 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Nové poznatky o fyziologii bakterií produkujících kyselinu propionovou: Anaerotignum propionicum a Anaerotignum neopropionicum (dříve Clostridium propionicum a Clostridium neopropionicum). Mikroorganismy 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Výživa matky a vývoj plodu. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y. a Hochberg, J. (1995). Kontrola míry falešně pozitivních výsledků: Praktický a efektivní přístup k vícenásobnému testování. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x