Imunomodulační metabolity jsou klíčovým prvkem nádorového mikroprostředí (TME), ale až na několik výjimek zůstává jejich identita do značné míry neznámá. V této studii jsme analyzovali nádory a T buňky z nádorů a ascitu pacientů s vysoce maligním serózním karcinomem (HGSC), abychom odhalili metabolom těchto různých kompartmentů TME. Ascites a nádorové buňky se vyznačují rozsáhlými rozdíly v metabolitech. Ve srovnání s ascitem jsou nádor infiltrující T buňky významně obohaceny o 1-methylnikotinamid (MNA). Přestože je hladina MNA v T buňkách zvýšená, exprese nikotinamid-N-methyltransferázy (enzymu, který katalyzuje přenos methylových skupin z S-adenosylmethioninu na nikotinamid) je omezena na fibroblasty a nádorové buňky. Funkčně MNA indukuje T buňky k sekreci cytokinu tumor nekrotizujícího faktoru alfa, který podporuje růst nádoru. MNA odvozený z TME proto přispívá k imunitní regulaci T buněk a představuje potenciální cíl imunoterapie pro léčbu lidské rakoviny.
Metabolity pocházející z nádorů mohou mít výrazný inhibiční účinek na protinádorovou imunitu a stále více důkazů ukazuje, že mohou sloužit také jako klíčová hnací síla progrese onemocnění (1). Kromě Warburgova efektu se v poslední době začaly zabývat i metabolickým stavem nádorových buněk a jeho vztahem k imunitnímu stavu nádorového mikroprostředí (TME). Studie na myších modelech a lidských T-buňkách ukázaly, že metabolismus glutaminu (2), oxidační metabolismus (3) a metabolismus glukózy (4) mohou působit nezávisle na různé podskupiny imunitních buněk. Několik metabolitů v těchto drahách inhibuje protinádorovou funkci T-buněk. Bylo prokázáno, že blokáda koenzymu tetrahydrobiopterinu (BH4) může poškodit proliferaci T-buněk a zvýšení BH4 v těle může zesílit protinádorovou imunitní odpověď zprostředkovanou CD4 a CD8. Imunosupresivní účinek kynureninu lze navíc zvrátit podáváním BH4 (5). U glioblastomu s mutací isocitrátdehydrogenázy (IDH) inhibuje sekrece enantiometabolického (R)-2-hydroxyglutarátu (R-2-HG) aktivaci, proliferaci a cytolýzu T-buněk (6). Nedávno bylo prokázáno, že methylglyoxal, vedlejší produkt glykolýzy, je produkován supresorovými buňkami myeloidního původu a přenos methylglyoxalu T-buňkami může inhibovat funkci efektorových T-buněk. Při léčbě může neutralizace methylglyoxalu překonat aktivitu supresorových buněk odvozených od myeloidů (MDSC) a synergicky zesílit terapii blokády kontrolních bodů u myších modelů (7). Tyto studie společně zdůrazňují klíčovou roli metabolitů odvozených od TME v regulaci funkce a aktivity T-buněk.
Dysfunkce T buněk byla široce hlášena u rakoviny vaječníků (8). To je částečně způsobeno metabolickými charakteristikami, které jsou vlastní hypoxii a abnormální vaskulaturě nádoru (9), což vede k přeměně glukózy a tryptofanu na vedlejší produkty, jako je kyselina mléčná a kynurenin. Nadměrný extracelulární laktát snižuje produkci interferonu-γ (IFN-γ) a řídí diferenciaci myelosupresivních podskupin (10, 11). Konzumace tryptofanu přímo inhibuje proliferaci T buněk a inhibuje signalizaci T buněčných receptorů (12-14). Navzdory těmto pozorováním byla provedena řada prací týkajících se imunitního metabolismu v in vitro kultuře T buněk s použitím optimalizovaných médií nebo omezena na homologní myší modely in vivo, z nichž ani jedno plně neodráží heterogenitu lidských rakovin a fyziologického makro a mikro prostředí.
Společným rysem rakoviny vaječníků je peritoneální šíření a výskyt ascitu. Akumulace buněčné tekutiny v ascitu je spojena s pokročilým onemocněním a špatnou prognózou (15). Podle zpráv je tento jedinečný kompartment hypoxický, má vysoké hladiny vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) a indoleamin-2,3-dioxygenázy (IDO) a je infiltrován regulačními T buňkami a myeloidními inhibičními buňkami (15-18). Metabolické prostředí ascitu se může lišit od metabolického prostředí samotného nádoru, takže reprogramování T buněk v peritoneálním prostoru není jasné. Kromě toho klíčové rozdíly a heterogenita mezi ascitem a metabolity přítomnými v prostředí nádoru mohou bránit infiltraci imunitních buněk a jejich funkci v nádorech, a je zapotřebí dalšího výzkumu.
Abychom tyto problémy vyřešili, navrhli jsme citlivou metodu separace buněk a tandemové hmotnostní spektrometrie s kapalinovou chromatografií (LC-MS/MS) pro studium různých typů buněk (včetně CD4+ a CD8+ T buněk), jakož i uvnitř a mezi nádory. Její metabolity se nacházejí v buňkách ve stejném ascitu a nádorovém prostředí pacienta. Tuto metodu používáme ve spojení s vysokorozměrnou průtokovou cytometrií a sekvenováním RNA jednotlivých buněk (scRNA-seq), abychom poskytli vysoce rozlišený portrét metabolického stavu těchto klíčových populací. Tato metoda odhalila významný nárůst hladiny 1-methylnikotinamidu (MNA) v nádorových T buňkách a experimenty in vitro ukázaly, že imunomodulační účinek MNA na funkci T buněk byl dříve neznámý. Obecně tato metoda odhaluje vzájemné metabolické interakce mezi nádory a imunitními buňkami a poskytuje jedinečný vhled do metabolitů imunitní regulace, což může být užitečné pro léčbu rakoviny vaječníků pomocí imunoterapie založené na T buňkách. Možnosti léčby.
K simultánní kvantifikaci absorpce glukózy [2-(N-(7-nitrofenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglukóza (2-NBDG) a mitochondriální aktivita [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) jsou typické markery, které odlišují imunitní buňky od populací nádorových buněk (tabulka S2 a obrázek S1A). Tato analýza ukázala, že ve srovnání s T buňkami mají ascites a nádorové buňky vyšší hladiny absorpce glukózy, ale menší rozdíly v mitochondriální aktivitě. Průměrná absorpce glukózy nádorovými buňkami [CD45-EpCAM (EpCAM)+] je třikrát až čtyřikrát vyšší než u T buněk a průměrná absorpce glukózy CD4+ T buněk je 1,2krát vyšší než u CD8+ T buněk, což naznačuje, že nádor infiltrující lymfocyty (TIL) mají odlišné metabolické požadavky i ve stejném tumorovém epitelu (obrázek 1A). Naproti tomu mitochondriální aktivita v nádorových buňkách je podobná aktivitě CD4+ T buněk a mitochondriální aktivita obou typů buněk je vyšší než aktivita CD8+ T buněk (obrázek 1B). Obecně tyto výsledky odhalují metabolickou úroveň. Metabolická aktivita nádorových buněk je vyšší než aktivita CD4+ T buněk a metabolická aktivita CD4+ T buněk je vyšší než aktivita CD8+ T buněk. Navzdory těmto účinkům napříč typy buněk neexistuje konzistentní rozdíl v metabolickém stavu CD4+ a CD8+ T buněk ani v jejich relativních podílech v ascitu ve srovnání s nádory (obrázek 1C). Naproti tomu ve frakci CD45-buněk se podíl buněk EpCAM+ v nádoru zvýšil ve srovnání s ascitem (obrázek 1D). Také jsme pozorovali jasný metabolický rozdíl mezi složkami buněk EpCAM+ a EpCAM-. Buňky EpCAM+ (nádorové) mají vyšší příjem glukózy a mitochondriální aktivitu než buňky EpCAM-, což je mnohem vyšší než metabolická aktivita fibroblastů v nádorových buňkách při tromboembolickém melatomorfním onemocnění (obrázek 1, E a F).
(A a B) Medián intenzity fluorescence (MFI) absorpce glukózy (2-NBDG) (A) a mitochondriální aktivita CD4+ T buněk (MitoTracker tmavě červená) (B) Reprezentativní grafy (vlevo) a tabulková data (vpravo), CD8+ T buňky a EpCAM+ CD45-nádorové buňky z ascitu a nádoru. (C) Poměr CD4+ a CD8+ buněk (CD3+ T buněk) v ascitu a nádoru. (D) Podíl nádorových buněk EpCAM+ v ascitu a nádoru (CD45−). (E a ​​F) Absorpce glukózy EpCAM+ CD45-nádor a EpCAM-CD45-matrix (2-NBDG) (E) a mitochondriální aktivita (MitoTracker tmavě červená) (F) Reprezentativní grafy (vlevo) a tabulková data (vpravo) Ascites a nádorové buňky. (G) Reprezentativní grafy exprese CD25, CD137 a PD1 průtokovou cytometrií. (H a I) Exprese CD25, CD137 a PD1 na CD4+ T buňkách (H) a CD8+ T buňkách (I). (J a K) Naivní, centrálně paměťové (Tcm), efektorové (Teff) a efektorově paměťové (Tem) fenotypy založené na expresi CCR7 a CD45RO. Reprezentativní obrázky (vlevo) a tabulková data (vpravo) CD4+ T buněk (J) a CD8+ T buněk (K) v ascitu a nádorech. Hodnoty P ​​stanoveny párovým t-testem (*P<0,05, **P<0,01 a ***P<0,001). Čára představuje shodné pacienty (n = 6). FMO, fluorescence mínus jedna; MFI, střední intenzita fluorescence.
Další analýza odhalila další významné rozdíly mezi fenotypovým statusem vysoce rozlišených T buněk. Aktivovaná (obrázek 1, G až I) a efektorová paměť (obrázek 1, J a K) jsou v nádorech mnohem častější než ascites (podíl CD3+ T buněk). Podobně analýza fenotypu pomocí exprese aktivačních markerů (CD25 a CD137) a markerů deplece [protein programované buněčné smrti 1 (PD1)] ukázala, že ačkoli se metabolické charakteristiky těchto populací liší (obrázek S1, B až E), nebyly konzistentně pozorovány žádné významné metabolické rozdíly mezi naivními, efektorovými nebo paměťovými podskupinami (obrázek S1, F až I). Tyto výsledky byly potvrzeny použitím metod strojového učení k automatickému přiřazení buněčných fenotypů (21), což dále odhalilo přítomnost velkého počtu buněk kostní dřeně (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) v ascitu pacienta (obrázek S2A). Ze všech identifikovaných typů buněk vykazovala tato myeloidní buněčná populace nejvyšší příjem glukózy a mitochondriální aktivitu (obrázek S2, B až G). Tyto výsledky zdůrazňují silné metabolické rozdíly mezi různými typy buněk nalezenými v ascitu a nádorech u pacientů s HGSC.
Hlavní výzvou v pochopení metabonomických charakteristik TIL je potřeba izolovat vzorky T buněk dostatečné čistoty, kvality a množství z nádorů. Nedávné studie ukázaly, že metody třídění a obohacování kuličkami založené na průtokové cytometrii mohou vést ke změnám v profilech buněčných metabolitů (22-24). Abychom tento problém překonali, optimalizovali jsme metodu obohacování kuličkami k izolaci a izolaci TIL z chirurgicky resekovaného lidského ovariálního karcinomu před analýzou pomocí LC-MS/MS (viz Materiály a metody; Obrázek 2A). Abychom posoudili celkový dopad tohoto protokolu na změny metabolitů, porovnali jsme profily metabolitů T buněk aktivovaných zdravými dárci po výše uvedeném kroku separace kuliček s buňkami, které kuličky nebyly separovány, ale zůstaly na ledu. Tato analýza kontroly kvality zjistila, že mezi těmito dvěma podmínkami existuje vysoká korelace (r = 0,77) a technická opakovatelnost skupiny 86 metabolitů má vysokou opakovatelnost (Obrázek 2B). Tyto metody proto mohou provádět přesnou analýzu metabolitů v buňkách podstupujících obohacení buněčného typu, a poskytují tak první platformu s vysokým rozlišením pro identifikaci specifických metabolitů v HGSC, což lidem umožňuje hlouběji porozumět buněčné specifičnosti programu sexuálního metabolismu.
(A) Schematický diagram obohacení magnetickými kuličkami. Před analýzou pomocí LC-MS/MS buňky podstoupí tři po sobě jdoucí kola obohacení magnetickými kuličkami nebo zůstanou na ledu. (B) Vliv typu obohacení na množství metabolitů. Průměr tří měření pro každý typ obohacení ± SE. Šedá čára představuje vztah 1:1. Vnitrotřídní korelace (ICC) opakovaných měření je znázorněna v popisku osy. NAD, nikotinamidadenin dinukleotid. (C) Schematický diagram pracovního postupu analýzy metabolitů pacienta. Ascites nebo nádory jsou odebrány od pacientů a kryokonzervovány. Malá část každého vzorku byla analyzována průtokovou cytometrií, zatímco zbývající vzorky podstoupily tři kola obohacení o buňky CD4+, CD8+ a CD45-. Tyto buněčné frakce byly analyzovány pomocí LC-MS/MS. (D) Tepelná mapa standardizovaného množství metabolitů. Dendrogram představuje Wardovo shlukování euklidovských vzdáleností mezi vzorky. (E) Analýza hlavních komponent (PCA) mapy metabolitů vzorku, zobrazující tři replikáty každého vzorku, vzorky od stejného pacienta jsou spojeny čarou. (F) PCA profilu metabolitů vzorku podmíněného pacientem (tj. s použitím částečné redundance); typ vzorku je omezen konvexním obalem. PC1, hlavní složka 1; PC2, hlavní složka 2.
Dále jsme tuto metodu obohacení použili k analýze 99 metabolitů ve frakcích CD4+, CD8+ a CD45-buněk v primárním ascitu a nádorech šesti pacientů s HGSC (obrázek 2C, obrázek S3A a tabulka S3 a S4). Zkoumaná populace tvoří 2 % až 70 % původního velkého vzorku živých buněk a podíl buněk se mezi pacienty značně liší. Po oddělení kuliček představuje obohacená frakce (CD4+, CD8+ nebo CD45-) v průměru více než 85 % všech živých buněk ve vzorku. Tato metoda obohacení nám umožňuje analyzovat buněčné populace z metabolismu lidské nádorové tkáně, což je nemožné provést z velkých vzorků. Pomocí tohoto protokolu jsme zjistili, že l-kynurenin a adenosin, tyto dva dobře charakterizované imunosupresivní metabolity, byly zvýšené v nádorových T buňkách nebo nádorových buňkách (obrázek S3, B a C). Tyto výsledky proto demonstrují přesnost a schopnost naší technologie buněčné separace a hmotnostní spektrometrie najít biologicky důležité metabolity v tkáních pacientů.
Naše analýza také odhalila silnou metabolickou separaci buněčných typů v rámci pacientů i mezi nimi (obrázek 2D a obrázek S4A). Zejména pacient 70 vykazoval ve srovnání s ostatními pacienty odlišné metabolické charakteristiky (obrázek 2E a obrázek S4B), což naznačuje, že mezi pacienty může existovat značná metabolická heterogenita. Za zmínku stojí, že ve srovnání s ostatními pacienty (1,2 až 2 litry; tabulka S1) bylo celkové množství odebraného ascitu u pacienta 70 (80 ml) menší. Kontrola heterogenity mezi pacienty během analýzy hlavních komponent (například pomocí analýzy parciální redundance) ukazuje konzistentní změny mezi buněčnými typy a buněčné typy a/nebo mikroprostředí jsou jasně agregovány podle profilu metabolitů (obrázek 2F). Analýza jednotlivých metabolitů tyto účinky zdůraznila a odhalila významné rozdíly mezi buněčnými typy a mikroprostředím. Za zmínku stojí, že nejextrémnějším pozorovaným rozdílem je MNA, která je obvykle obohacena o CD45- buňky a o CD4+ a CD8+ buňky, které infiltrují nádor (obrázek 3A). U buněk CD4+ je tento efekt nejzřetelnější a zdá se, že i MNA v buňkách CD8+ je silně ovlivněna prostředím. To však není důležité, protože pouze u tří ze šesti pacientů lze vyšetřit skóre CD8+ nádoru. Kromě MNA jsou v různých typech buněk v ascitu a nádorech odlišně bohaté i další metabolity, které jsou v TIL špatně charakterizovány (obrázky S3 a S4). Tato data proto odhalují slibný soubor imunomodulačních metabolitů pro další výzkum.
(A) Normalizovaný obsah MNA v buňkách CD4+, CD8+ a CD45- z ascitu a nádoru. Krabicový graf ukazuje medián (linie), interkvartilní rozpětí (pásový frame) a datové rozpětí až do 1,5násobku interkvartilního rozpětí (whisker frame). Jak je popsáno v části Materiály a metody pro pacienty, použijte hodnotu limma pacienta k určení hodnoty P (*P<0,05 a **P<0,01). (B) Schematický diagram metabolismu MNA (60). Metabolity: S-adenosyl-1-methionin; SAH, S-adenosin-1-homocystein; NA, nikotinamid; MNA, 1-methylnikotinamid; 2-PY, 1-methyl-2-pyridon-5-karboxamid; 4-PY, 1-methyl-4-pyridon-5-karboxamid; NR, nikotinamid-ribóza; NMN, nikotinamid-mononukleotid. Enzymy (zeleně): NNMT, nikotinamid N-methyltransferáza; SIRT, sirtuiny; NAMPT, nikotinamid fosforibosyltransferáza; AOX1, aldehydoxidáza 1; NRK, nikotinamid ribosidkináza; NMNAT, nikotinamid mononukleotid adenyláttransferáza; Pnp1, purin nukleosid fosforyláza. (C) t-SNE scRNA-seq ascitu (šedě) a nádoru (červeně; n = 3 pacienti). (D) Exprese NNMT v různých buněčných populacích identifikovaných pomocí scRNA-seq. (E) Exprese NNMT a AOX1 v SK-OV-3, lidských embryonálních ledvinách (HEK) 293T, T buňkách a T buňkách ošetřených MNA. Je znázorněna složená exprese v porovnání s SK-OV-3. Je znázorněn vzorec exprese pomocí SEM (n = 6 zdravých dárců). Hodnoty Ct vyšší než 35 jsou považovány za nedetekovatelné (UD). (F) Exprese SLC22A1 a SLC22A2 v SK-OV-3, HEK293T, T buňkách a T buňkách ošetřených 8mM MNA. Je znázorněna složená exprese v porovnání s SK-OV-3. Je znázorněn expresní vzorec s SEM (n = 6 zdravých dárců). Hodnoty Ct vyšší než 35 jsou považovány za nedetekovatelné (UD). (G) Obsah MNA v aktivovaných zdravých dárcovských T buňkách po 72 hodinách inkubace s MNA. Je znázorněn expresní vzorec s SEM (n = 4 zdraví dárci).
MNA se produkuje přenosem methylové skupiny z S-adenosyl-1-methioninu (SAM) na nikotinamid (NA) pomocí nikotinamid-N-methyltransferázy (NNMT; obrázek 3B). NNMT je nadměrně exprimován v řadě lidských rakovin a je spojen s proliferací, invazí a metastázami (25-27). Abychom lépe pochopili zdroj MNA v T buňkách u TME, použili jsme scRNA-seq k charakterizaci exprese NNMT napříč typy buněk v ascitu a nádorech tří pacientů s HGSC (tabulka S5). Analýza přibližně 6 500 buněk ukázala, že v prostředí ascitu a nádoru byla exprese NNMT omezena na předpokládané populace fibroblastů a nádorových buněk (obrázek 3, C a D). Za zmínku stojí, že v žádné populaci, která exprimuje PTPRC (CD45+), neexistuje žádná zjevná exprese NNMT (obrázek 3D a obrázek S5A), což naznačuje, že MNA detekovaná ve spektru metabolitů byla zavedena do T buněk. Exprese aldehydoxidázy 1 (AOX1) přeměňuje MNA na 1-methyl-2-pyridon-5-karboxamid (2-PYR) nebo 1-methyl-4-pyridon-5-karboxamid (4-PYR); obrázek 3B) je také omezena na populaci fibroblastů exprimujících COL1A1 (obrázek S5A), což společně naznačuje, že T buňkám chybí schopnost konvenčního metabolismu MNA. Expresní vzorec těchto genů souvisejících s MNA byl ověřen pomocí druhého nezávislého souboru buněčných dat z ascitu pacientů s HGSC (obrázek S5B; n = 6) (16). Kromě toho kvantitativní analýza polymerázové řetězové reakce (qPCR) zdravých dárcovských T buněk léčených MNA ukázala, že ve srovnání s kontrolními ovariálními nádorovými buňkami SK-OV-3 nebyly NNMT ani AOX1 téměř exprimovány (obrázek 3E). Tyto neočekávané výsledky naznačují, že MNA může být vylučována z fibroblastů nebo nádorů do sousedních T buněk při TME.
Ačkoli mezi kandidáty patří rodina organických kationtových transportérů 1 až 3 (OCT1, OCT2 a OCT3) kódovaných rodinou rozpustných nosičů 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 a SLC22A3), potenciální transportéry MNA stále nejsou definovány (28). QPCR mRNA ze zdravých dárcovských T buněk vykazovala nízké hladiny exprese SLC22A1, ale nedetekovatelné hladiny SLC22A2, což potvrdilo, že to bylo dříve popsáno v literatuře (obrázek 3F) (29). Naproti tomu buněčná linie ovariálního nádoru SK-OV-3 exprimovala vysoké hladiny obou transportérů (obrázek 3F).
Aby se otestovala možnost, že T buňky mají schopnost absorbovat cizí MNA, byly zdravé dárcovské T buňky kultivovány po dobu 72 hodin v přítomnosti různých koncentrací MNA. V nepřítomnosti exogenní MNA nelze buněčný obsah MNA detekovat (obrázek 3G). Aktivované T buňky ošetřené exogenní MNA však vykazovaly na dávce závislé zvýšení obsahu MNA v buňkách, a to až do 6 mM MNA (obrázek 3G). Tento výsledek naznačuje, že i přes nízkou úroveň exprese transportérů a absenci hlavního enzymu zodpovědného za intracelulární metabolismus MNA může TIL stále přijímat MNA.
Spektrum metabolitů v T buňkách pacientů a experimenty s absorpcí MNA in vitro zvyšují možnost, že fibroblasty asociované s rakovinou (CAF) vylučují MNA a nádorové buňky mohou regulovat fenotyp a funkci TIL. Pro stanovení účinku MNA na T buňky byly zdravé dárcovské T buňky aktivovány in vitro v přítomnosti nebo nepřítomnosti MNA a byla vyhodnocena jejich proliferace a produkce cytokinů. Po 7 dnech přidání MNA v nejvyšší dávce byl počet zdvojení populace mírně snížen, zatímco energie byla zachována při všech dávkách (obrázek 4A). Kromě toho léčba exogenním MNA vedla ke zvýšení podílu CD4+ a CD8+ T buněk exprimujících faktor nekrózy nádorů-α (TNFα; obrázek 4B). Naproti tomu intracelulární produkce IFN-γ byla významně snížena u CD4+ T buněk, ale ne u CD8+ T buněk, a nedošlo k žádné významné změně interleukinu 2 (IL-2; obrázek 4, C a D). Proto enzymoimunoanalýza (ELISA) supernatantu z těchto kultur T buněk ošetřených MNA ukázala významný nárůst TNFα, pokles IFN-γ a žádnou změnu IL-2 (obrázek 4, E až G). Pokles IFN-γ naznačuje, že MNA může hrát roli v inhibici protinádorové aktivity T buněk. Aby se simuloval účinek MNA na cytotoxicitu zprostředkovanou T buňkami, produkují se chimérické buňky antigenního receptoru T (FRα-CAR-T) cílící na folátový receptor α a buňky CAR-T (GFP) regulované zeleným fluorescenčním proteinem (GFP)-CAR-T) zdravými mononukleárními buňkami periferní krve (PBMC) dárců. Buňky CAR-T byly kultivovány po dobu 24 hodin v přítomnosti MNA a poté kokultivovány s lidskými nádorovými buňkami vaječníků SK-OV-3 exprimujícími folátový receptor α v poměru efektor k cíli 10:1. Léčba MNA vedla k významnému snížení zabíjecí aktivity buněk FRα-CAR-T, což bylo podobné jako u buněk FRα-CAR-T ošetřených adenosinem (obrázek 4H).
(A) Celkový počet životaschopných buněk a zdvojení populace (PD) přímo z kultury 7. den. Sloupcový graf představuje průměr + SEM šesti zdravých dárců. Představuje data z alespoň n = 3 nezávislých experimentů. (B až D) CD3/CD28 a IL-2 byly použity k aktivaci T buněk v jejich příslušných koncentracích MNA po dobu 7 dnů. Před analýzou byly buňky stimulovány PMA/ionomycinem s GolgiStopem po dobu 4 hodin. Exprese TNFα (B) v T buňkách. Příklad obrázku (vlevo) a tabulková data (vpravo) exprese TNFα v živých buňkách. Exprese IFN-γ (C) a IL-2 (D) v T buňkách. Exprese cytokinů byla měřena průtokovou cytometrií. Sloupcový graf představuje průměr (n = 6 zdravých dárců) + SEM. Pro stanovení hodnoty P použijte jednosměrnou analýzu rozptylu a opakovaná měření (*P<0,05 a **P<0,01). Představuje data z alespoň n = 3 nezávislých experimentů. (E až G) CD3/CD28 a IL-2 byly použity k aktivaci T buněk v jejich příslušných koncentracích MNA po dobu 7 dnů. Médium bylo odebráno před a po 4 hodinách stimulace PMA/ionomycinem. Koncentrace TNFα (E), IFN-γ (F) a IL-2 (G) byly měřeny pomocí ELISA. Sloupcový graf představuje průměr (n = 5 zdravých dárců) + SEM. Hodnota P byla stanovena pomocí jednocestné analýzy rozptylu a opakovaných měření (*P<0,05). Tečkovaná čára označuje detekční limit. (H) Test lýzy buněk. Buňky FRα-CAR-T nebo GFP-CAR-T byly adjustovány adenosinem (250 μM) nebo MNA (10 mM) po dobu 24 hodin nebo ponechány neošetřené (Ctrl). Bylo měřeno procento usmrcených buněk SK-OV-3. Hodnota P byla stanovena Welchovým t-testem (*P<0,5 a **P<0,01).
Abychom získali mechanistické pochopení regulace exprese TNFα závislé na MNA, byly vyhodnoceny změny v mRNA TNFα u T buněk ošetřených MNA (obrázek 5A). Zdravé dárcovské T buňky ošetřené MNA vykazovaly dvojnásobné zvýšení hladin transkripce TNFα, což naznačuje, že MNA je závislá na transkripční regulaci TNFα. Pro zkoumání tohoto možného regulačního mechanismu byly v reakci na vazbu MNA na proximální promotor TNFα vyhodnoceny dva známé transkripční faktory, které regulují TNFα, a to aktivovaný jaderný faktor T buněk (NFAT) a specifický protein 1 (Sp1) (30). Promotor TNFα obsahuje 6 identifikovaných vazebných míst NFAT a 2 vazebná místa Sp1, která se v jednom místě překrývají [-55 párů bází (bp) od 5' čepičky] (30). Imunoprecipitace chromatinu (ChIP) ukázala, že po ošetření MNA se vazba Sp1 na promotor TNFα zvýšila trojnásobně. Inkorporace NFAT se také zvýšila a blížila se významu (obrázek 5B). Tato data naznačují, že MNA reguluje expresi TNFα prostřednictvím transkripce Sp1 a v menší míře expresi NFAT.
(A) V porovnání s T buňkami kultivovanými bez MNA je znázorněna násobná změna exprese TNFα v T buňkách ošetřených MNA. Je znázorněn vzorec exprese pomocí SEM (n = 5 zdravých dárců). Představuje data z alespoň n = 3 nezávislých experimentů. (B) Promotor TNFα T buněk ošetřených s 8 mM MNA nebo bez něj po NFAT a Sp1 byly kombinovány se stimulací (Ctrl) a PMA/ionomycinem po dobu 4 hodin. Imunoglobulin G (IgG) a H3 byly použity jako negativní a pozitivní kontroly pro imunoprecipitaci. Kvantifikace ChIP ukázala, že vazba Sp1 a NFAT na promotor TNFα v buňkách ošetřených MNA se několikanásobně zvýšila ve srovnání s kontrolou. Představuje data z alespoň n = 3 nezávislých experimentů. Hodnota P stanovena vícenásobnými t-testy (*** P <0,01). (C) Ve srovnání s ascitem HGSC vykazovaly T buňky (necytotoxické) zvýšenou expresi TNF v nádoru. Barvy představují různé pacienty. Zobrazené buňky byly náhodně vzorkovány do 300 a roztřeseny, aby se omezilo přečerpávání (** Padj = 0,0076). (D) Navrhovaný model MNA pro rakovinu vaječníků. MNA je produkována v nádorových buňkách a fibroblastech v TME a je vychytávána T buňkami. MNA zvyšuje vazbu Sp1 na promotor TNFα, což vede ke zvýšené transkripci TNFα a produkci cytokinů TNFα. MNA také způsobuje snížení IFN-γ. Inhibice funkce T buněk vede ke snížené schopnosti ničení a urychlenému růstu nádoru.
Podle zpráv má TNFα přední i zadní dependentní protinádorové a protinádorové účinky, ale má dobře známou roli v podpoře růstu a metastázování rakoviny vaječníků (31-33). Podle zpráv je koncentrace TNFα v ascitu a nádorových tkáních u pacientek s rakovinou vaječníků vyšší než v benigních tkáních (34-36). Co se týče mechanismu, TNFα může regulovat aktivaci, funkci a proliferaci bílých krvinek a měnit fenotyp rakovinných buněk (37, 38). V souladu s těmito zjištěními analýza diferenciální genové exprese ukázala, že TNF byl významně zvýšen v T buňkách v nádorových tkáních ve srovnání s ascitem (obrázek 5C). Zvýšení exprese TNF bylo patrné pouze v populacích T buněk s necytotoxickým fenotypem (obrázek S5A). Stručně řečeno, tato data podporují názor, že MNA má dvojí imunosupresivní a nádor podporující účinky u HGSC.
Fluorescenční značení založené na průtokové cytometrii se stalo hlavní metodou pro studium metabolismu TIL. Tyto studie ukázaly, že ve srovnání s periferními krevními lymfocyty nebo T buňkami ze sekundárních lymfoidních orgánů mají myší a lidské TIL vyšší tendenci k absorpci glukózy (4, 39) a postupnou ztrátu mitochondriální funkce (19, 40). Ačkoli jsme v této studii pozorovali podobné výsledky, klíčovým vývojem je porovnání metabolismu nádorových buněk a TIL ze stejné resekované nádorové tkáně. V souladu s některými z těchto předchozích zpráv mají nádorové (CD45-EpCAM+) buňky z ascitu a nádorů vyšší absorpci glukózy než CD8+ a CD4+ T buňky, což podporuje teorii, že vysokou absorpci glukózy nádorovými buňkami lze srovnávat s T buňkami. Koncept kompetice T buněk. TME. Mitochondriální aktivita nádorových buněk je však vyšší než u CD8+ T buněk, ale mitochondriální aktivita je podobná aktivitě CD4+ T buněk. Tyto výsledky posilují nově vznikající téma, že oxidativní metabolismus je pro nádorové buňky důležitý (41, 42). Také naznačují, že CD8+ T buňky mohou být náchylnější k oxidační dysfunkci než CD4+ T buňky, nebo že CD4+ T buňky mohou k udržení mitochondriální aktivity využívat jiné zdroje uhlíku než glukózu (43, 44). Je třeba poznamenat, že jsme v ascitu nepozorovali žádný rozdíl v příjmu glukózy ani v mitochondriální aktivitě mezi efektory CD4+ T, efektorovými paměťovými T buňkami a centrálními paměťovými T buňkami. Podobně ani stav diferenciace CD8+ T buněk v nádorech nemá nic společného se změnami v příjmu glukózy, což zdůrazňuje významný rozdíl mezi T buňkami kultivovanými in vitro a lidskou TIL in vivo (22). Tato pozorování byla také potvrzena použitím nezaujaté automatické alokace buněčné populace, která dále odhalila, že buňky CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ s vyšším příjmem glukózy a mitochondriální aktivitou než nádorové buňky jsou převládající, ale mají metabolicky aktivní buněčnou populaci. Tato populace může představovat předpokládanou subpopulaci myeloidních supresorových buněk nebo plazmacytoidních dendritických buněk identifikovaných v analýze scRNA-seq. Ačkoli oba tyto faktory byly hlášeny u lidských ovariálních nádorů [45], stále je třeba je dále popsat. Další výzkum se zaměřuje na popis této myeloidní subpopulace.
Ačkoli metody založené na průtokové cytometrii mohou objasnit obecné rozdíly v metabolismu glukózy a oxidativním metabolismu mezi typy buněk, přesné metabolity produkované glukózou nebo jinými zdroji uhlíku pro mitochondriální metabolismus v TME dosud nebyly stanoveny. Přiřazení přítomnosti nebo nepřítomnosti metabolitů k dané podskupině TIL vyžaduje purifikaci buněčné populace z vyříznuté tkáně. Naše metoda obohacení buněk v kombinaci s hmotnostní spektrometrií proto může poskytnout vhled do metabolitů, které jsou diferencovaně obohaceny v T buňkách a populacích nádorových buněk ve shodných vzorcích pacientů. Ačkoli má tato metoda výhody oproti třídění buněk aktivovaným fluorescencí, určité knihovny metabolitů mohou být ovlivněny v důsledku inherentní stability a/nebo rychlé rychlosti obměny (22). Naše metoda však dokázala identifikovat dva rozpoznávané imunosupresivní metabolity, adenosin a kynurenin, protože se mezi typy vzorků značně liší.
Naše metabonomická analýza nádorů a podtypů TIL poskytuje více informací o roli metabolitů v ovariálním TME. Zaprvé, pomocí průtokové cytometrie jsme zjistili, že mezi nádory a CD4+ T buňkami nebyl žádný rozdíl v mitochondriální aktivitě. Analýza LC-MS/MS však odhalila významné změny v množství metabolitů mezi těmito populacemi, což naznačuje, že závěry o metabolismu TIL a jeho celkové metabolické aktivitě vyžadují pečlivou interpretaci. Zadruhé, MNA je metabolit s největším rozdílem mezi CD45 buňkami a T buňkami v ascitu, nikoli v nádorech. Kompartmentalizace a umístění nádoru proto mohou mít různé účinky na metabolismus TIL, což zdůrazňuje možnou heterogenitu v daném mikroprostředí. Zatřetí, exprese enzymu NNMT produkujícího MNA je omezena hlavně na CAF, což je v menší míře nádorové buňky, ale detekovatelné hladiny MNA jsou pozorovány v T buňkách odvozených z nádorů. Nadměrná exprese NNMT v ovariálním CAF má známý účinek podporující rakovinu, částečně kvůli podpoře metabolismu CAF, invazi nádoru a metastázám (27). Ačkoli je celková hladina TIL střední, exprese NNMT v CAF úzce souvisí s mezenchymálním podtypem Cancer Genome Atlas (TCGA), který je spojen se špatnou prognózou (27, 46, 47). Exprese enzymu AOX1 zodpovědného za degradaci MNA je také omezena na populaci CAF, což naznačuje, že T buňky nemají schopnost metabolizovat MNA. Tyto výsledky podporují myšlenku, že ačkoli je k ověření tohoto zjištění zapotřebí dalšího výzkumu, vysoké hladiny MNA v T buňkách mohou naznačovat přítomnost imunosupresivního mikroprostředí CAF.
Vzhledem k nízké úrovni exprese transportérů MNA a nedetekovatelným hladinám klíčových proteinů zapojených do metabolismu MNA je přítomnost MNA v T buňkách neočekávaná. Ani NNMT, ani AOX1 nebyly detekovány pomocí scRNA-seq analýzy a cílené qPCR u dvou nezávislých kohort. Tyto výsledky naznačují, že MNA není syntetizována T buňkami, ale absorbována z okolního TME. Experimenty in vitro ukazují, že T buňky mají tendenci akumulovat exogenní MNA.
Naše studie in vitro ukázaly, že exogenní MNA indukuje expresi TNFα v T buňkách a zvyšuje vazbu Sp1 na promotor TNFα. Ačkoli má TNFα jak protinádorové, tak i protinádorové funkce, u rakoviny vaječníků může TNFα podporovat růst rakoviny vaječníků (31-33). Neutralizace TNFα v kultuře nádorových buněk vaječníků nebo eliminace signálu TNFα v myších modelech může zlepšit produkci zánětlivých cytokinů zprostředkovanou TNFα a inhibovat růst nádoru (32, 35). V tomto případě tedy může MNA odvozená od TME působit jako prozánětlivý metabolit prostřednictvím mechanismu závislého na TNFα prostřednictvím autokrinní smyčky, čímž podporuje výskyt a šíření rakoviny vaječníků (31). Na základě této možnosti je blokáda TNFα studována jako potenciální terapeutické činidlo pro rakovinu vaječníků (37, 48, 49). MNA navíc zhoršuje cytotoxicitu buněk CAR-T vůči nádorovým buňkám vaječníků, což poskytuje další důkazy o imunosupresi zprostředkované MNA. Tyto výsledky společně naznačují model, ve kterém nádory a buňky CAF vylučují MNA do extracelulárního TME. Prostřednictvím (i) stimulace růstu rakoviny vaječníků indukované TNF a (ii) inhibice cytotoxické aktivity T buněk indukované MNA může mít toto dvojí účinek na nádor (obrázek 5D).
Závěrem lze říci, že tato studie odhalila obrovské imunometabolomické rozdíly mezi nádorovými a ascitovými buňkami u pacientů s HGSC, a to pomocí kombinace rychlého buněčného obohacení, sekvenování jednotlivých buněk a metabolického profilování. Tato komplexní analýza ukázala, že mezi T buňkami existují rozdíly v příjmu glukózy a mitochondriální aktivitě, a identifikovala MNA jako nebuněčný autonomní imunitní regulační metabolit. Tato data mají vliv na to, jak TME ovlivňuje metabolismus T buněk u lidských rakovin. Ačkoli byla hlášena přímá konkurence o živiny mezi T buňkami a rakovinnými buňkami, metabolity mohou také působit jako nepřímé regulátory, které podporují progresi nádoru a případně potlačují endogenní imunitní odpovědi. Další popis funkční role těchto regulačních metabolitů by mohl otevřít alternativní strategie pro posílení protinádorové imunitní odpovědi.
Vzorky pacientů a klinická data byly získány prostřednictvím úložiště tkání nádorů rakoviny prsu certifikovaného Kanadskou sítí úložišť tkání. V souladu s protokolem schváleným etickou komisí pro výzkum rakoviny prsu a Univerzitou Britské Kolumbie (H07-00463) získaly všechny vzorky a klinická data pacientů informovaný písemný souhlas nebo formálně svůj souhlas zřekly. Vzorky jsou uloženy v certifikované BioBank (BRC-00290). Podrobné charakteristiky pacientů jsou uvedeny v tabulkách S1 a S5. Pro kryokonzervaci se skalpelem mechanicky rozloží vzorek nádoru pacienta a poté se protlačí přes 100mikronový filtr za účelem získání suspenze jednotlivých buněk. Ascites pacienta byl centrifugován při 1500 ot/min po dobu 10 minut při 4 °C, aby se buňky peletovaly a odstranil supernatant. Buňky získané z nádoru a ascitu byly kryokonzervovány v 50% tepelně inaktivovaném lidském séru AB (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) a 10% dimethylsulfoxidu. Tyto konzervované suspenze jednotlivých buněk byly rozmrazeny a použity pro metabolomiku a stanovení metabolitů popsané níže.
Kompletní médium se skládá z 0,22 μm filtrovaného 50:50 doplněného RPMI 1640:AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM L-glutaminu (Thermo Fisher Scientific) doplněného 10% tepelně inaktivovaným lidským sérem AB (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM L-glutaminu (Thermo Fisher Scientific), 1 x roztoku penicilinu a streptomycinu (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) a 50 μMB-merkaptoethanolu. AimV (Invitrogen) je doplněno 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) a 2 mM L-glutaminu (Thermo Fisher Scientific). Barvicí pufr pro průtokový cytometr se skládal z 0,22 μm filtrovaného fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS; Invitrogen) doplněného 3% tepelně inaktivovaným lidským sérem AB (Sigma). Pufr pro obohacení buněk se skládá z 0,22 μm filtrovaného PBS a doplněného 0,5 % tepelně inaktivovaného lidského séra AB (Sigma-Aldrich).
V kompletním médiu o teplotě 37 °C byly buňky obarveny 10 nM MT DR a 100 μM 2-NBDG po dobu 30 minut. Následně byly buňky obarveny barvivem pro viabilitu eF506 při teplotě 4 °C po dobu 15 minut. Buňky resuspendujte v FC Block (eBioscience) a Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), zřeďte v barvicím pufru pro průtokovou cytometrii (podle pokynů výrobce) a inkubujte 10 minut při pokojové teplotě. Buňky obarvte sadou protilátek (tabulka S2) v barvicím pufru pro průtokovou cytometrii při teplotě 4 °C po dobu 20 minut. Před analýzou buňky resuspendujte v barvicím pufru pro průtokovou cytometrii (Cytek Aurora; konfigurace 3L-16V-14B-8R). K analýze dat o počtu buněk použijte SpectroFlo a FlowJo V10 a k vytvoření dat použijte GraphPad Prism 8. Medián intenzity fluorescence (MFI) 2-NBDG a MT DR byl logaritmicky normalizován a poté byl pro statistickou analýzu použit párový t-test, aby se zohlednili shodní pacienti. Z analýzy odstraňte všechny populace s méně než 40 událostmi; před provedením statistické analýzy a vizualizace dat zadejte pro všechny záporné hodnoty hodnotu MFI 1.
Abychom doplnili strategii manuálního hradlování výše uvedeného procesního panelu, použili jsme plnou anotaci pomocí stromu omezení tvarů (FAUST) (21) k automatickému přiřazení buněk k populaci po eliminaci mrtvých buněk ve FlowJo. Výstup spravujeme ručně tak, abychom sloučili populace, které se zdají být nesprávně přiděleny (kombinace PD1+ s PD1-nádorovými buňkami), a zachované populace. Každý vzorek obsahuje v průměru více než 2 % buněk, celkem tedy 11 populací.
K oddělení PBMC od produktů separace leukocytů byla použita centrifugace s gradientní hustotou Ficollu (STEMCELL Technologies). CD8+ T buňky byly izolovány z PBMC pomocí CD8 MicroBeads (Miltenyi) a expandovány v kompletním médiu pomocí TransAct (Miltenyi) po dobu 2 týdnů podle pokynů výrobce. Buňky byly ponechány 5 dní v kompletním médiu obsahujícím IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) a poté restimulovány TransAct. 7. den byly podle pokynů výrobce k obohacení buněk ve třech po sobě jdoucích kolech použity lidské CD45 MicroBeads (Miltenyi). Buňky byly rozděleny do alikvotních porcí pro analýzu průtokovou cytometrií (jak je popsáno výše) a jeden milion buněk byl třikrát alikvotně rozdělen pro analýzu LC-MS/MS. Vzorky byly zpracovány pomocí LC-MS/MS, jak je popsáno níže. Hodnotu chybějícího metabolitu jsme odhadli s iontovým číslem 1 000. Každý vzorek je před analýzou normalizován podle celkového počtu iontů (TIC), logaritmicky převeden a automaticky normalizován v MetaboAnalystR.
Suspenze jednotlivých buněk od každého pacienta byla rozmrazena a přefiltrována přes 40μm filtr do kompletního média (jak je popsáno výše). Podle protokolu výrobce byly k obohacení vzorků o buňky CD8+, CD4+ a CD45- (na ledu) použity tři po sobě jdoucí kola pozitivní selekce magnetickou separací kuliček s použitím MicroBeads (Miltenyi). Stručně řečeno, buňky byly resuspendovány v pufru pro obohacení buněk (jak je popsáno výše) a spočítány. Buňky byly inkubovány s lidskými kuličkami CD8, lidskými kuličkami CD4 nebo lidskými kuličkami CD45 (Miltenyi) při 4 °C po dobu 15 minut a poté promyty pufrem pro obohacení buněk. Vzorek byl propuštěn přes LS kolonu (Miltenyi) a byly shromážděny pozitivní a negativní frakce. Aby se zkrátila doba trvání a maximalizoval krok regenerace buněk, frakce CD8 se poté použije pro druhé kolo obohacení CD4+ a frakce CD4 se použije pro následné obohacení CD45. Roztok se uchovává na ledu po celou dobu separačního procesu.
Pro přípravu vzorků pro analýzu metabolitů byly buňky jednou promyty ledově studeným solným roztokem a ke každému vzorku byl přidán 1 ml 80% methanolu, poté byly vzorky vortexovány a rychle zmrazeny v tekutém dusíku. Vzorky byly podrobeny třem cyklům zmrazování a rozmrazování a centrifugovány při 14 000 ot/min po dobu 15 minut při 4 °C. Supernatant obsahující metabolity byl odpařen do sucha. Metabolity byly znovu rozpuštěny v 50 μl 0,03% kyseliny mravenčí, vortexovány pro promíchání a poté centrifugovány za účelem odstranění nečistot.
Metabolity extrahujte výše popsaným způsobem. Supernatant přeneste do lahve pro vysoce účinnou kapalinovou chromatografii pro metabolomický výzkum. Pro ošetření každého vzorku podobným počtem buněk použijte protokol náhodného zpracování, aby se zabránilo dávkovým efektům. Provedli jsme kvalitativní hodnocení globálních metabolitů, které bylo dříve publikováno na hmotnostním spektrometru AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole (50). Chromatografická analýza a integrace plochy píku byly provedeny pomocí softwaru MultiQuant verze 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Pro odhad hodnoty chybějícího metabolitu byl použit počet iontů 1000 a TIC každého vzorku byl použit pro výpočet normalizované plochy píku každého detekovaného metabolitu, aby se korigovaly změny zavedené instrumentální analýzou při zpracování vzorku. Po normalizaci TIC se pro logaritmickou konverzi a automatické škálování normativní křivky použije MetaboAnalystR(51) (výchozí parametr). K provedení explorativní analýzy rozdílů v metabolomu mezi typy vzorků jsme použili PCA s balíčkem vegan R a k analýze pacientů jsme použili analýzu parciální redundance. Pro seskupení euklidovské vzdálenosti mezi vzorky jsme použili Wardovu metodu k vytvoření dendrogramu tepelné mapy. Pro identifikaci diferencovaně hojných metabolitů v celém buněčném typu a mikroprostředí jsme použili limma (52) na standardizovaném množství metabolitů. Pro zjednodušení vysvětlení používáme parametr skupinového průměru k určení modelu a jako každou skupinu uvažujeme typy buněk v mikroprostředí (n = 6 skupin); pro test významnosti jsme provedli tři opakovaná měření pro každý metabolit. Abychom se vyhnuli falešné replikaci, byl pacient zahrnut do návrhu limma jako překážka. Abychom ověřili rozdíly v metabolitech mezi různými pacienty, upravili jsme model limmy zahrnující pacienty fixním způsobem. Uvádíme významnost předem specifikovaného kontrastu mezi typem buněk a mikroprostředím Padj < 0,05 (Benjamini-Hochbergova korekce).
Po obohacení o vigor pomocí soupravy Miltenyi Dead Cell Removal Kit (životaschopnost >80 %) bylo provedeno sekvenování transkriptomu jednotlivých buněk zmrazeného ascitu a vzorků nádorů s použitím protokolu 10x 5′ genové exprese. Analyzováno bylo pět případů se shodnými nádory a ascitem, ačkoli nízká životaschopnost jednoho vzorku nádoru zabránila jeho zahrnutí. Abychom dosáhli vícenásobného výběru pacientů, zkombinovali jsme vzorky každého pacienta v drahách 10x chromového kontroléru a analyzovali jsme ascites a nádorová místa samostatně. Po sekvenování [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; průměrně 73 488 a 41 378 přečtení na buňku pro nádor a ascites]], použili jsme CellSNP a Vireo (53) (na základě CellSNP jako Běžnému lidskému SNP (VCF) poskytovanému GRCh38 je přiřazena identita dárce. Používáme SNPRelate k odvození nejbližší identity (IBS) genotypového statusu pacienta (IBS), s vyloučením nepřiřazených buněk a buněk identifikovaných jako duplexy a odpovídajících dárců mezi vzorky ascitu a nádoru (54). Na základě tohoto úkolu jsme pro následnou analýzu ponechali tři případy s hojným zastoupením buněk v nádoru a ascitu. Po provedení kroku hmotnostní filtrace v balení BioConductor scater (55) a scran (56) jsme získali 6975 buněk (2792 a 4183 buněk z nádoru a ascitu) pro analýzu. Používáme igraphovo (57) Louvainovo shlukování sdílené sítě nejbližších sousedů (SNN) na základě Jaccardovy vzdálenosti od shlukovacích buněk pomocí exprese. Klastry byly manuálně anotovány k předpokládaným typům buněk na základě exprese markerových genů a vizualizovány pomocí t-SNE. Cytotoxické T buňky jsou definovány expresí CD8A a GZMA, s vyloučením subklastrů s nízkou expresí ribozomálních proteinů. Využili jsme publikovaná data Izara a kol. (16), včetně jejich vložení t-SNE, které může řídit překrytí exprese mezi markery imunitních buněk a expresí NNMT.
PBMC byly odděleny od produktů separace leukocytů (STEMCELL Technologies) centrifugací v gradientní hustotě Ficoll. Buňky CD3+ byly izolovány z PBMC za použití CD3 kuliček (Miltenyi). V přítomnosti nebo nepřítomnosti MNA byly CD3+ buňky aktivovány navázaným CD3 (5 μg/ml), rozpustným CD28 (3 μg/ml) a IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Poslední den expanze byla průtokovou cytometrií vyhodnocena životaschopnost (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) a proliferace (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific). Vyhodnoťte efektorovou funkci stimulací buněk pomocí PMA (20 ng/ml) a ionomycinu (1 μg/ml) pomocí GolgiStopu po dobu 4 hodin a monitorujte CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) a TNFα-fluorescein isothiokyanátu (FITC) (MAb11, BD). Stimulujte buňky qPCR a ChIP pomocí PMA (20 ng/ml) a ionomycinu (1 μg/ml) po dobu 4 hodin. Supernatant ELISA byl odebrán před a po stimulaci PMA (20 ng/ml) a ionomycinem (1 μg/ml) po dobu 4 hodin.
Pro izolaci RNA pomocí sady RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) postupujte podle protokolu výrobce. K homogenizaci vzorku použijte QIAshredder (QIAGEN). Pro syntézu komplementární DNA (cDNA) použijte sadu High-Capacity RNA to cDNA Kit (Thermo Fisher Scientific). Pro kvantifikaci genové exprese (podle protokolu výrobce) použijte TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) s následujícími sondami: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyd-3-fosfát z vodíku (GAPDH)] a Hs01010726_m1 (SLC22A2). Vzorky byly analyzovány na systému StepOnePlus real-time PCR (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) v rychlé optické 96jamkové reakční destičce MicroAmp (Applied Biosystems) s optickým filmem MicroAmp. Jakákoli hodnota Ct přesahující 35 je považována za hodnotu nad detekčním prahem a je označena jako nedetekovatelná.
Proveďte ChIP, jak bylo popsáno dříve (58). Stručně řečeno, buňky byly ošetřeny formaldehydem (konečná koncentrace 1,42 %) a inkubovány při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Použijte obohacený bobtnací pufr (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl a 0,1 % NP-40) na ledu po dobu 10 minut, poté resuspendujte v imunoprecipitačním pufru, jak je popsáno (58). Vzorek byl poté sonikován v následujících cyklech: 10 cyklů (20 1sekundových pulzů) a statický čas 40 sekund. Inkubujte protilátky imunoglobulinu G (Cell Signaling Technology; 1 μl), histonu H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) a SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) kvality ChIP se vzorkem při 4 °C a třepejte přes noc. Inkubujte kuličky proteinu A (Thermo Fisher Scientific) se vzorkem při 4 °C za jemného třepání po dobu 1 hodiny, poté použijte chelexové kuličky (Bio-Rad) k obohacení DNA a proteinázu K (Thermo Fisher) k digesci proteinu. Promotor TNFα byl detekován pomocí PCR: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; naopak GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produkt o 207 bp). Snímky byly vytvořeny softwarem Image Lab (Bio-Rad) a kvantifikovány pomocí softwaru ImageJ.
Supernatant buněčné kultury byl odebrán výše popsaným způsobem. Stanovení bylo provedeno podle postupů výrobce pro soupravu ELISA pro lidský TNFα (Invitrogen), soupravu ELISA pro lidský IL-2 (Invitrogen) a soupravu ELISA pro lidský IFN-γ (Abcam). Podle protokolu výrobce byl supernatant ředěn 1:100 pro detekci TNFα a IL-2 a 1:3 pro detekci IFN-γ. Pro měření absorbance při 450 nm byl použit čtečka EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer).
PBMC byly odděleny od produktů separace leukocytů (STEMCELL Technologies) centrifugací v gradientní hustotě Ficoll. Buňky CD3+ byly izolovány z PBMC pomocí CD3 kuliček (Miltenyi). V přítomnosti nebo nepřítomnosti MNA byly CD3+ buňky aktivovány vázaným CD3 (5 μg/ml), rozpustným CD28 (3 μg/ml) a IL-2 (300 U/ml; Proleukin) po dobu 3 dnů. Po 3 dnech byly buňky odebrány a promyty 0,9% fyziologickým roztokem a peleta byla rychle zmrazena. Počítání buněk bylo provedeno průtokovou cytometrií (Cytek Aurora; konfigurace 3L-16V-14B-8R) s použitím 123count eBeads.
Metabolity extrahujte dle výše popsaného postupu. Vysušený extrakt byl rekonstituován v koncentraci 4000 buněčných ekvivalentů/μl. Vzorek analyzujte chromatografií s reverzní fází (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) na koloně CORTECS T3 (2,1×150 mm, velikost částic 1,6 μm, velikost pórů 120 Å; #186008500, Waters). Polární hmotnostní spektrometr (6470, Agilent), ve kterém elektrosprejová ionizace probíhá v pozitivním módu. Mobilní fáze A je 0,1% kyselina mravenčí (v H2O), mobilní fáze B je 90% acetonitril, 0,1% kyselina mravenčí. Gradient LC je 0 až 2 minuty pro 100 % A, 2 až 7,1 minuty pro 99 % B a 7,1 až 8 minut pro 99 % B. Poté se kolona znovu ekvilibruje mobilní fází A při průtoku 0,6 ml/min po dobu 3 minut. Průtok je 0,4 ml/min a komora kolony se zahřeje na 50 °C. Pro stanovení retenčního času (RT) a transformace (RT = 0,882 minuty, transformace 1 = 137→94,1, transformace 2 = 137→92, konverze 3 = 137→78) se použije čistý chemický standard MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada). Pokud všechny tři přechody proběhnou ve správném retenčním čase, použije se přechod 1 pro kvantifikaci, aby se zajistila specificita. Standardní křivka MNA (Toronto Research Chemical Company) byla vytvořena šesti sériovými ředěními zásobního roztoku (1 mg/ml) za účelem získání standardů o koncentraci 0,1, 1,0, 10 a 100 ng/ml a 1,0 a 10 μg/ml kapaliny. Detekční limit je 1 ng/ml a lineární odezva je mezi 10 ng/ml a 10 μg/ml. Každá injekce dvou mikrolitrů vzorku a standardu se používá pro LC/MS analýzu a po každých osmi injekcích se provádí směsný vzorek pro kontrolu kvality, aby se zajistila stabilita analytické platformy. Odezvy MNA všech buněčných vzorků ošetřených MNA byly v lineárním rozsahu testu. Analýza dat byla provedena pomocí softwaru pro kvantitativní analýzu MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstrukt αFR-CAR druhé generace byl převzat od Song et al. (59). Stručně řečeno, konstrukt obsahuje následující: vedoucí sekvenci CD8a, lidský αFR-specifický variabilní fragment s jedním řetězcem, pantovou a transmembránovou oblast CD8a, intracelulární doménu CD27 a intracelulární doménu CD3z. Kompletní sekvence CAR byla syntetizována pomocí GenScript a poté klonována do lentivirového expresního vektoru druhé generace před expresní kazetou GFP použitou k vyhodnocení účinnosti transdukce.
Lentivirus se produkuje transfekcí buněk HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC)], kultivovaných v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu obsahujícím 10 % fetálního bovinního séra (FBS) a 1 % PenStrep a s použitím vektoru CAR-GFP. Balicí plazmidy (psPAX2 a pMD2.G, Addgene) využívají lipofekční amin (Sigma-Aldrich). Supernatant obsahující virus byl odebrán 48 a 72 hodin po transfekci, filtrován a zakoncentrován ultracentrifugací. Koncentrovaný virový supernatant se skladuje při teplotě -80 °C až do transdukce.
PBMC se oddělují od separačních produktů leukocytů zdravých dárců (STEMCELL Technologies) centrifugací s gradientní hustotou Ficoll. K izolaci CD8+ buněk z PBMC se používají pozitivní selekční CD8 mikrokuličky (Miltenyi). T buňky se stimulují pomocí TransAct (Miltenyi) a v médiu TexMACS [Miltenyi; doplněném 3% tepelně inaktivovaným lidským sérem, 1% PenStrep a IL-2 (300 U/ml)]. Dvacet čtyři hodin po stimulaci byly T buňky transdukovány lentivirem (10 μl koncentrovaného virového supernatantu na 106 buněk). 1 až 3 dny po transdukci na Cytek Aurora (na FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+) se vyhodnotí exprese GFP buněk, aby se prokázala účinnost transdukce alespoň 30 %.
Buňky CAR-T byly kultivovány po dobu 24 hodin v médiu Immunocult (STEMCELL Technologies; doplněno 1% PenStrep) za následujících podmínek: neošetřené, ošetřené 250 μM adenosinem nebo 10 mM MNA. Po předběžné úpravě byly buňky CAR-T promyty PBS a smíchány s 20 000 buňkami SK-OV-3 [ATCC; v médiu McCoy 5A (Sigma-Aldrich) doplněném 10% FBS a 1% PenStrep v 10: Poměr efektoru k cíli 1 byl amplifikován v triplikátu v doplněném médiu Immunocult. Buňky SK-OV-3 a buňky SK-OV-3 lyzované digitalisovým saponinem (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) byly použity jako negativní a pozitivní kontroly. Po 24 hodinách kokultivace byl supernatant odebrán a laktátdehydrogenáza (LDH) byla měřena podle pokynů výrobce (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatant LDH byl zředěn v poměru 1:50 v LDH pufru. Procento usmrcení bylo měřeno pomocí následujícího vzorce: procento usmrcení = procento korekce / maximální míra usmrcení x 100 %, kde procento korekce = pouze kokultivace T buněk a maximální míra usmrcení = pozitivní kontrola - negativní kontrola.
Jak je popsáno v textu nebo materiálech a metodách, použijte pro statistickou analýzu GraphPad Prism 8, Microsoft Excel nebo R v3.6.0. Pokud je od stejného pacienta odebráno více vzorků (například ascites a nádor), použijeme párový t-test nebo pacienta zahrneme jako náhodný efekt do lineárního nebo zobecněného modelu podle potřeby. Pro metabolomickou analýzu se test důležitosti provádí trojmo.
Doplňující materiály k tomuto článku naleznete na adrese http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný za podmínek licence Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, která umožňuje použití, distribuci a reprodukci v jakémkoli médiu, pokud konečné použití není pro komerční zisk a předpokladem je, že původní dílo je správné. Odkaz.
Poznámka: O uvedení vaší e-mailové adresy vás žádáme pouze proto, aby osoba, kterou stránce doporučíte, věděla, že chcete, aby e-mail viděla, a že se nejedná o spam. Nebudeme zaznamenávat žádné e-mailové adresy.
Tato otázka se používá k ověření, zda jste návštěvník, a k zabránění automatickému odesílání spamu.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. J.Bellerph), Rardini Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA přispívá k imunosupresi T buněk a představuje potenciální cíl imunoterapie pro léčbu lidské rakoviny.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. J.Bellerph), Rardini Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA přispívá k imunosupresi T buněk a představuje potenciální cíl imunoterapie pro léčbu lidské rakoviny.
©2021 American Association for the Advancement of Science. všechna práva vyhrazena. AAAS je partnerem HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.